细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术培训课件

v8484年年 天津大学天津大学,学士；学士；8787硕士；硕士；9191博士；博士；v9393年副教授，年副教授，9595年教授，年教授，9696年任博导；年任博导；v9797年年 教育部跨世纪优秀人才教育部跨世纪优秀人才v9999年人事部年人事部“百千万人才工程百千万人才工程”第一、二层次；第一、二层次；v0000年年-至今至今 历任化工学院副院长、院长历任化工学院副院长、院长;v0202年年 天津市天津市“131”131”人才工程第一层次；人才工程第一层次；v0303年年 天津市特聘教授；天津市特聘教授；v0404年年 国家杰出青年基金获得者国家杰出青年基金获得者;天津市授衔专家天津市授衔专家v0707年年 国家教学名师国家教学名师生物制药与现代中生物制药与现代中药工程药工程 元英进元英进7/16/20241细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术报告内容v紫杉醇的药源问题紫杉醇的药源问题v蛋白质组研究蛋白质组研究v代谢组研究代谢组研究v合成生物学研究合成生物学研究7/16/20242细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术概述1958,美国NCI开始筛选新型抗肿瘤药物研究计划;美国化学家Wani和Wall于1971年从太平洋红豆杉树皮中提取到一种抗肿瘤物质紫杉醇。紫杉醇的发现紫杉醇的发现7/16/20243细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术与微管蛋白 N 端第31位、217 231位氨基酸结合，抑制微管解聚，抑制有丝分裂，阻滞细胞周期于G2/M期,使癌细胞死亡。紫杉醇作用机理紫杉醇作用机理:概述(1979(1979年年)7/16/20244细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术概述19921992年年FDAFDA批准批准紫杉醇紫杉醇2006年年FDA批准多烯紫杉醇批准多烯紫杉醇晚期乳腺癌,晚期非小细胞肺癌晚期卵巢癌,胰腺癌、头颈癌胃癌,前列腺癌前列腺癌7/16/20245细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术概述紫杉醇与多烯紫杉醇紫杉醇与多烯紫杉醇H(CH3)3CO7/16/20246细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术紫杉醇原料来源紫杉醇原料来源1)1)天然天然红豆杉红豆杉红豆杉红豆杉植物提取法植物提取法概述7/16/20247细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术2)化学全合成化学全合成(2)Nicoloau路线路线-会聚式会聚式A环和环和C环环八元八元B环，得到环，得到ABC三环化合物。三环化合物。(3)Danishefsky路线路线-会聚式会聚式D环环与与A和和C、D环片段连接，合成八元环片段连接，合成八元B环。环。(1)Holton路线路线-线性途径线性途径AABABC。7/16/20248细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术3)半合成紫杉醇半合成紫杉醇v侧链：化学合成；侧链：化学合成；(2R,3S)-3-N-苯甲酰基苯甲酰基-苯基异丝氨酸苯基异丝氨酸避免了合成紫杉醇复杂的母环部分避免了合成紫杉醇复杂的母环部分母核：红豆杉针叶中提取母核：红豆杉针叶中提取巴卡亭巴卡亭 III（R=Ac）或或10-去乙酰基巴卡亭去乙酰基巴卡亭 III（10-DAB，R=H）7/16/20249细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术红豆杉细胞培养红豆杉细胞培养 2004年年6月月28日日，Bristol-MyersSquibb获总统绿色化学挑战奖。获总统绿色化学挑战奖。4)生物工程方法生物工程方法概述7/16/202410细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术细胞生长与紫杉醇合成细胞生长与紫杉醇合成v关系关系:非偶联非偶联v高产措施高产措施:v诱导子诱导子:稀土铈离子稀土铈离子/真菌多糖真菌多糖/甲基茉莉酸甲基茉莉酸v培养策略培养策略:前体饲喂前体饲喂/两相培养等两相培养等红豆杉细胞培养生产紫杉醇是很有潜力的技术,需要解析微观生物过程.7/16/202411细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术形态变化形态变化:细胞分化与紫杉醇生产细胞分化与紫杉醇生产细胞应答机理细胞应答机理:活性氧迸发刺激活性氧迸发刺激紫杉醇合成紫杉醇合成,同时引起细胞凋亡同时引起细胞凋亡微环境微环境剪切力场剪切力场现象现象实验实验关键问题7/16/202412细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术手段:测序技术革命,NMR,GC-MS,LC-MS,2DE-MS,基因组转录组蛋白质组代谢组系统生物技术系统生物技术DNADatabasesCompare,cluster,integrateNew Theory:structure and functionNew Application:industrial process improvement数据有待积累数据有待积累理论有待建立理论有待建立最终必将突破最终必将突破7/16/202413细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术高通量解析工业生物过程基因组基因组+转录组回转录组回答为什么答为什么?WHY?WHY蛋白质组回答如何蛋白质组回答如何进行进行?HOW?HOW代谢组回答是什么代谢组回答是什么?WHATWHAT回答工业过程的三回答工业过程的三个基本问题个基本问题7/16/202414细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术ProteomicsMetabolomicsLipidomics7/16/202415细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术微环境:固定化:15mmh:15mm固定化提高了紫杉醇的产量固定化提高了紫杉醇的产量7/16/202416细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术固定化不同区域的细胞活性与产量的关系固定化不同区域的细胞活性与产量的关系紫杉醇合成活力：由外层到核心增加细胞活力：由外层到核心降低7/16/202417细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术固定化细胞出现分化：固定化细胞出现分化：AGPs 表达表达Susp.Immob.Cheng JS,Lei C,Wu JC,Yuan YJ*.Journal of Biotechnology,2008,133(1):96-102.7/16/202418细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Susp.Immob.ERK-like 磷酸化固定化细胞的信号转导与调控固定化细胞的信号转导与调控Cheng JS,Yin DM,Yuan YJ*.Enzyme and Microbial Technology,2006,39(6):1250-12577/16/202419细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术固定化细胞对固定化细胞对MAP like-Kinases 磷酸化响应及调控作用磷酸化响应及调控作用Cheng JS,Yuan YJ*.Biotechnology and Applied Biochemistry,2006,44:109-117 7/16/202420细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Cheng JS,Yuan YJ.Proteomics 2006,6,2199-20072-DE2-DE和和MSMS，细胞生长、，细胞生长、生产与固定化微环境生产与固定化微环境作用的关系蛋白质组。作用的关系蛋白质组。发现氮、硫和糖代谢发现氮、硫和糖代谢相关的蛋白质与细胞相关的蛋白质与细胞分裂和次代谢产物之分裂和次代谢产物之间的关系间的关系为细胞培养方式选择为细胞培养方式选择提供依据提供依据蛋白组分析方法揭示固定化细胞时空异质性蛋白组分析方法揭示固定化细胞时空异质性7/16/202421细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Oxidative response of cells induced by shear stressHistochemical detection of H2O2 in cells by DAB staining Cell death was evaluated by Evans Blue staining 7/16/202422细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Changes of four identified proteins in media based on 2-D 7/16/202423细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Functional categories of identified proteins by 2-D LC-MS/MS 7/16/202424细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Functional categories of identified proteins by 2-D LC-MS/MS J-S Cheng,Y-J Yuan.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic.2009,58:8492 7/16/202425细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Metabolite profiling of Taxus cells in response to shear stress by GC-TOF-MS 7/16/202426细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Total ion chromatograms of Taxus cells for GC-MS analysis.P-P Han and Y-J Yuan.Biotechnology Progress.doi:10.1002/btpr.2097/16/202427细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术(B)Loading plot generated from PCA analysis.(D)VIP plot from PLS analysis.Multivariate analysis by PCA and PLS.Score plots from PCA(A)and PLS(C).7/16/202428细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Variations of intracellular metabolites under shear stress.A total of 65 intracellular metabolites7/16/202429细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Mmetabolite abundance onto the metabolic network.Shear stress inhibiting TCA cycle and N metabolism.Co-induction of glycolysis and accumulation of compatible solutes7/16/202430细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术(a)(a)得分图得分图(b)(b)载荷图载荷图PCAPCA分析正常细胞和不同分析正常细胞和不同诱导子胁迫的诱导细胞诱导子胁迫的诱导细胞MeJA和和Ce4+诱导东北红豆杉细胞磷脂酶的差异激活及诱导东北红豆杉细胞磷脂酶的差异激活及下游脂质信号分子的信号转导模型下游脂质信号分子的信号转导模型YangS,LuSH,YuanYJ.BBA-Mol.CellBiol.L.1781(2008)123134IF:3.539诱导子作用下红豆杉细胞膜磷脂代谢信号转导诱导子作用下红豆杉细胞膜磷脂代谢信号转导7/16/202431细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Phospholipidomics of Taxus cells responsing to shear stress7/16/202432细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Negative-ion LC/ESI/MS base peak chromatogram of phospholipids from Taxus cells 40 h after shear stress treatment.PG,phosphatidylglycerol;PE,phosphatidylethanolamine;PC,phosphatidylcholine;LysoPC,lysophosphatidylcholine.PA,phosphatidic acid;PI,phosphatidylinositol;PS,phosphatidylserine;7/16/202433细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Phospholipid contents in shear stress-induced Taxus cells.7/16/202434细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Score plots from PCA(A)and PLS(C).(B)Loading plot from PCA.(D)VIP plot from PLS.Multivariate analysis by PCA and PLS.7/16/202435细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术LysoPC Changes of biomarker phospholipidsPAP-P Han and Y-J Yuan.FASEB J.2009 23:623-630.7/16/202436细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Activation of phospholipase D Activation of phospholipase CDefining the enzymatic source of PA.7/16/202437细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Analysis of lipidomics of Taxus cells in response to shear stress7/16/202438细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Phospholipid contents in shear stress-induced T.cells.Decrease total phospholipids,Structural phospholipids such as PG,PE,and PC7/16/202439细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Sterols profiles of T.cells7/16/202440细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Fatty acids profiles in T.cells7/16/202441细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Variations of fatty acids under shear stress.Increase very-long-chain saturated FAIncrease monounsaturated FADecrease short chain saturated FA7/16/202442细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Schematic changes of sterol abundance onto the plant sterol biosynthetic pathway.7/16/202443细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术The ratios of campesterol:sitosterol,stigmasterol:sitosterol,and stigmasterol:campesterol in shear stress-induced T.cells.vIncrease stigmasterol at the expense of sitosterol and campesterol7/16/202444细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术The ratios between sterols and phospholipids in shear stress-induced T.cells.P-P Han,J Zhou,Y-J Yuan.Biotechnology and Applied Biochemistry doi:10.1042/BA200901027/16/202445细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术合成生物学（合成生物学（synthetic biologysynthetic biology）是基于生命系）是基于生命系统的工程技术，旨在设计、构建自然界不存在的生统的工程技术，旨在设计、构建自然界不存在的生命或使已存在生命具有新功能。命或使已存在生命具有新功能。合成生物学研究如何设计和构建人工生命，依靠人合成生物学研究如何设计和构建人工生命，依靠人工开发的基因密码，按照预定的方式运行生命。工开发的基因密码，按照预定的方式运行生命。继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。合成生物学7/16/202446细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Synthetic biology vs computer assembly Synthetic biology vs computer assembly 7/16/202447细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Production of paclitaxel 7/16/202448细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术7/16/202449细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术7/16/202450细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Engineered E.coli for production of amorphadieneNature Biotechnology21,796-802(2003)byJayDKeasling7/16/202451细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术4 4、Engineered yeast for production of amorphadieneFPPFPP积累：染色体水平修饰，积累：染色体水平修饰，tHMGRtHMGR（双拷贝）（双拷贝）、ERG20ERG20 、upc2-1upc2-1过表达，阻断过表达，阻断ERG9ERG9。ADSADS酵母表达，酵母表达，FPPFPP转化二烯。转化二烯。青蒿青蒿CYP71AV1CYP71AV1+CPRCPR共表达。共表达。20062006年：年：KeaslingKeasling全新设计和合成了酿酒酵母中的全新设计和合成了酿酒酵母中的青蒿素的代谢电路，成功实现了生产青蒿酸青蒿素的代谢电路，成功实现了生产青蒿酸。7/16/202452细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术Engineered yeast for Taxol productionCroteau RB,et al.Biotechnology and Bioengineering,2006,93:212-2247/16/202453细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术程景胜程景胜 副教授副教授肖文海肖文海韩培培韩培培杨松杨松National Fund for Distinguished Young Scholars(20425620)Key Program Grant(207360060，20236040，20706044）Acknowledgments 7/16/202454细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术7/16/202455细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术v工程酵母细胞炼制工厂合成并向胞外分泌青蒿酸v青蒿二烯产量达153mg/L,提高了500倍。v青蒿酸占酵母干重的4.5%v工程酵母发酵45天的生产能力为100mg/Lv其速度比从植物中提取要快将近100倍。v被评为2006年“世界十大科技进展之一”。v合成生物学的一个里程碑。4.4.酵母生产青蒿酸酵母生产青蒿酸Ro DK,et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.Nature,2006,440(7086):940-3合成生物学功能实现7/16/202456细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术