《病毒的传分析》PPT课件

病 毒 (virus)既 不 同 于 原 核 生 物 ， 也 不 居 于 真核 生 物 ， 因 为 它 们 没 有 一 般 的 细 胞 结 构 。 在 病毒 中 没 有 合 成 蛋 白 质 外 壳 所 必 需 的 核 糖 体 ， 所以 只 能 寄 生 在 动 物 、 植 物 和 细 菌 的 细 胞 内 繁 殖 ，它 能 使 宿 主 细 胞 的 机 构 转 而 合 成 它 自 身 新 的 病毒 物 质 。 尽 管 病 毒 能 形 成 晶 体 ， 自 身 不 能 进 行代 谢 等 ， 但 仍 将 病 毒 视 为 生 物 ， 因 为 它 们 能 够繁 殖 。 病 毒 离 开 宿 主 细 胞 虽 然 不 能 繁 殖 ， 但 仍 可 以存 活 。 根 据 宿 主 细 胞 的 不 同 而 将 病 毒 分 为 动 物病 毒 、 植 物 病 毒 和 细 菌 茵 病 毒 3种 。 细 菌 病 毒 又称 噬 茵 体 (phage)。 TailTail Fibers Base PlateHead/CapsidContractile Sheath根 据 宿 主 不 同 ， 可 以 分 为 ：动 物 病 毒植 物 病 毒细 菌 病 毒 -噬 菌 体（ bacteriophage, phage) SARS病 毒 颗 粒 电 镜 照 片 冠 状 病 毒 SARS病 毒 为 单 链 （ +） RNA病 毒 ， 全 长 29.725kb,具 有 11个 ORF（ Open Reading Frames） ， 分 别 编 码 ： 依 赖 于 RNA的 RNA聚 合 酶 、4种 结 构 蛋 白 （ S， E， M， N蛋 白 ） 、 5种 未 知 蛋 白 （ 图 5） 。 与 其 它宿 主 来 源 冠 状 病 毒 的 序 列 比 较 ， 进 化 分 析 ， 呈 一 单 独 的 分 支 。 病 毒在 增 殖 过 程 中 虽 没 有 逆 转 录 过 程 ， 但 RNA聚 合 酶 没 有 矫 正 机 制 ， 变异 较 大 ， SARS的 变 种 很 多 。 Phage T4研 究 最 为 广 泛 的 是 T噬 菌 体 ： Viruses - non-living particles -reproduce only within a hostVirus has protein coat + nucleic acid core- ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA - may be linear or circular moleculeViral genome integrated into host genome or separate病 毒 的 一 般 特 性 ： 病 毒 在 遗 传 学 研 究 中 的 优 越 性 :1、 繁 殖 快 , 世 代 短 。 病 毒 一 小 时 可 繁 殖 百 个 。2、 易 于 培 养 化 学 分 析 。 一 个 试 管 可 装 很 多 ; 易 于 获 得 大的 数 量 用 于 分 析 。 3、 遗 传 物 质 简 单 , 只 含 裸 露 DNA或 RNA。 适 用 基 因 结 构 和功 能 研 究 。4、 便 于 研 究 基 因 突 变 。 5、 便 于 研 究 基 因 的 作 用 。 6、 可 用 作 研 究 高 等 生 物 的 简 单 模 型 。 第 一 节 噬 菌 体 的 繁 殖 和 突 变 型一 、 1. 噬 菌 体 的 形 态（ 1） 20面 体 ， 无 尾PM-2（ 2） 20面 体 ， 有 尾SPO1（ 3） 丝 状M13 2. 几 种 噬 菌 体 的 染 色 体 特 点噬 菌 体 宿 主 核 酸 染 色 体 染 色 体 长 度（ m）T-even E.coli 双 链 DNA 线 环 60T7 E.coli 双 链 DNA 线 状 12 E.coli 双 链 DNA 线 状 16p22 沙 门 氏 菌 双 链 DNA 线 状 14x174 E.coli 单 链 DNA 环 状 1.8Q E.coli 单 链 DNA 线 状 1.4 3. T4 噬 菌体 的 结 构 二 、 噬 菌 体 的 生 活 周 期1. 噬 菌 体 吸 附 到 宿 主 细 胞 上2. 尾 丝 鞘 收 缩 ， 中 轴 刺 穿 宿 主 细 胞3. 头 部 的 DNA被 送 入 宿 主 细 胞4. 在 数 分 钟 内 ， 所 有 的 细 菌 核 酸 和 蛋 白 质合 成 都 被 抑 制 。 5. 噬 菌 体 大 分 子 合 成 ， 细 菌 的 核 酸 被 降 解 。 （ 1） 噬 菌 体 DNA复 制 。（ 2） 噬 菌 体 外 壳 蛋 白 合 成 。 (1) DNA被 包 到 头 部(2) 组 装 尾 部(3) 装 上 尾 丝6. 噬 菌 体 组 装 约 200个 噬 菌 体 导 致 细 菌 被 噬 菌 体 基 因编 码 的 溶 菌 酶 （ lysozyme)溶 解 。7. 宿 主 细 胞 破 裂 二 、 噬 菌 体 的 繁 殖 1951年 ， J. Lederberg 的 妻 子 Esther lederberg证 明 了 Lederberg和Tatum使 用 的 K12 E.coli中 含 有 原 噬 菌 体 ， 并 命名 为 。 10年 后 终 于 搞 清 了 溶源 化 的 实 质 。 二 、 噬 菌 体 的 繁 殖 1 烈 性 噬 菌 体（ virulent phages） 概 念 ： 感 染 细 菌 后 立即 在 菌 体 内 复 制 和 合成 蛋 白 质 外 壳 ， 重 新组 装 成 噬 菌 体 颗 粒 ，并 导 致 细 菌 细 胞 解 体 ，释 放 出 噬 菌 体 。 繁 殖 ： 吸 附 在 特 异 的受 体 上 酶 细 胞 壁形 成 微 孔 注 入 核 酸停 止 细 菌 的 代 谢 合 成 phage的 成 分 裂 解 ， 释 放 。 烈 性 噬 菌 体 溶 菌 2. 温 和 噬 菌 体 （ temperate phage）温 和 噬 菌 体 感 染 细 菌 后 ， 将 自 己 的 DNA整 合 到 细 菌的 染 色 体 DNA中 ， 形 成 原 噬 菌 体 （ prophage)， 这 一过 程 称 为 溶 源 化 （ lysogenization)。整 合 到 细 菌 染 色 体 的 噬 菌 体 DNA随 细 菌 的染 色 体 复 制 而 复 制 。经 过 若 干 世 代 后 才 从 寄 主 的 染 色 体 上 脱 离下 来 复 制 和 合 成 噬 菌 体 蛋 白 ， 组 装 成 新 的噬 菌 体 ， 并 导 致 菌 体 细 胞 裂 解 。 温 和 型 噬 菌 体（ temperate phage） ： 具 有 裂 解 和 溶 源两 种 途 径 ： (1)裂 解 途 径 ： 和烈 性 噬 菌 体 相 同 温 和 噬 菌 体 溶 源 (2)溶 源 途 径 ：溶 源 周 期 经 诱导 进 入 裂 解 周期 。 噬菌体的生活史 噬 菌 体 ： 噬 菌 体 侵 入 后 ， 细 菌 不 裂 解 ,附 在 E.coli染 色 体 上 的 gal和 bio位 点 间 的 att座 位 上 ,通 过 交 换整 合 到 细 菌 染 色 体 ， 并 能 阻 止 其 它 噬 菌 体 的 超数 感 染 。 P1噬 菌 体 ： 不 整 合 到 细 菌 的 染 色 体 上 ， 而 是 独 立 存在 于 细 胞 质 内 。 原 噬 菌 体 ： 整 合 到 宿 主 基 因 组 中 的 噬 菌 体 。 仅 少数 基 因 活 动 ， 表 达 出 阻 碍 物 关 闭 其 它 基 因 。 原 噬 菌 体经 诱 导 可 转 变 为 烈 性 噬 菌 体 裂 解 途 径 。 P1和 噬 菌 体 的 生 活 周 期 特 性 3、 溶 源 性 ： 有 些 细 菌 带 有 某 种 噬 菌 体 ， 但 并 不 立 即 导 致 溶菌 ， 这 种 现 象 称 为 溶 源 性 ， 具 有 溶 源 性 的 细 菌 称 为溶 源 性 细 菌 （ lysogenic bacteria） ， 受 温 和 噬 菌 体 感染 的 细 菌 ， 几 乎 都 成 为 溶 源 菌 。 在 细 菌 中 处 于 潜 伏状 态 的 噬 菌 体 称 为 原 噬 菌 体 （ prophage） 或 原 病 毒（ provirus） ， 带 有 原 噬 菌 体 的 细 菌 称 溶 源 性 细 菌（ lysogenic bacterium） ， 失 去 原 噬 菌 体 的 细 菌 和 为非 溶 源 性 细 菌 （ non lysogenic bacterium） 。溶 源 性 细 菌 有 两 个 重 要 特 性 : (1)免 疫 性 ： 原 噬 菌 体 产 生 一 种 阴 遏 蛋 白 ， 抑 制 同 类 噬 菌 体DNA的 复 制 ， 因 而 能 抵 抗 同 类 噬 菌 体 的 超 感 染 。 (2)可 诱 导 性 ： 自 发 万 分 之 一 ； 紫 外 线 或 丝 裂 霉 素 90%。 三 、 噬 菌 体 的 突 变 型 噬 菌 斑 （ plaque） ： 由 于 噬 菌 体 的 侵 染 ， 使 细 菌 细 胞裂 解 ， 有 菌 落 上 出 现 的 一 些 园 形 而 清 亮 的 小 洞 。 1、 快 速 溶 菌 突 变 体 (1)野 生 型 r+形 成 小 的 噬 菌 斑 1mm， 周 边 有 朦 胧 的 光 环 。 原 因 ： 有 两 个 以 上 的 噬 菌 体 侵 染 一 个 细 菌 时 ， 出 现 溶 菌阻 碍 现 象 ， 混 有 裂 解 和 未 裂 解 的 细 胞 。 (2)快 速 溶 菌 突 变 体 r（ rapid lysis） 形 成 大 的 噬 菌 斑 2mm，边 缘 清 晰 。 原 因 ： 无 溶 菌 阻 碍 现 象 。 (3)鉴 别 ： 噬 菌 斑 大 小 。 2、 寄 主 范 围 突 变 体 (1)野 生 型 h+ 能 感 染 野生 型 的 大 肠 杆 菌 Ttos，但 不 能 感 染 Ttor (2)突 变 型 h 对 Ttos 和Ttor都 能 感 染 。 (3)鉴 别 ： 混 合 Ttor 和 Ttos ， 野 生 型 h+出 现 混浊 噬 菌 斑 ， 突 变 型 出 现清 亮 噬 菌 斑 。 (4)噬 菌 体 与 细 菌 的 关系 侵 染 与 抗 性 。 部 分 溶 菌 3、 条 件 致 死 突 变 体 所 谓 条 件 致 死 突 变 型 ， 就 是 在 某 些 条 件 下 ，这 些 突 变 型 是 致 死 的 ， 那 么 这 些 条 件 就 称 为 限 制条 件 (restrictive condition)； 而 在 另 一 些 条 件 下仍 可 进 行 繁 殖 ， 从 而 得 以 扩 增 进 行 研 究 ， 所 以 这些 条 件 称 为 许 可 条 件 (permissive condition)。常 用 的 有 两 大 类 条 件 致 死 突 变 ： （ 1） “ 温 度 敏 感 ” 突 变 (temperature sensitive mutation) （ 2） “ 抑 制 因 子 敏 感 ” 突 变 (suppressor-sensitive mutation, sus) （ 1） “ 温 度 敏 感 ” 突 变 (temperature sensitive mutation)： 野 生 型 噬 茵 体 能 在 很 大 的 温 度 范 围 内 感 染 宿 主 并 进 行繁 殖 。 热 敏 感 突 变 型 (heat sensitive mutants， ts)： 通常 在 30 (许 可 条 件 )感 染 宿 主 进 行 繁 殖 ， 但 在 40一42 (限 制 条 件 )条 件 下 就 是 致 死 的 ， 不 能 形 成 噬 菌斑 ； 冷 敏 感 突 变 型 (cold sensitive mutation， cs)： 在较 低 温 度 下 就 是 致 死 的 。 原 因 ： 温 度 敏 感 性 几 乎 总 是 一 种 突 变 的 结 果 ， 基 因 突 变 后 所 编码 的 蛋 白 质 中 有 一 个 氨 基 酸 的 替 换 ， 而 这 种 蛋 白 质 在 “ 限 制 温度 ” 下 不 稳 定 而 丧 失 活 性 。 （ 2） “ 抑 制 因 子 敏 感 ” 突 变 (suppressor-sensitive mutation, sus)： 实 质 是 原 来 正 常 的 密 码 子 变 成 了 终 止 密 码 子 ， 因而 翻 译 提 前 终 止 ， 不 能 形 成 完 整 肽 链 而 产 生 有 活 性的 蛋 白 质 ， 属 于 无 义 突 变 （ nonsence mautation） 。带 有 sus突 变 的 噬 菌 体 在 感 染 一 种 带 有 抑 制 基 因(suppressor, su )(许 可 条 件 )的 宿 主 菌 时 能 产 生 子 代 ，但 在 感 染 另 一 种 没 有 抑 制 基 因 (su )(限 制 条 件 )的 宿主 菌 时 ， 不 能 产 生 子 代 。 野 生 型 噬 菌 体 在 这 两 种 宿主 中 都 能 产 生 子 代 。 sus突 变 不 像 “ 宿 主 范 围 突 变 ” 那 样 影 响 噬 菌 体对 宿 主 的 吸 附 ， 这 种 突 变 的 噬 菌 体 能 正 常 地 吸 附 、注 入 自 身 的 DNA， 杀 死 宿 主 细 胞 ， 但 不 产 生 子 代 。 （ 1） 抑 制 因 子 敏 感 突 变 的 概 念 ：例 如 ： 噬 菌 体 mRNA基 因 细 菌 tRNA基 因 反 密 码 子 正 常 突 变 突 变 正 常基 因 ： 5TAC 35TAG 3 3ATC 53ATG 5 mRNA 5UAC 3 5UAG 3 3AUC 5 3AUG 5 表 型 ： 酪 氨 酸 终 止 5UAG 3酪 氨 酸 酪 氨 酸3AUC 5 酪 氨 酸 表 5-2携 带 不 同 专 一 性 抑 制 基 因 宿 主 中 sus突 变 噬 菌 体 的 表 现噬 菌 体 基 因 型 宿 主 菌 基 因 型su- su+amb su+och su+op野 生 型sus ambersus ochresus opal + + + + - + + - - - + - - - - +（ 2） 噬 菌 体 的 抑 制 因 子 敏 感 突 变 型 类 型 及 表 现 琥 珀 型 （ amber） UAG 赭 石 型 （ ocher） UAA 乳 白 型 （ opal） UGA sus突 变 分 为 三 类 ；无义抑制基因（su）实质：tRNA基 因 发 生 了 突 变 ， 例 如 琥 珀型 抑 制 基 因 su3 在 UAG密 码 于 上 插 入 了 一 个 酪 氨 酸 ， 这 是因 为 tRNA加 基 因 的 反 密 码 子 的 一 个 突 变 ， tRNATry， 正 常 的 反 密码 于 是 GUA， 它 按 摆 动 规 则 译 读 酪 氨 酸 密 码 子 UAU(C)。 su3 菌 株 的 tRNATry含 有 反 密 码 子 CUA， 它 识 读 琥 珀 型 密 码 子 UAG， 并插 入 酪 氨 酸 而 防 止 终 止 。 （ 二 ） 无 义 突 变 与 无 义 抑 制 突 变无 义 突 变 ： 指 一 个 为 氨 基 酸 编 码 的 密 码 变 为 终 止 密 码 的 突 变 。 无 义 抑 制 突 变 ： 指 能 抑 制 无 义 突 变 表 现 的 突 变 。 表 5-3 5种 琥 珀 抑 制 基 因 的 性 质琥 珀 型 抑 插 入 的 合 成 的 蛋 白 质 赭 石 型 抑 制 基 因 氨 基 酸 占 野 生 型 % 制 基 因 su1+ 丝 氨 酸 28 - su2 + 谷 氨 酰 胺 14 - su3+ 酪 氨 酸 55 - su4+ 酪 氨 酸 16 + su5+ 赖 氨 酸 5 + 四 、 噬 菌 斑 分 析 （ The plaque assay）1. 噬 菌 斑 （ plaque）噬 菌 体 感 染 固 体 培 养 基 上 的 菌 苔 （ lawn） ，溶 菌 后 形 成 的 圆 形 清 亮 的 斑 。 Opaque lawn of bacteriaClear areas of plaque 2. 噬 菌 体 浓 度 的 测 定 方 法（ 1） 逐 步 稀 释 原 溶 菌 液 （ 10-1、 10-3、 10-5、 10-7）（ 2） 感 染 平 板 培 养 基 上 的 细 菌 菌 苔 （ lawn）（ 3） 计 数 形 成 的 噬 菌 斑（ 4） 计 算 原 溶 菌 液 中 的 噬 菌 体 数 目 。公 式 ： 噬 菌 斑 数 /mL 稀 释 倍 数原 始 噬 菌 体 浓 度 = 23 105 10ml原 始 浓 度 ： phages/ml 噬 菌 体 感 染 E.coli 第 二 节 噬 菌 体 突 变 型 的 重 组 实 验一 、 T2突 变 型 的 两 点 测 交但 10年 未 引 起 重 视 ！（ 1） 1936年 F.M.Burnet发 现 了 噬 菌 体 能 产生 突 变 体 ， 形 成 的 噬 菌 斑 的 外 形 与 野 生 型噬 菌 体 的 噬 菌 斑 有 明 显 的 区 别 。 （ 2） Hershey和 Luria的 发 现 1946年 第 11届 冷 泉 港 会 议 上三 人 获 1969年 Nobel prize（ 生 理 或 医 学 ） 噬 菌 斑 的 形 态 ： 宿 主 范 围 ：h： 噬 菌 体 能 在 E.coli B和 B/2品 系 上 生 长h+： 只 能 在 E.coli B品 系 上 生 长 。（ 3） Hershey使 用 两 个 表 型 特 征能 在 B和 B/2混 合 菌 苔 上 产 生 透 明 斑 。能 在 B和 B/2混 合 菌 苔 上 产 生 半 透 明 斑 。r： 快 速 溶 菌 ， 噬 菌 斑 大 ， 边 缘 清 楚 。噬 菌 斑 小 ， 边 缘 模 糊 。r+： 噬 菌 斑 与 基 因 型B和 B/2混 合 菌 苔 （ 4） 、 噬 菌 体 杂 交 . 亲 本 噬 菌 体 （ T2） 基 因 型hr+： 透 明 ， 小 斑 ， 边 缘 模 糊h+r： 半 透 明 ， 大 斑 ， 边 缘 清 楚 ， 杂 交 过 程 混 合 感 染 实 验两 个 亲 本 噬 菌 体 混 合 感 染 E.coli B和 B/2，观 察 菌 苔 上 出 现 的 噬 菌 斑 特 征 。 推 断 噬 菌体 的 基 因 型 。mixed infection experiments 混 合 感 染 （ mixed infection）E.coliB或 B/2T2 phage （ 5） 杂 交 结 果在 B和 B/2混 合 菌 苔 上 出 现 了 4种 噬 菌 斑 。噬 菌 斑 表 型 推 测 基 因 型亲 本 型 透 明 小 h r+半 透 明 大 h+ r重 组 型 半 透 明 小 h+ r+透 明 大 h r 半 大 半 小透 小 透 大 （ 6） 重 组 机 理 h+rh+rh+r h r+h r+h r+h+rh+rh +r hr+hr+h r+噬 菌 体 染 色 体 在细 菌 体 内 复 制不 同 的 噬 菌 体 染色 体 在 细 菌 体 内交 换 重 组 h+r+h+rh+r hr+hr+h r h+r+h+r h r+h r释 放 出 的 4种子 代 噬 菌 体部 分 噬 菌 体DNA重 组 （ 7） 噬 菌 体 重 组 值 与 基 因 作 图 重 组 值 的 计 算 重 组 噬 菌 体 的 噬 菌 斑 数总 噬 菌 斑 数 100% 基 因 图 距用 两 个 基 因 的 重 组 值 表 示 基 因 间 的 遗传 距 离 。（ h+r+ + hr）total plaques 100% Hershey和 Rotman1949年 的 T2杂 交 结 果基 因 型 噬 菌 斑 百 分 率hr+ 42 76%h+r 34h+r+ 12 24%hr 12r h24 （ 8） 、 T2噬 菌 体 的 遗 传 图 Hershey的 迷 惑 a. Hershey后 来 分 离 出 多 种 突 变 的 T2 噬 菌 体 ： r1、 r7、 r13b.详 细 的 杂 交 分 析用 hr的 不 同 突 变 体 杂 交 ， 计 算 h与 不 同 r之 间 的 重 组 值 并 绘 制 遗 传 图 。 h与 不 同 r之 间 的 重 组 值 杂 交 子 代 各 种 基 因 型 的 百 分 比h+r+ hr+ h+r hr 重 祖 率 %hr+ h+r1 12 42 34 12 24hr+ h+r7 5.9 56 32 6.4 13hr+ h+r13 0.74 59 39 0.94 1.7r1 h24r 7 h13r13 h1.7 h与 不 同 r之 间 的 位 置 关 系r1 hr7 r13r1 h r7r13r1 hr7 r13r 1 h r7r134种可 能 进 一 步 杂 交 确 定 各 r之 间 的 位 置r13r7+ r13+r7h r13r7排 列 结 果r1 hr7 r13r1 h r7r13或 ？ 到 底 是 那 种 排 列 ？ Streisinger和 Edgar的 判 断 10年 后 （ 1964） ， G. Streisinger和Edgar研 究 了 噬 菌 体 的 很 多 标 记 基 因 的 杂交 重 组 ， 才 判 断 出 T2噬 菌 体 的 遗 传 图 是 环形 的 。 hr1 r7r13 二 、 T4噬 菌 体 突 变 型 的 三 点 测 交噬 菌 体 也 能 进 行 三 点 测 交 （ 06A/9/4）突 变 型 ： 小 噬 菌 斑 (m)、 快 速 溶 菌 、 浑 浊 溶 菌 班 (tu) 往往 M 12.9 R 20.8 tu 三 X174突 变 型 的 两 点 和 三 点 测 交 P127(一 ) X174的 两 点 测 交 两 个 琥 珀 突 变 型 间 杂 交 amA x amB su+su+: amA、 amB su-基 因 型 ： amA- amB+ amA+ amB- amA+ amB+ amA+ amB+ amA- amB- A +B+ X 2 amA-amB间 重 组 值 ： X 100% su+:amA、 amB总 数许 可 条 件 :只 有 在 这 种均 中 才 能 产 生 子 代重 组 类 型 两 个 不 同 抑 制 因 子 敏 感 突 变 型 间 的 杂 交 sus amber x sus opal 限 制 条 件 ： su+amber、 opal su- 基 因 型 ： amb-opal+ amb+opal- amber+opal+ amb+opal+ amb-opal- su+amber； su+opal10-6 10-2P128 表 5-6 174突 变 型 之 间 杂 交 观 察 到 的 双 因 子 重 组 率 (二 )X174的 三 点 测 交1 确 定 三 个 基 因 的 顺 序 的 前 提 条 件 只 有 两 种 可 能 顺 序 的 条 件 下 进 行 ； 例 如 ： 要 确 定 amA、 amB、 tsC三 基 因 的 顺 序 已 知 ： amA与 amB较 近 ， amA和 amB离 tsC都 较 远 ； 三 个 基 因 顺 序 有 ： 或 ： amA amB tsC 或 ： tsC amA amB 不 存 在 ： amA tsC amB 2 确 定 三 个 基 因 的 顺 序 原 理 : 杂 交 ： amA + tsC X + amB + amA + tsC + amB + P127 图 5-4 如 果 基 因 顺 序 是 : amA amB tsC 实 验 结 果 应 是 : + + tsC为 大 类 ， +为 小 类 图 5-4 (正 交 顺 序 I或 反 交 顺 序 I) 如 果 基 因 顺 序 是 : tsC amA amB 实 验 结 果 应 是 : + + + 为 大 类 ， tsC + + 为 小 类 图 5-4 (正 交 顺 序 II或 反 交 顺 序 II) 四 噬 菌 体 基 因 重 组 的 特 点 P130 四 、 烈 性 噬 菌 体 的 遗 传 体 制 噬 菌 体 在 杂 交 中 ， 每 个 亲 代 对 子 代 所 提 供 的 遗 传 贡 献取 决 于 感 染 细 菌 时 每 种 亲 代 噬 萄 体 的 相 对 数 量 ； 噬 菌 体 的 基 因 重 组 是 发 生 在 噬 菌 体 的 DNA复 制 以 后 ，重 组 型 和 亲 本 型 一 起 复 制 ； 噬 菌 体 不 同 基 因 型 之 间 可 以 发 生 多 次 交 换 ； 在 噬 菌 体 中 基 因 重 组 频 率 可 以 随 着 宿 主 细 胞 裂 解 时 间的 延 长 而 增 加 ， 直 到 DNA与 外 完 蛋 白 装 配 成 为 完 整 的 噬菌 体 时 ， 重 组 才 停 止 。 因 此 噬 菌 体 杂 交 时 ， 应 该 注 意 ： 控 制 每 种 亲 代 噬 菌 体 基 因 型 的 投 放 量 ： 控 制 允 许 发 生 复 制 和 重 组 的 时 间 。 只 有 控 制 这 两 个 因 素并 在 标 准 条 件 下 进 行 杂 交 所 得 重 组 频 率 才 能 用 于 绘 制 近似 的 遗 传 图 。 第 三 节 噬 菌 体 突 变 型 的 互 补 试 验一 X174条 件 致 死 突 变 型 的 互 补 测 验(一 ) X174 DNA结 构 复 制 图 5-1 (二 ) X174的 突 变 型 与 互 补 测 验 1 互 补 测 验 原 理 在 限 制 条 件 下 ， 能 长 出 噬 菌 斑 ： 说 明 ： 两 个 突 变 型 能 发 生 功 能 互 补 ， 是 两 个 基 因 。 在 限 制 条 件 下 ， 不 能 长 出 噬 菌 斑 ： 说 明 ： 两 个 突 变 型 不 能 发 生 功 能 互 补 ， 是 同 一 基 因 。 2 互 补 测 验 及 结 果 P124 表 5-4 X174突 变 的 互 补 测 验 结 果 顺 反 子 突 变 型 A am8,am18,am30,am33,am35,am50,am86,tsl28, B am14,am16,och5,ts9,tsl16,och1,och8,och11, C och6 D am10,amH81, E am3,am6,am27, F am87,am88,am89, amH57,op6, op9,tsh6,ts41D G am9,am32,ts,ts79 H amN1,am23,am80,am90,ts4 二 T4突 变 型 的 互 补 试 验 第 四 节 噬 菌 体 基 因 组 与 原 噬 菌 体一 噬 菌 体 的 基 因 组 ： 由 49000bp构 成 1 基 因 分 类 头 部 基 因 ： 7个 （ 必 需 基 因 ： 相 邻 ） 尾 部 基 因 ： 11个 （ 必 需 基 因 ： 相 邻 ） 噬 菌 斑 形 成 必 需 的 基 因 复 制 所 需 基 因 ： O、 P 裂 解 、 释 放 所 需 基 因 ： S、 R基 因 正 调 控 基 因 ： N、 Q 附 着 区 ： att； 专 一 性 重 组 所 必 需 ： int、 xis 噬 菌 斑 形 成 非 必 需 的 基 因 溶 源 化 所 需 ： CI、 CII、 CIII 重 组 所 必 需 ： exo、 red P133 图 5-6 噬菌体的包装过程 噬菌体的基因组 2 噬 菌 体 基 因 组 的 结 构 特 点 :二 原 噬 菌 体 与 合 子 诱 导 1 原 噬 菌 体 ： 2 合 子 诱 导 ： Hfr( )X F- 受 体 菌 裂 解 ( 进 入 F-后 )b+ 原 点d+ c+ a+3 合 子 诱 导 与 整 合 部 位 的 确 定 Jacob和 Wollman（ 1956年 ） 发 现 了 合 子 诱 导（ zygotic induction） 现 象 ， 并 利 用 合 子 诱 导 确 定 了几 个 E.coli染 色 体 上 原 噬 菌 体 的 整 合 位 点 。 他 们 发现 Hfr（ ） F 所 得 到 的 重 组 子 频 率 要 比 Hfr F（ ） 或 Hfr（ ） F （ ） 要 低 得 多 。 这 是 由 于 在Hfr（ ） F 的 杂 交 中 ， 原 噬 菌 体 进 入 无 阻 遏 物 的受 体 细 胞 质 中 ， 进 行 大 量 复 制 使 受 体 细 胞 裂 解 ， 因此 不 易 得 到 重 组 子 ， 此 现 象 就 称 为 合 子 诱 导 。 现 在我 们 再 回 过 头 来 查 阅 一 下 传 递 等 级 作 图 ， 中 断 杂 交实 验 以 及 重 组 作 图 都 是 采 用 Hfr F （ ） 就 是 不 致产 生 合 子 诱 导 的 缘 故 。 第 四 节 噬 菌 体 基 因 组 与 原 噬 菌 体 噬 菌 体 整 个 基 因 组 如 图 所 示 ， 可 分 为 三 个 部 分 ， 左 臂 ： 从 A到 J长 约 20kb， 其 中 的 基 因 编 码 构 成 头 部 、尾 部 、 尾 丝 对 组 装 完 整 噬 菌 体 所 需 要 的 蛋 白 质 。 中 段 ：长 约 20kb， 是 DNA整 合 和 切 出 ， 溶 原 生 长 所 需 的 序 列 。 右 臂 ： 长 约 10kb， 是 调 控 区 ， 控 制 溶 菌 和 溶 原 生 长 最重 要 的 调 控 基 因 和 序 列 、 以 及 DNA复 制 起 始 均 在 这 区 域内 。 左 右 臂 包 含 DNA复 制 、 噬 菌 体 结 构 蛋 白 合 成 、 组 装成 熟 噬 菌 体 、 溶 菌 生 长 所 需 全 部 序 列 ； 对 溶 菌 生 长 来 说 ，中 段 是 非 必 需 的 。 三 原 噬 菌 体 的 插 入 与 切 除1 原 噬 菌 体 的 插 入 与 正 常 切 除 P135 图 5-7 2 原 噬 菌 体 的 异 常 切 除 P135 图 5-8 （ 1） 转 导 噬 菌 体 ： 指 带 有 细 菌 基 因 的 噬 菌 体 。 （ 2） d 转 导 噬 菌 体 的 特 点 ：3 温 和 性 性 噬 菌 体 的 互 补 试 验 与 作 图 (1)与 众 多 已 知 位 点 的 点 突 变 作 互 补 试 验 ， 确 定 缺 失 区 域 P136(2)用 众 多 已 知 缺 失 区 域 的 缺 失 品 系 对 点 突 变 进 行 缺 失 作 图 整 合 态 某 些 d gal品 系 与 图 谱 左 臂 顺 反 子 中 典 型 sus突 变 之 间 重 组 dgal1 dgal2 dgal3 dgal4 dgal5 susA - + + + + susB - - + + + susE - - - + + susG - - - - + susH - - - - - susM - - - - -attPdgal1dgal2 dgal 3 dgal4 dgal5A B E G H M 第 五 节 环 状 排 列 与 末 端 重 复一 线 状 DNA具 有 环 状 遗 传 图 1 噬 菌 体 DNA结 构 特 点 ： 具 末 端 重 复 （ 末 端 冗 余 ） 末 端 冗 余 :指 DNA分 子 两 端 核 苷 酸 顺 序 相 同 的 现 象 . 致 环 交 换 ： 指 基 因 在 遗 传 图 上 呈 环 状 排 列 。 2 末 端 重 复 的 实 验 证 据 图 5-11 3 基 因 呈 环 状 排 列 的 实 验 证 据 P138 图 5-12二 环 状 排 列 与 末 端 重 复 的 形 成 1 基 因 的 环 状 排 列 图 5-13（ A） 2 末 端 重 复 杂 合 子 的 形 成 图 5-13（ B） 环 状 排 列 与 末 端 冗 余 环 状 排 列 ： 末 端 冗 余 ： 通 过 核 酸 外 切 酶 III消 化 后 发 生 的 环化 反 应 来 证 明 基因 组 中 存 在 末 端重 复 的 示 意 图 T2 DNA 复 制重 组