细胞培养的基本技术课件

细胞培养的基本技术 细胞培养技术平台细胞培养技术平台bb基基因因治治疗疗bb基基因因诊诊断断bb试试管管婴婴儿儿bb组组织织工工程程bb药药物物筛筛选选bb致致病病机机理理 主要内容主要内容bb 基本操作技术和要求基本操作技术和要求bb 原代培养原代培养bb 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持bb 细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏bb 细胞培养污染的检测和排除细胞培养污染的检测和排除细胞是生命活动的基本单位细胞是生命活动的基本单位bb1665166516651665年英国学者年英国学者年英国学者年英国学者Robert HookeRobert HookeRobert HookeRobert Hooke，用自制的显微镜观察软，用自制的显微镜观察软，用自制的显微镜观察软，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文拉丁文拉丁文拉丁文CellaCellaCellaCella（小室）词（小室）词（小室）词（小室）词.bb1983-391983-391983-391983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺德国植物学家施莱登和动物学家施旺德国植物学家施莱登和动物学家施旺德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了确立了确立了确立了“细胞学说细胞学说细胞学说细胞学说”的基本原则。的基本原则。的基本原则。的基本原则。bb（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；bb（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己 的的的的“生命生命生命生命”。bb（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。bb进化论，遗传学和进化论，遗传学和进化论，遗传学和进化论，遗传学和细胞学说细胞学说细胞学说细胞学说定为现代生物学的三大基定为现代生物学的三大基定为现代生物学的三大基定为现代生物学的三大基 石，而细胞学说又是后二者的石，而细胞学说又是后二者的石，而细胞学说又是后二者的石，而细胞学说又是后二者的 基石基石基石基石 。组织（细胞）培养组织（细胞）培养 从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法并维持其结构和功能的方法并维持其结构和功能的方法并维持其结构和功能的方法 。细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。1 1 基本操作技术和要求基本操作技术和要求bb由于体外培养的细胞没有抗感染能力，由于体外培养的细胞没有抗感染能力，bb因此防污染是决定培养成功的首要条件。因此防污染是决定培养成功的首要条件。bb一切操作需要一切操作需要保证无菌保证无菌和有条不紊。和有条不紊。1.1 1.1 培养室内的无菌技术培养室内的无菌技术bb培养前的准备：按实验计划和程序培养前的准备：按实验计划和程序 准备准备 物品，作到心中有数物品，作到心中有数bb培养室和超净台：定期全面彻底消毒培养室和超净台：定期全面彻底消毒bb培养用品的无菌处理：高压灭菌、过滤、培养用品的无菌处理：高压灭菌、过滤、酒精消毒酒精消毒bb实验中无菌培养操作：均在火焰近处进实验中无菌培养操作：均在火焰近处进行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞培养细胞，以防烧死细胞。1.2 培养细胞的培养细胞的 取材取材bb基本要求：基本要求：bb取材组织用培养液浸泡，取材组织用培养液浸泡，4 4度运送，度运送，2424h h内尽快培养。内尽快培养。bb取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。bb原代取材同时保留组织学和电镜标本，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。对供体来源、部位及一般情况做记录。1.2.3 1.2.3 皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材bb皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。bb取材方法似断层皮片手术，面积取材方法似断层皮片手术，面积2-32-3mmmm2.2.bb尽可能去除皮下和粘膜下组织。尽可能去除皮下和粘膜下组织。bb因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。1.2.4 1.2.4 内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材bb内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌的，明确取材部位，去除结缔组织。的，明确取材部位，去除结缔组织。bb肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织，肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织，标本应按污染组织处理。标本应按污染组织处理。1.2.5 1.2.5 血细胞的取材血细胞的取材bb血细胞培养可用于造血干细胞移植、免血细胞培养可用于造血干细胞移植、免疫活性细胞的治疗和染色体分析等。疫活性细胞的治疗和染色体分析等。bb取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常用浓度为用浓度为2020U/ml,U/ml,针管针管用较高浓度肝素用较高浓度肝素500500U/mlU/ml湿润。湿润。1.3 1.3 组织材料的分离组织材料的分离bb欲从组织中获得大量生长良好的细胞，欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。须将组织分散开，使细胞解离出来。bb常用方法有常用方法有机械法机械法和和化学法化学法。1.3.1 1.3.1 细胞悬液的分离方法细胞悬液的分离方法bb离心法：血液和体液等细胞悬液离心法：血液和体液等细胞悬液500-500-10001000rpm rpm 转速转速 5-10 5-10分钟。离心速度过大、分钟。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。时间过长，会造成细胞损伤和死亡。bb密度梯度离心法：用离心法将细胞分到密度梯度离心法：用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的的细胞。层细胞。适于分离密度不等的的细胞。常用介质有常用介质有Ficoll 400,Percoll,Ficoll 400,Percoll,泛影葡胺等。泛影葡胺等。1.3.2.1 1.3.2.1 机械分散法机械分散法bb适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。bb剪切组织为剪切组织为剪切组织为剪切组织为1 1 1 1mmmmmmmm3 3 3 3碎碎碎碎块块块块 后，置于组织匀浆研磨，后，置于组织匀浆研磨，后，置于组织匀浆研磨，后，置于组织匀浆研磨，或用吸管反复吹打分散组织细胞或用吸管反复吹打分散组织细胞或用吸管反复吹打分散组织细胞或用吸管反复吹打分散组织细胞 bb组织液放在注射器内通过针头压出。组织液放在注射器内通过针头压出。组织液放在注射器内通过针头压出。组织液放在注射器内通过针头压出。bb注射器针芯挤压后，用注射器针芯挤压后，用注射器针芯挤压后，用注射器针芯挤压后，用PBSPBSPBSPBS液洗涤，分别液洗涤，分别液洗涤，分别液洗涤，分别通过通过通过通过不锈钢筛网不锈钢筛网不锈钢筛网不锈钢筛网80,150,40080,150,40080,150,40080,150,400目孔径筛网。目孔径筛网。目孔径筛网。目孔径筛网。bb记数活细胞数，制成细胞悬液接种。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。1.3.2.3 1.3.2.3 消化分离法消化分离法bb消化法是结合生化和化学手段把已剪切消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分化，获得成较小体积的组织进一步分化，获得细细胞悬液胞悬液直接进行培养直接进行培养1.3.2.3.1 1.3.2.3.1 胰蛋白酶法胰蛋白酶法bb主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散。主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散。主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散。主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散。bb活性以消化酪蛋白的能力测定，常用活性以消化酪蛋白的能力测定，常用活性以消化酪蛋白的能力测定，常用活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1 1 1 1：250250250250bb消化效果与消化效果与消化效果与消化效果与pHpHpHpH值、温度、酶浓度和组织块大小值、温度、酶浓度和组织块大小值、温度、酶浓度和组织块大小值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关与硬度有关与硬度有关与硬度有关，bb对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切bb钙镁离子和血清抑制活性钙镁离子和血清抑制活性钙镁离子和血清抑制活性钙镁离子和血清抑制活性bb常用剂量为常用剂量为常用剂量为常用剂量为0.25%0.25%0.25%0.25%（0.1-0.5%0.1-0.5%0.1-0.5%0.1-0.5%），），），），pHpHpHpH值值值值 8 8 8 8（8-98-98-98-9）温度温度温度温度 37 37 37 37。bb4 4 4 4度配制应用液。度配制应用液。度配制应用液。度配制应用液。1.3.2.3.2 1.3.2.3.2 胶原酶法胶原酶法bb只对细胞间质胶原组织起消化作用，使只对细胞间质胶原组织起消化作用，使上皮细胞与胶原成份分离上皮细胞与胶原成份分离bb产品有产品有I-I-V VII-IXV VII-IX等型，分别适用于分离肝等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织bb钙镁离子和血清不影响活性钙镁离子和血清不影响活性,pH.6.5-7pH.6.5-7bb常用剂量为常用剂量为200200单位单位/mlml或或0.10.1g/ml 0.3 g/ml 0.3 g/mlg/ml1.3.2.3.1.3.2.3.3 3 EDTAEDTA法法bbEDTAEDTA（二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和。二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和。bb主要作用：能从组织生长环境中吸取维主要作用：能从组织生长环境中吸取维持组织完整的钙镁离子。持组织完整的钙镁离子。bb单独使用不能使细胞完全分散，单独使用不能使细胞完全分散，bb常用常用1:11:1的的EDTAEDTA（0.02%0.02%）和胰蛋白酶和胰蛋白酶0.25%0.25%混合液混合液2 2 原代培养原代培养bb也称初代培养也称初代培养,是从供体取得组织细胞后是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。在体外进行的首次培养。bb 细胞保持原有的基本性质，仍具二倍体细胞保持原有的基本性质，仍具二倍体遗传物性。最接近和反映体内生长特性。遗传物性。最接近和反映体内生长特性。适合作药物测试，细胞分化研究。适合作药物测试，细胞分化研究。bb原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，供体和细胞间有很大差异。供体和细胞间有很大差异。2.1 2.1 组织块培养法组织块培养法bb将组织剪成小块后，接种于培养瓶，将组织剪成小块后，接种于培养瓶，2424小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。bb培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。细胞的生长。bb如需做组织染色或电镜检查，可将组织如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。bb换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡亡 2.2 2.2 消化培养法消化培养法bb 采用前述的组织消化分散法。将妨碍采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。3 3 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持bb培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓的饱和密度的饱和密度。此时正常细胞则不再生长；此时正常细胞则不再生长；恶性细胞重叠生长恶性细胞重叠生长，易于从瓶壁上成片易于从瓶壁上成片脱落脱落,，为此传代势在必行。，为此传代势在必行。培养细胞的生长过程培养细胞的生长过程bb1 1 1 1）原代（初代）培养期原代（初代）培养期原代（初代）培养期原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，此从机体取下组织培养到第一次传代，此从机体取下组织培养到第一次传代，此从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般时间，因细胞种类不同，一般时间，因细胞种类不同，一般时间，因细胞种类不同，一般1-41-41-41-4周。周。周。周。bb2 2 2 2）传代期培养传代期培养传代期培养传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。代，使其连续生长。代，使其连续生长。代，使其连续生长。bb一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-5030-5030-5030-50代，此时可发代，此时可发代，此时可发代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisiscrisiscrisiscrisis）bb有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。般通称的细胞系。般通称的细胞系。般通称的细胞系。bb（3 3 3 3）衰退期：衰退期：衰退期：衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐慢，逐慢，逐慢，逐 渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所谓的（或叫有限细胞系），不能通过所谓的（或叫有限细胞系），不能通过所谓的（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisiscrisiscrisiscrisis（危（危（危（危象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。学衰老的细胞学基础。学衰老的细胞学基础。学衰老的细胞学基础。bb人胚胎成纤维细胞可以进行人胚胎成纤维细胞可以进行人胚胎成纤维细胞可以进行人胚胎成纤维细胞可以进行60606060代增殖，而代增殖，而代增殖，而代增殖，而80808080岁老人的岁老人的岁老人的岁老人的肺成纤维细胞仅传代了肺成纤维细胞仅传代了肺成纤维细胞仅传代了肺成纤维细胞仅传代了16161616代后便死亡。代后便死亡。代后便死亡。代后便死亡。表皮细胞寿命表皮细胞寿命表皮细胞寿命表皮细胞寿命4-4-4-4-10101010天；红细胞天；红细胞天；红细胞天；红细胞3 3 3 3周周周周-3-3-3-3个月，白细胞个月，白细胞个月，白细胞个月，白细胞5-75-75-75-7天，神经细胞数年天，神经细胞数年天，神经细胞数年天，神经细胞数年或更多。或更多。或更多。或更多。密度抑制（密度抑制（Density inhibitionDensity inhibition）或接触抑制）或接触抑制（Ccontact inhibitionCcontact inhibition）bb1958195819581958年年年年Abercrombie Abercrombie Abercrombie Abercrombie 等学者提出的一种现象，等学者提出的一种现象，等学者提出的一种现象，等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。即可停止。即可停止。即可停止。bb所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。细胞生长曲线细胞生长曲线细细胞胞数数量量生长天数生长天数缓慢生长期缓慢生长期对对 数数 生生 长长 期期平平 衡衡 期期 （1 1 1 1）迟缓期（或延迟期）迟缓期（或延迟期）迟缓期（或延迟期）迟缓期（或延迟期）bb当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。（2 2 2 2）对数生长期对数生长期对数生长期对数生长期：此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目迅速增长。期细胞倍增时间（迅速增长。期细胞倍增时间（迅速增长。期细胞倍增时间（迅速增长。期细胞倍增时间（TDTDTDTD）等于细胞周期时间（）等于细胞周期时间（）等于细胞周期时间（）等于细胞周期时间（TCTCTCTC）长度。）长度。）长度。）长度。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。（3 3 3 3）平衡期（平坦期）平衡期（平坦期）平衡期（平坦期）平衡期（平坦期）这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。3.1 3.1 原代细胞培养的传代原代细胞培养的传代bb细胞由培养瓶内分离再培养称之为传代细胞由培养瓶内分离再培养称之为传代,进行一次分离再培养称之为传一代。进行一次分离再培养称之为传一代。bb原代培养的首次传代是建系的关键时期，原代培养的首次传代是建系的关键时期，细胞需覆盖大部分瓶底后再传代细胞需覆盖大部分瓶底后再传代。bb首次传代时细胞接种数量要多一些，使首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。和增殖。3.2 3.2 细胞传代方法细胞传代方法bb 贴壁生长的细胞用消化法传代；贴壁生长的细胞用消化法传代；bb部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；代；bb悬浮生长的细胞采用离心分离后传代，悬浮生长的细胞采用离心分离后传代，3.2.1 3.2.1 贴壁细胞传代步骤贴壁细胞传代步骤bb吸除瓶内旧培养液；加入吸除瓶内旧培养液；加入1 1mlml消化液；消化液；3737C C或室温或室温25 25 C C消化消化2 52 5分钟分钟bb显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后；胞间隙增大后；bb直接加少许含血清的培养液，终止消化；直接加少许含血清的培养液，终止消化；bb细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接种在新的培养瓶内。别接种在新的培养瓶内。3.2.2 3.2.2 悬浮细胞的传代悬浮细胞的传代bb直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉后，将上清洗掉1/2 1/31/2 1/3，然后用吸管吹，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。打形成细胞悬液后，再传代。bb离心法：离心离心法：离心800 1000800 1000rpmrpm，5 5minmin，除除上清，加新的培养液，然后传代接种。上清，加新的培养液，然后传代接种。bb部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代化后传代3.3 3.3 细胞系的维持细胞系的维持bb是通过是通过换液换液、传代传代和和细胞冻存细胞冻存实现的：实现的：bb建立档案：建立档案：记录组织来源，生物学特性，记录组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态，常规病细胞的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本等。理染色的标本等。3.3 3.3 细胞系的维持细胞系的维持bb防细胞之间的交叉污染，传代时所用器防细胞之间的交叉污染，传代时所用器械要编号或做好标记械要编号或做好标记bb每一种细胞系都应有充足的冻存储备，每一种细胞系都应有充足的冻存储备，以防绝种；以防绝种；bb另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或发生改变衰老或发生改变4.3.4 4.3.4 培养细胞的纯化培养细胞的纯化bb自然纯化自然纯化bb自然纯化自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优即利用某一种类细胞的增殖优势，而排除其它细胞生长，靠自然的增势，而排除其它细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其它细胞，达到细胞纯化的目的。它细胞，达到细胞纯化的目的。4.3.4.2 4.3.4.2 人工纯化人工纯化bb 利用人为手段造成对某一细胞生长利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其它细胞的生长，有利的环境条件，抑制其它细胞的生长，从而达到纯化细胞的目的。从而达到纯化细胞的目的。3.4.2.1 3.4.2.1 酶消化法酶消化法bb酶消化法：由于上皮细胞和成纤维细胞酶消化法：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同对胰蛋白酶的耐受性不同,，成纤维细胞，成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，利用这种差异采用多次差别间才脱壁，利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。3.4.2.2 3.4.2.2 机械划除法机械划除法bb机械划除法：上皮细胞和成纤维细胞多机械划除法：上皮细胞和成纤维细胞多数都同时出现，混杂生长常常分区呈片，数都同时出现，混杂生长常常分区呈片，采用机械的方法去除不需要的细胞区域，采用机械的方法去除不需要的细胞区域，而保留需要的细胞。而保留需要的细胞。3.4.2.3 3.4.2.3 反复贴壁法反复贴壁法bb 成纤维细胞和上皮细胞相比，其贴成纤维细胞和上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约大约10 3010 30minmin完成附着过程（但不一定完成附着过程（但不一定完全伸展）；而上皮细胞大部分细胞在完全伸展）；而上皮细胞大部分细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞化细胞3.4.2.4 3.4.2.4 克隆法克隆法bb 将细胞分成单个细胞，使之分别生将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，然后对每一克隆进行测试，长成克隆，然后对每一克隆进行测试，选择出所需要的克隆。选择出所需要的克隆。3.4.2.5 3.4.2.5 培养基限定方法培养基限定方法 bb 某些细胞在生长过程中必须存在或某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则将无法生长。必须去除某种物质，否则将无法生长。而其它细胞与之相反，可以利用这种技而其它细胞与之相反，可以利用这种技术来纯化细胞。如杂交瘤技术常用的术来纯化细胞。如杂交瘤技术常用的HATHAT培养液，就用来筛选杂交瘤细胞而抑制培养液，就用来筛选杂交瘤细胞而抑制其它细胞。其它细胞。4.1 4.1 细胞的冻存细胞的冻存bb冻存细胞要缓慢冷冻。冻存细胞要缓慢冷冻。bb减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。的关键。bb冷冻保护剂的使用，可使细胞免受冰晶冷冻保护剂的使用，可使细胞免受冰晶形成和渗透压改变而致的损伤。常用二形成和渗透压改变而致的损伤。常用二甲基亚砜和甘油。甲基亚砜和甘油。bb冻存细胞最好每三个月复苏一次，检测冻存细胞最好每三个月复苏一次，检测细胞原特性是否改变。细胞原特性是否改变。细胞冻存步骤细胞冻存步骤bb 取生长对数期的细胞消化成细胞悬离心取生长对数期的细胞消化成细胞悬离心bb细胞记数细胞记数 2.5 2.5x10 x106 6/ml/ml冻存液冻存液bb加含加含10%10%DMSODMSO冻存液熔封冻存液熔封bb置置4 4度数小时，负度数小时，负2020度过夜度过夜 或或 -70 -70C C放置放置2-32-3h hbb移入液氮罐中移入液氮罐中bb记录记录细胞复苏步骤细胞复苏步骤bb取出安瓶立即放入取出安瓶立即放入3737C C水中水中bb消毒安瓶开封后将细胞消毒安瓶开封后将细胞 移入离心管中加移入离心管中加培养液离心培养液离心bb记数记数bb接种培养瓶培养接种培养瓶培养4.34.3培养细胞的运输培养细胞的运输bb冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存氮或干冰冻存 bb充液法：（充液法：（1 1）选择生长状态良好的细胞。）选择生长状态良好的细胞。一般以生长一般以生长1/3 1/21/3 1/2瓶底壁为宜，换新液，瓶底壁为宜，换新液，保留微量空气，拧紧瓶盖（保留微量空气，拧紧瓶盖（2 2）用棉花等）用棉花等做防震防压处理做防震防压处理5 5细胞培养污染的检测和排除细胞培养污染的检测和排除bb培养细胞的污染概念包括所有混入培养培养细胞的污染概念包括所有混入培养环境中对细胞生存生存有害的成份和造环境中对细胞生存生存有害的成份和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细胞和支原体）、化学物质及细胞微生物污染的途径微生物污染的途径bb空气：一般培养室环境中每立方米含菌空气：一般培养室环境中每立方米含菌数不应超过数不应超过1 51 5个个bb器材：器材：COCO2 2温箱温箱bb操作操作bb血清血清bb组织样本组织样本微生物污染的检测微生物污染的检测bb真菌污染真菌污染bb细菌污染细菌污染bb支原体污染：可做如下检测支原体污染：可做如下检测bb（1 1）相差显微镜检测）相差显微镜检测bb（2 2）荧光染色法）荧光染色法bb（3 3）电镜检查）电镜检查bb（4 4）DNADNA分子杂交或支原体培养等方法分子杂交或支原体培养等方法微生物污染的防治微生物污染的防治bb 防止的关键在于严格无菌操作，把防止的关键在于严格无菌操作，把好每一个关口，尽可能禁止其它污染的好每一个关口，尽可能禁止其它污染的物品进入培养操作环节：物品进入培养操作环节：微生物污染的防治微生物污染的防治bb抗生素：抗生素：抗生素：抗生素：一般用常用量的一般用常用量的一般用常用量的一般用常用量的5 105 105 105 10倍作冲击疗法。倍作冲击疗法。倍作冲击疗法。倍作冲击疗法。用药用药用药用药24 4824 4824 4824 48h h h h后，再换常规培养液。后，再换常规培养液。后，再换常规培养液。后，再换常规培养液。bb加温处理：加温处理：加温处理：加温处理：根据支原体对热敏感的特点，将受根据支原体对热敏感的特点，将受根据支原体对热敏感的特点，将受根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细胞放置在支原体污染的细胞放置在支原体污染的细胞放置在支原体污染的细胞放置在41 41 41 41 C C C C作用作用作用作用5 105 105 105 10h h h h，最最最最长不超过长不超过长不超过长不超过18181818h h h h，以杀灭支原体。以杀灭支原体。以杀灭支原体。以杀灭支原体。bb动物体内接种：动物体内接种：动物体内接种：动物体内接种：将支原体污染的细胞接种在同将支原体污染的细胞接种在同将支原体污染的细胞接种在同将支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养再进行繁殖。培养再进行繁殖。培养再进行繁殖。培养再进行繁殖。细胞交叉污染细胞交叉污染 bb有效防止细胞交叉污染：有效防止细胞交叉污染：bb所有器具要严格区分所有器具要严格区分bb不要触及培养液瓶瓶口不要触及培养液瓶瓶口bb细胞系都要在早期留有充足的冻存储备，细胞系都要在早期留有充足的冻存储备，可以复苏早期冻存细胞使用可以复苏早期冻存细胞使用。流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法bb 流式细胞仪可根据细胞核酸含量、流式细胞仪可根据细胞核酸含量、某些物质含量或细胞结构大小等参数来某些物质含量或细胞结构大小等参数来将细胞分离成不同的群体。将细胞分离成不同的群体。培养细胞生长状态的观察培养细胞生长状态的观察bb贴附生长型贴附生长型bb为能附着于底物表面生长的细胞，为能附着于底物表面生长的细胞，bb悬浮生长型悬浮生长型bb悬浮状态即可生长，如血、骨髓悬浮状态即可生长，如血、骨髓 脾细胞。脾细胞。培养细胞的生长特性培养细胞的生长特性bb贴附贴附：附着于底物如其它细胞、胶元、：附着于底物如其它细胞、胶元、玻璃或塑料，促细胞附着物质如基膜素、玻璃或塑料，促细胞附着物质如基膜素、纤维连接素、胶元、血清扩展因子可能纤维连接素、胶元、血清扩展因子可能参加细胞的粘附过程。参加细胞的粘附过程。bb接触抑制接触抑制：当两个细胞相互接触时，细：当两个细胞相互接触时，细胞不再移动，细胞膜皱褶样活动停止。胞不再移动，细胞膜皱褶样活动停止。bb密度依赖性密度依赖性：细胞稀少时生长迅速，融：细胞稀少时生长迅速，融合成片后，分裂停止。合成片后，分裂停止。常规观察常规观察需每天观察细胞生长过程中出现的变化：需每天观察细胞生长过程中出现的变化：bb1.1.培养液的颜色与透明度培养液的颜色与透明度bb2.2.细胞形态变化细胞形态变化bb3.3.细胞生长状态细胞生长状态bb4.4.微生物污染微生物污染细胞形态变化的观察细胞形态变化的观察相差显微镜：利用光通过不同物质时相差显微镜：利用光通过不同物质时相差显微镜：利用光通过不同物质时相差显微镜：利用光通过不同物质时 的折射和物的折射和物的折射和物的折射和物体厚度差别，产生衍射而引起光程改变，产生体厚度差别，产生衍射而引起光程改变，产生体厚度差别，产生衍射而引起光程改变，产生体厚度差别，产生衍射而引起光程改变，产生相位差的特性，用于观察培养细胞的附着、贴相位差的特性，用于观察培养细胞的附着、贴相位差的特性，用于观察培养细胞的附着、贴相位差的特性，用于观察培养细胞的附着、贴壁、伸展、移动、有丝分裂等形态活动。壁、伸展、移动、有丝分裂等形态活动。壁、伸展、移动、有丝分裂等形态活动。壁、伸展、移动、有丝分裂等形态活动。状态好的细胞状态好的细胞状态好的细胞状态好的细胞透明度大，折光性强，轮廓清楚，透明度大，折光性强，轮廓清楚，透明度大，折光性强，轮廓清楚，透明度大，折光性强，轮廓清楚，分裂期细胞多见。分裂期细胞多见。分裂期细胞多见。分裂期细胞多见。状态差的细胞状态差的细胞状态差的细胞状态差的细胞，失去原来的特点，胞质出现空，失去原来的特点，胞质出现空，失去原来的特点，胞质出现空，失去原来的特点，胞质出现空泡、颗粒，细胞变形，出现死亡。泡、颗粒，细胞变形，出现死亡。泡、颗粒，细胞变形，出现死亡。泡、颗粒，细胞变形，出现死亡。细胞计数细胞计数bb它是它是它是它是 了解细胞生长状态了解细胞生长状态了解细胞生长状态了解细胞生长状态的量化指标。的量化指标。的量化指标。的量化指标。bb制备细胞悬液，密度不制备细胞悬液，密度不制备细胞悬液，密度不制备细胞悬液，密度不低于低于低于低于10000100001000010000细胞细胞细胞细胞/ml/ml/ml/ml，用，用，用，用10 x10 x10 x10 x物镜观察计数板四角物镜观察计数板四角物镜观察计数板四角物镜观察计数板四角大方格的细胞数大方格的细胞数大方格的细胞数大方格的细胞数bb计数：细胞数计数：细胞数计数：细胞数计数：细胞数/ml/ml/ml/ml原液原液原液原液（4 4 4 4大格细胞数之合大格细胞数之合大格细胞数之合大格细胞数之合/4/4/4/4）X 10000 X 10000 X 10000 X 10000 bb注意：细胞分散均匀制注意：细胞分散均匀制注意：细胞分散均匀制注意：细胞分散均匀制成单个细胞悬液。成单个细胞悬液。成单个细胞悬液。成单个细胞悬液。活细胞的染料排除检测法活细胞的染料排除检测法bb细胞损伤或死亡时，细胞膜通透性发生细胞损伤或死亡时，细胞膜通透性发生变化，某些染料可穿透变性的细胞膜，变化，某些染料可穿透变性的细胞膜，与解体的与解体的DNADNA结合，使其着色，而活细胞结合，使其着色，而活细胞能排出进入细胞内的染料，或阻止这类能排出进入细胞内的染料，或阻止这类染料进入细胞内，因而不易着色。借此染料进入细胞内，因而不易着色。借此可以鉴别死活细胞。可以鉴别死活细胞。细胞活力测定的细胞活力测定的MTTMTT比色法比色法bb原理：活细胞的线粒体脱氢酶能将染料原理：活细胞的线粒体脱氢酶能将染料MTTMTT（二甲基噻唑二笨基四唑溴盐）转变（二甲基噻唑二笨基四唑溴盐）转变为不可溶性的紫色甲替颗粒，后者被酸为不可溶性的紫色甲替颗粒，后者被酸性异丙醇溶解后所呈现的色度（用性异丙醇溶解后所呈现的色度（用ODOD值值表示）反映出生活细胞的代谢水平。死表示）反映出生活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。亡细胞则无此酶活性。bb细胞培养技术的商业化：细胞培养技术的商业化：细胞培养技术的商业化：细胞培养技术的商业化：对于生物技术所使用的各种细胞株的价对于生物技术所使用的各种细胞株的价对于生物技术所使用的各种细胞株的价对于生物技术所使用的各种细胞株的价值，很难作出评价。值，很难作出评价。值，很难作出评价。值，很难作出评价。1998199819981998年，美国市场就达年，美国市场就达年，美国市场就达年，美国市场就达3.5-43.5-43.5-43.5-4亿美元，而且还亿美元，而且还亿美元，而且还亿美元，而且还以以以以6-8%6-8%6-8%6-8%的速度在增长。下边介绍几家美国细胞株供应公司和机构。的速度在增长。下边介绍几家美国细胞株供应公司和机构。的速度在增长。下边介绍几家美国细胞株供应公司和机构。的速度在增长。下边介绍几家美国细胞株供应公司和机构。美国细胞株供应公司和机构美国细胞株供应公司和机构bb名名名名 称称称称 网网网网 址址址址 InvitroganInvitroganInvitroganInvitrogan 有关不同细胞株的用户论坛有关不同细胞株的用户论坛有关不同细胞株的用户论坛有关不同细胞株的用户论坛 ATCCATCCATCCATCC 各种细胞株的主要供应者各种细胞株的主要供应者各种细胞株的主要供应者各种细胞株的主要供应者 提供有关细胞株的筛选提供有关细胞株的筛选提供有关细胞株的筛选提供有关细胞株的筛选 CellsaliveCellsaliveCellsaliveCellsalive 生产各种细胞感染、生产各种细胞感染、生产各种细胞感染、生产各种细胞感染、凋亡其它细胞过程的录象和图片凋亡其它细胞过程的录象和图片凋亡其它细胞过程的录象和图片凋亡其它细胞过程的录象和图片 Gentest Gentest Gentest Gentest 药物代谢试验用的酶和肝细胞主要供应者药物代谢试验用的酶和肝细胞主要供应者药物代谢试验用的酶和肝细胞主要供应者药物代谢试验用的酶和肝细胞主要供应者 Expession SystemsExpession SystemsExpession SystemsExpession Systems 杆病毒细胞株的主要供应者杆病毒细胞株的主要供应者杆病毒细胞株的主要供应者杆病毒细胞株的主要供应者 Life TechLife TechLife TechLife Tech 供应基础研究用的特异化细胞株供应基础研究用的特异化细胞株供应基础研究用的特异化细胞株供应基础研究用的特异化细胞株 方法与结果方法与结果bb96969696孔板培养细胞，孔板培养细胞，孔板培养细胞，孔板培养细胞，bb加入加入加入加入20ul MTT20ul MTT20ul MTT20ul MTT液，继液，继液，继液，继续培养续培养续培养续培养4h,4h,4h,4h,吸去上清液，吸去上清液，吸去上清液，吸去上清液，bb加入加入加入加入100ul100ul100ul100ul二甲基亚枫二甲基亚枫二甲基亚枫二甲基亚枫bb酶标仪测定光吸收，酶标仪测定光吸收，酶标仪测定光吸收，酶标仪测定光吸收，波长波长波长波长490nm.490nm.490nm.490nm.细胞分裂指数细胞分裂指数bb计算分裂细胞占全部细胞计算分裂细胞占全部细胞计算分裂细胞占全部细胞计算分裂细胞占全部细胞中比例的方法，中比例的方法，中比例的方法，中比例的方法，bb以表示细胞的增值程度。以表示细胞的增值程度。以表示细胞的增值程度。以表示细胞的增值程度。一般要计算和观察一般要计算和观察一般要计算和观察一般要计算和观察1000100010001000个个个个细胞中的细胞分裂相数。细胞中的细胞分裂相数。细胞中的细胞分裂相数。细胞中的细胞分裂相数。bb方法：细胞接种于放置小方法：细胞接种于放置小方法：细胞接种于放置小方法：细胞接种于放置小玻片的培养瓶内，每玻片的培养瓶内，每玻片的培养瓶内，每玻片的培养瓶内，每24h24h24h24h取取取取出一个小玻片，出一个小玻片，出一个小玻片，出一个小玻片，95959595酒精酒精酒精酒精固定，吉姆萨染色。计算固定，吉姆萨染色。计算固定，吉姆萨染色。计算固定，吉姆萨染色。计算出出出出1000100010001000个细胞中分裂相平个细胞中分裂相平个细胞中分裂相平个细胞中分裂相平均数值和所占百分比。按均数值和所占百分比。按均数值和所占百分比。按均数值和所占百分比。按所测的百分数逐日顺序绘所测的百分数逐日顺序绘所测的百分数逐日顺序绘所测的百分数逐日顺序绘制成图。制成图。制成图。制成图。细胞生长曲线细胞生长曲线bb利用细胞计数法进行利用细胞计数法进行利用细胞计数法进行利用细胞计数法进行bb同一种密度准确接种细同一种密度准确接种细同一种密度准确接种细同一种密度准确接种细胞，以胞，以胞，以胞，以7 7 7 710101010天能长满而天能长满而天能长满而天能长满而不发生生长抑制为度不发生生长抑制为度不发生生长抑制为度不发生生长抑制为度bb每天取三瓶细胞计数，每天取三瓶细胞计数，每天取三瓶细胞计数，每天取三瓶细胞计数，连续连续连续连续1 1 1 12 2 2 2周，周，周，周，bb以培养时间为横轴，细以培养时间为横轴，细以培养时间为横轴，细以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），胞数为纵轴（对数），胞数为纵轴（对数），胞数为纵轴（对数），bb生长曲线上细胞数量增生长曲线上细胞数量增生长曲线上细胞数量增生长曲线上细胞数量增加加加加1 1 1 1倍时间为细胞倍增时倍时间为细胞倍增时倍时间为细胞倍增时倍时间为细胞倍增时间间间间谢谢观赏！2020/11/564