生化分析仪检测原理

临床生化检验反应原理及报告审核检 验 科 黄 小 虎 全 自 动 生 化 分 析 仪 生化分析仪特 点 优 点 亮 点自 动 化机 械 化 的 仪 器设 备 模 仿 代 替 手 工 操 作 提 高 了 工 作效 率 减 少 了 主 观误 差 灵 敏 准 确 快 速 标 准 化 生化分析仪分类1按 结 构 原 理 分管 道 连 续 流 动 式分 立 式 常 用离 心 式干 片 式 急 诊常 用 2按 测 定 速 度 分小 型中 型大 型超 大 型 （ 模 块 式 ） 3按 自 动 化 程 度 分半 自 动全 自 动 2004 生 化 分 析 仪 主 要 构 成加 样 系 统 供 排 水 系 统构 成比 色 系 统光 源 比 色 杯 单 色 器 检 测 器 数 据 处 理 系 统样 品 转 盘 试 剂 仓 取 样 装 置 基本原理 临 床 生 化 分 析 仪 最 常 使 用 的 是 分 光 光 度 法 分 光 光 度 法 是 通 过 测 定 被 测 物 质 在 特 定 波长 处 或 一 定 波 长 范 围 内 光 的 吸 收 度 ， 对 该 物 质进 行 定 性 和 定 量 分 析 的 方 法 。 组成 光吸收曲线 溶 液 对 不 同 波 长 光 的 吸 收 程 度 ， 通 常 用 光 吸 收 曲 线 来 描 述 。 在 分 光 光 度 法 中 , 以 吸 光 度 为 纵 坐 标 , 以波 长 为 横 坐 标 作 图 可 得光 吸 收 曲 线 。 浓 度 不 同 的 同 种溶 液 , 在 该 种 曲 线 中 其最 大 吸 收 波 长 相 同 ， 相应 的 吸 光 度 大 小 则 不 同 ，同 一 波 长 下 摩 尔 吸 数 相同 。 Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律 当 一 束 平 行 单 色 光 通 过 均 匀 的 非散 射 样 品 时 ， 样 品 对 光 的 吸 光 度与 样 品 的 浓 度 及 厚 度 成 正 比 A = k c b A-吸 光 度 k-吸 光 系 数 c-溶 液 浓 度 b-液 层 厚 度 吸光系数 定 义 ： 吸 光 物 质 在 单 位 浓 度 及 单 位 厚 度 时 测得 的 吸 光 度 。 K值 的 大 小 取 决 于 吸 光 物 质 的 性 质 、 入 射 光波 长 、 溶 液 温 度 和 溶 剂 性 质 等 ， 与 溶 液 浓 度大 小 和 液 层 厚 度 无 关 。 但 K值 大 小 因 溶 液 浓度 所 采 用 的 单 位 的 不 同 而 异 。 讨 论：1.Lamber-Beer定 律 的 适 用 条 件 （ 前 提 ） : 入 射 光 为 单 色 光 溶 液 是 均 匀 ， 无 散 射 溶 液2.该 定 律 适 用 于 固 体 、 液 体 和 气 体 样 品3.在 同 一 波 长 下 ， 各 组 分 吸 光 度 具 有 加 和 性 ， 如 果 溶 液 中 同 时 存 在 两 种 或 两 种 以 上 的 吸 光 性 物 质 ,则 测 得 的 该 溶 液 的 吸 光 度 等 于 溶 液 中 各 吸 光 性 物 质 吸 光 度 的 总 和 ， 即 ： A（ a+b+c） Aa Ab Ac 应 用 ： 多 组 分 测 定 定量分析方法 (1) 标 准 曲 线 法 (2) 标 准 溶 液 对 比 法 (3) 吸 光 系 数 法 标准曲线法最经典方法 前 提 ：固 定 仪 器 和 固 定 条 件 A= K*BC 过 程 ：配 置 标 准 溶 液 系 列 分 别测 定 A 得 CA曲 线 样 品 测 定 A 样 查 得 C样 标准溶液对比法 在 相 同 的 条 件 下 ， 配 制 浓 度 为cs的 标 准 溶 液 和 浓 度 为 cx的 样品 溶 液 ， 在 最 大 吸 收 波 长 处 ，分 别 测 定 二 者 的 吸 光 度 值 为 As、Ax ， 依 据 朗 伯 -比 尔 定 律 得 : As=Kbcs Ax=Kbcx 则 : c x = cs*Ax /As sC iCC X 吸光系数法 吸 光 系 数 法 又 称 绝 对 法 ， 是 直 接 利 用 朗 伯 -比 尔 定 律 的 数学 表 达 式 A Kbc进 行 计 算 的 定 量 分 析 方 法 。 在 手 册 中 查 出待 测 物 质 在 最 大 吸 收 波 长 处 的 吸 光 系 数 或 ,并在 相 同 条 件 下 测 量 样 品 溶 液 的 吸 光 度 A， 则 其 浓 度 为 ： Ac L LE A %1cm1m ax %1cm1E或 检测方法1.终 点 法 2.固 定 时 间 法3.连 续 监 测 法 终点法 终 点 分 析 法 是 基 于 反 应 达 到 平 衡 时 反 应 产 物 的 吸 收 光谱 特 征 及 其 对 光 吸 收 强 度 的 大 小 ， 对 物 质 进 行 定 量 的 一 类分 析 方 法 。 反 应 混 合 物 进 行 一 定 时 间 反 应 后 ， 达 到 平 衡 终点 ， 即 在 显 色 反 应 处 于 稳 定 阶 段 时 ， 监 测 其 颜 色 对 光 的 吸收 强 度 ， 以 此 计 算 待 测 物 浓 度 。终 点 时 间 的 确 认 ：一 、 根 据 时 间 -吸 光 度 曲 线 如 :Trinder（ 偶 联 终 点 比 色 法 ） 反 应 测 尿 酸 ， 反 应 曲线 上 3-5分 钟 时 其 A趋 向 稳 定 ,故 可 将 5分 钟 作 为 反 应 终 点 。二 、 根 据 被 测 物 反 应 终 点 ， 结 合 干 扰 物 的 反 应 情 况 来 确 定 如 :溴 甲 酚 绿 法 测 血 清 白 蛋 白 分 类终 点 法 ： 一 点 终 点 法 二 点 终 点 法 免 疫 比 浊 法 双 波 长 法 一点终点法 一 点 终 点 法 在 时 间 -吸 光 度 曲 线 上 吸 光度 不 再 改 变 时 ， 选 择 一 个 时 间 点 测 定 吸 光度 值 。 通 常 在 反 应 终 点 附 近 连 续 读 两 个 吸 光 度 ，求 出 两 点 的 平 均 值 ， 并 根 据 两 点 的 差 值 判断 反 应 是 否 达 到 平 衡 。 一点终点法的设置： 以 R和 S混 合 之 前 的 空 气 空 白 、 水 空 白 或 试 剂 空 白的 吸 光 度 值 为 测 定 计 算 基 点 ， 以 反 应 达 到 平 衡 的吸 光 度 读 数 减 去 空 白 读 数 ， 校 准 曲 线 通 过 零 点 且成 直 线 ， 对 于 反 应 速 度 比 较 快 的 实 验 多 用 。 多 见 于 单 试 剂 项 目 ， 如 ： 总 蛋 白 ， 白 蛋 白 等 。 2021-7-27 21 Am T（ 时 间 ）AS+R( 吸光度）一点终点法反应曲线 计 算 公 式 ： C=(Am-Ab)*K Am-终 点 读 数 点 的 吸 光 Ab-试 剂 空 白 吸 光 度 K-校 正 系 数 TP反 应 曲 线蛋 白 质 +Cu 2+Cu-蛋 白 质 络 合 物 550nm处 吸 收 峰 二点终点法 第 二 试 剂 加 入 以 前 ， 选 择 某 一 点 读 取 吸 光 度 Am，经 过 一 定 时 间 后 反 应 达 终 点 后 测 第 二 个 吸 光 度 值An,利 用 两 吸 光 度 之 差 计 算 结 果 。 第 一 点 吸 光 度 值 由 样 本 本 身 或 第 一 试 剂 与 样 品 的非 特 异 性 反 应 有 关 ， 相 当 于 样 品 空 白 ， 可 有 效 的消 除 样 品 自 身 的 吸 光 度 ， 如 溶 血 ， 黄 疸 ， 脂 血 等的 干 扰 。 An TA R2AmS+R1( 吸光度） （ 时 间 ）两 点 终 点样 本 空 白 = S+R1S+R1+R2（ 体 积 校 正 因 子 ） k0 计 算 公 式 C=(An-K0*Am)*K CRE反应曲线肌 酐 在 一 系 列 酶 的 作 用 下 生 成 H 2O2， H2O2和 4-氨 基 氨替 比 林 反 应 生 成 红 色 醌 类 物 质 ， 在 540nm处 有 吸 收 峰 。 Mg反应曲线在 碱 性 溶 液 中 ， Mg与 二 甲 苯 胺 蓝 形 成 重 氮 盐 类 的 紫 色 复 合 物 ， Mg2+浓 度 可 由 二 甲 苯 胺 蓝 吸 光 度 的 下 降 ， 通 过 光 度 测 定 法 来 测 定 。 免疫比浊法 通 过 物 质 对 光 的 散 射 或 透 射 来 测 定 物 质 含 量 的 方 法 ： 散 射 比 浊 ： 特 定 蛋 白 分 析 仪 透 射 比 浊 ： 自 动 生 化 分 析 仪 通 常 作 两 点 终 点 法 分 析 ， 多 采 用 多 点 校 准 。 应 用 ： 用 Ab测 定 Ag（ 主 要 为 微 量 蛋 白 ： IG、 C、 APOA1/B、 ASO、 RF、 CRP等 ） ， 要 求 Ab过 量 ， 此时 Ag-Ab复 合 物 的 生 成 量 随 Ag的 增 加 而 递 增 ， 光 散 /透 射 强 度 与 抗 原 量 成 正 比 。 免疫比浊法 优 点 ： 方 法 简 便 结 果 准 确 可 用 于 自 动 化 仪 器 检 测 缺 点 ： 抗 体 用 量 大 达 平 衡 时 间 长 双波长法 消 除 样 品 中 对 测 定 有 干 扰 的 物 质 的 影 响 ； 在 试 样 中 含 有 两 个 组 分 a和 b时 ， 若 要 测 定 组 分 b,组 分 a有干 扰 ， 应 设 法 消 除 组 分 a的 吸 收 干 扰 。 首 先 选 择 待 测 组 分 b的 最 大 吸 收 波 长 1作 为 测 量 波 长 ， 然 后 用 作 图 的 方 法 选择 参 比 波 长 2 ， 使 组 分 a在 这 两 个 波 长 处 的 吸 光 度 相 等 。 试 样 溶 液 在 2和 1两 个 波 长处 的 吸 光 度 之 差 ，只 与 待 测 组 分 的浓 度 成 正 比 ， 而与 干 扰 组 分 的 浓度 无 关 干扰物质1.脂 血 ： 吸 收 光 谱 300-600nm呈 下 降 趋 势2.Hb： 350nm、 400nm、 540nm、 580nm 吸 收 峰3.胆 红 素 ： 300-500nm有 吸 收 峰 可 见 它 们 的 吸 收 峰 都 较 宽 ， 且 同 测 定 波 长 有重 叠 现 象 。 双波长法 双 波 长 测 定 优 点 ： 消 除 噪 音 干 扰 减 少 杂 散 光 影 响 减 少 样 品 本 身 光 吸 收 的 干 扰 固定时间法 指 在 时 间 -吸 光 度 曲线 上 选 择 两 个 测 光点 ， 这 两 点 既 非 反应 初 始 吸 光 度 亦 非终 点 吸 光 度 ， 利 用这 两 点 吸 光 度 差 值计 算 结 果 。 如 ： 苦 味 酸 法 测 肌 酐 计 算 公 式 ： C=(A2-A1)*KA1 A2 T( 吸光度） 测 定 底 物 的 消 耗 或 产 物 生 成 的 速 度 的 化 学 方 法 称 为 连续 监 测 法 （ 又 称 动 态 分 析 法 、 速 率 法 或 动 力 学 法 ） 。 在 反应 速 度 恒 定 期 （ 零 级 反 应 期 ） 来 连 续 观 察 和 记 录 一 定 反 应时 间 内 底 物 或 产 物 量 的 变 化 。 通 过 测 定 一 段 时 间 内 吸 光 度的 变 化 速 率 （ A/min ） 来 计 算 待 测 物 的 浓 度 。 酶 活 性 测 定 如 （ ALT、 AST、 ALP、 GGT等 ） 常 用连 续 监 测 法 （ 速 率 法 ） 酶促反应曲线 连续监测法 即 零 级 反 应 速 率 法 ,亦 称 斜 率 法 在 较 长 反 应 时 间 区 段 内 (90-180秒 )， 每 隔 一 定 时 间 (530秒 )读 取 一 次 吸 光 度 值 ， 至 少 读 取 4点 ， 得 到 3个 以 上 A，最 后 算 出 反 应 速 率 A/min。 uTuu u VVltALU 610/ 酶促反应进程曲线 2021-7-27 38 A1 TAS+R1 R2 A2( 吸光度） （ 时 间 ）连 续 监 测 法A/min=(A2-A1 )-(空 白 )/(t2-t1)t2t1 连续监测法特点 与 固 定 时 间 法 相 比 ， 属 于 即 时 观 测 ， 无 需停 止 酶 促 反 应 、 不 需 添 加 其 他 呈 色 试 剂 ，且 可 将 多 点 的 测 定 结 果 绘 图 连 线 ， 快 速 、直 观 查 看 酶 促 反 应 进 程 ， 很 容 易 找 到 呈 直线 的 线 性 期 ， 检 查 到 是 否 偏 离 零 级 反 应 。 典型酶联法反应曲线 ALT反应曲线 AMY反应曲线 生化结果报告审核 责 任 心 不 强 ， 未 对 结 果 进 行 认 真 审 核 对 检 测 仪 器 或 试 剂 方 法 学 不 够 了 解 工 作 经 验 不 足 对 仪 器 检 测 的 结 果 及 室 内 质 控 结 果 过 于 相 信 1.结合质控判断结果 在 控在 控GLO=TPALB 偏 高 2.结合临床资料审核结 合 病 人 的 性 别 、 年 龄 、 临 床 诊 断 、 其 他 检 查 结 果 审 核 例 ： 某 病 人 检 测 的 TP为 110g/L， 该 标 本 没 有 脂 血 等 影响 检 测 结 果 的 因 素 临 床 诊 断 ： 多 发 性 骨 髓 瘤 另 ： 胰 岛 素 与 低 血 糖 、 病 人 输 注 药 物 对 结 果 的 影 响 检验项目间的内在联系各 检 测 参 数 间 存 在 大 小 、 比 例 、 逻 辑 关 系例 ： TC HDL-C+LDL-C、 TBI DBI CK CK-MB LDH -HBDH 影响检验结果的因素 试 剂 线 性 范 围 ： 了 解 检 验 项 目 试 剂 的 线 性 范 围 ， 对超 过 或 低 于 范 围 的 项 目 ， 必 须 进 行 相 应 的 减 量稀 释 或 增 量 后 重 新 测 定 。 线性范围 在 实 际 工 作 中 ， 用 连 续 监 测 法 会 遇 到 检 验结 果 为 0或 者 负 值 的 情 况 ， 此 时 不 能 盲 目 相 信该 结 果 低 就 出 具 低 值 报 告 ， 应 查 看 其 反 应 曲 线例 ： 某 病 人 的 尿 液 AMY检 测 结 果 为 0U/L 其 反 应 曲 线 如 下 图 ： AMY反应曲线 AMY反应曲线分析分 析 ： 由 于 测 定 物 质 浓 度 过 高处 理 ： 对 测 定 物 质 进 行 十 倍 左 右 的 稀 释 再 测 定 ，直 到 反 应 曲 线 恢 复 正 常 结 果 才 可 靠 AMY反应曲线 AMY反应曲线第 一 次稀 释 后 检测项目的方法学 分 析 ： CK是 由 M和 B两 类 亚 基 组 成 的 二 聚体 ， 其 构 成 为 CK-MB(心 型 )约 占 0-3%、 CK-MM(肌型 )约 占 97-100%、 CK-BB（ 脑 型 ） 约 占 0-1% 影响检验结果的因素 检 测 项 目 的 方 法 学 ： 要 了 解 该 项 目 试 剂 采 用 的 方 法 学 ： 例 ： 某 病 人 在 测 定 心 肌 酶 谱 时 ， 其 CK:246U/L、CK-MB:286U/L， 标 本 无 溶 血 等 因 素 影 响 ,其 结果 中 CK-MB CK CK-MB采 用 的 检 测 方 法 为 免 疫 抑 制 法 正 常 人 体 中 ， CK同 工 酶 中 CK-MM CK-MB CK-BB,其 中 CK-BB含 量 极 少 ， 可 忽 略 。 免 疫 抑 制 法 正 是 建立 于 忽 略 CK-BB的 基 础 上 。 采 用 抗 体 抑 制 其 M亚 基活 性 ， 使 CK-MM失 去 活 性 ， 而 CK-MB失 去 一 半 的 活性 。 单 测 定 B亚 基 的 活 性 ， 其 结 果 2即 为 CK-MB活性 。由 于 在 患 轻 度 或 中 度 脑 损 伤 、 脑 血 管 意 外 及 脑 手术 后 造 成 脑 组 织 发 生 实 质 性 损 害 的 病 人 中 ， CK-BB会 升 高 ， 这 时 该 方 法 测 定 的 CK-MB的 活 性 相 当于 是 CK-MB+2CK-BB的 活 性 之 和 ， 造 成 CK-MB活 性 假 性 升 高 。 检验标本的影响 标 本 脂 血 会 使 反 应 浊 度 增 加 ， 透 光 度 下 降 ，吸 光 度 增 加 ， 从 而 造 成 检 验 结 果 不 准 确 。 如 TP、TG、 UA显 著 增 高 ， GGT显 著 下 降 或 为 0 标 本 溶 血 会 使 K+、 ALT、 AST、 LDH等 检 验 结 果显 著 升 高 抗 凝 剂 的 错 误 使 用 仪器性能影响 仪 器 老 化 、 故 障 、 清 洗 管 道 堵 塞 、 水 质 不 纯 等均 会 对 检 验 结 果 造 成 影 响 光 路 老 化 ： 表 现 为 CK-MB,ALP,ALT、 AST等 项 目结 果 重 复 性 较 差 水 质 不 纯 、 反 应 杯 清 洗 不 干 净 ： 表 现 为 无 机 物质 结 果 不 准 检验结果的总体趋势 即 使 质 控 在 控 ， 也 要 注 意 当 日 检 验 结 果 的总 体 的 分 布 趋 势 如 K+的 参 考 区 间 为 3.5 5.5， 中 值 为 4.5，如 果 当 日 结 果 大 部 分 甚 至 全 部 低 于 4.5， 即 使 当日 质 控 在 控 ， 任 要 考 虑 结 果 是 否 偏 低 ， 应 重 新校 准 、 质 控 后 再 测 定 如 在 质 控 中 TC(-1S),HDL(+1S),LDL(+1S),虽 然 在 控 ， 如 出 现 大 部 分 HDL+LDL TC， 也 应考 虑 重 新 对 三 项 目 校 标 、 质 控 后 再 测 定 总结 不 要 盲 目 相 信 仪 器 检 测 的 结 果 一 定 准 确 检 验 人 员 要 增 强 对 报 告 审 核 的 责 任 心 检 验 人 员 应 加 强 对 专 业 知 识 的 学 习 和 掌 握 ,了解 仪 器 的 性 能 及 各 项 目 的 方 法 学 和 反 应 原 理 对 检 验 标 本 的 状 态 要 认 真 确 认 对 有 疑 问 或 报 警 的 结 果 要 查 看 反 应 曲 线 加 强 与 临 床 科 室 的 沟 通