第二章菌种的选育教学课件

第二章菌种的选育 内内 容容 1.菌种的来源菌种的来源 2.菌种的选育菌种的选育 3.菌种的保藏菌种的保藏2.1 菌种的来源菌种的来源微生物具有的五大特性微生物具有的五大特性1.种类多种类多,分布广分布广;2.比面积大比面积大,代谢能力强代谢能力强;3.生长迅速生长迅速,繁殖快繁殖快;4.适应性强适应性强,容易培养容易培养;5.易变异易变异.2.1.1生物物质产生菌的筛选生物物质产生菌的筛选2.1.1.1微生物微生物-生物产物的来源生物产物的来源两个成功因素两个成功因素1.产生菌的选择产生菌的选择;2.合理的筛选方案合理的筛选方案几百倍几百倍选择性选择性灵敏度灵敏度2.1.1.2 待筛选样品的性质待筛选样品的性质l新产物的代谢类型新产物的代谢类型l生产工艺方式生产工艺方式2.1.1.3 筛选方案的设计筛选方案的设计三种基本的筛选方法：三种基本的筛选方法：1.整体生物；整体生物；2.2.完整细胞；完整细胞；3.3.亚细胞制剂亚细胞制剂举例举例1：抗细菌的筛选抗细菌的筛选琼脂扩散法：琼脂扩散法：1.试验菌的制备试验菌的制备金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC6538P摇瓶培养摇瓶培养调节菌体浓度调节菌体浓度OD660为为0.32.琼脂板制备琼脂板制备琼脂培养基琼脂培养基冷却至冷却至4550倒平板倒平板灭菌灭菌1%试验菌试验菌冷却或至冷却或至4保存保存4.琼脂板鉴定琼脂板鉴定或或或或打孔打孔对照对照样品样品标准抗生素标准抗生素供试样品供试样品培养培养抑菌圈观察抑菌圈观察举例举例2.抗癌筛选抗癌筛选 机理机理 许多天然化疗药物是通过使肿瘤细许多天然化疗药物是通过使肿瘤细胞的胞的DNA损伤而治疗的作用。损伤而治疗的作用。方法建立：方法建立：1.噬菌体噬菌体诱导检测诱导检测系系统统：当：当大大肠肠杆菌溶素原受阻遏状杆菌溶素原受阻遏状态态下的下的原噬菌体因原噬菌体因DNA的损伤而释放的损伤而释放出来，通过平板法检测完整噬菌出来，通过平板法检测完整噬菌体颗粒的生长情况可作出体颗粒的生长情况可作出DNA受受损情况判断。损情况判断。2.生化诱导生化诱导BIA法法 利用一种特别的利用一种特别的溶素源，在溶素源，在DNA受到损伤时并不释放出病毒颗粒而是形受到损伤时并不释放出病毒颗粒而是形成成-半乳糖苷半乳糖苷酶酶。可以通。可以通过检测过检测酶酶的化的化学反学反应应加以判断。加以判断。分析步骤(BIA)1.指示菌指示菌 大肠杆菌大肠杆菌BR513(ATCC33313)2.指示微生物培养指示微生物培养3.指示微生物倒固体检测平板指示微生物倒固体检测平板4.将待测发酵液少量（将待测发酵液少量（20ul）涂平板）涂平板5.加入加入-半乳糖苷酶的生色基质混合物半乳糖苷酶的生色基质混合物（84mg褪蓝褪蓝RR和和14mg6-溴溴-2萘萘-D-半乳糖吡喃糖苷于半乳糖吡喃糖苷于2ml二甲基二甲基亚砜亚砜中），中），再加入再加入琼琼脂静置，脂静置，观观察察颜颜色色变变化情况。化情况。6.结结果分析果分析2.1.2 微生物微生物选择选择分离的原理和分离的原理和发发展展选择分离的五个步骤：选择分离的五个步骤：1.含有微生物材料的选择含有微生物材料的选择2.材料的预处理材料的预处理 3.所需菌种的分离所需菌种的分离4.菌种的培养菌种的培养 5.菌种的选择和纯化菌种的选择和纯化（1）确定研究目标，了解微生物资源状况；）确定研究目标，了解微生物资源状况；（2）掌握物种分布，明确采样材料；）掌握物种分布，明确采样材料；研究目标和微生物资源资料确定待研究目标和微生物资源资料确定待选种子的类型。如研究抗菌素，可选种子的类型。如研究抗菌素，可选择放线菌、真菌、细菌选择放线菌、真菌、细菌依照资料或专家介绍，结合自己所依照资料或专家介绍，结合自己所掌握的知识及工作经验，明确待选掌握的知识及工作经验，明确待选种子在自然界的分布情况，确定采种子在自然界的分布情况，确定采样目标。样目标。（3）根据待选种子的生理学与生态学）根据待选种子的生理学与生态学特性，确定培养基，选择培养条件与特性，确定培养基，选择培养条件与方法。方法。（4）在上述准备工作完成之后，制定具）在上述准备工作完成之后，制定具体的筛选方案与操作步骤：体的筛选方案与操作步骤：进行综合、具体问题分析来决定。进行综合、具体问题分析来决定。2.1.2.1 微生物材料的选择微生物材料的选择采样时要注意的问题q 气候、水分、空气q 来源要广q 结合产品的特点q 标签：地点、时间、气候等 采土地点采土地点铲铲去表去表层层土土515cm取几十克装入取几十克装入无菌袋中无菌袋中扎袋，扎袋，记录时间记录时间、地点、地点和和环环境情况境情况尽快分离尽快分离2.1.2.2材料的预处理材料的预处理 如果所需菌种较多可直接分离，如如果所需菌种较多可直接分离，如果菌体较少怎么办？果菌体较少怎么办？1.物理法：加热、过滤、离心等方法物理法：加热、过滤、离心等方法2.化学法：加入一些基质。化学法：加入一些基质。3.诱饵法诱饵法:诱饵技术诱饵技术:将固体基质加到待测的土壤或将固体基质加到待测的土壤或水中水中,待其菌落长成后在涂平板待其菌落长成后在涂平板.2.1.2.3 所需菌种的分离所需菌种的分离 为了提高分离效率选择合适的培为了提高分离效率选择合适的培养基、选择性抑制剂的选择、培养养基、选择性抑制剂的选择、培养条件控制等等。条件控制等等。采用给混合菌群提供一些有利于所需采用给混合菌群提供一些有利于所需菌种或不利于其它菌型生长条件以促使所菌种或不利于其它菌型生长条件以促使所需菌株大量繁殖，从而利于分离它们，所需菌株大量繁殖，从而利于分离它们，所谓的增殖培养。谓的增殖培养。富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑.q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法.定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。2.1.2.4 菌种的培养菌种的培养应该注意：各种菌种的培养条件和时间也应该注意：各种菌种的培养条件和时间也各不相同。各不相同。2.1.2.5菌落的选择菌落的选择1.铺菌法；铺菌法；2.复印平板法。复印平板法。q 从形态的角度 菌菌落落的的外外观观形形态态，是是微微生生物物的的一一个个重重要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当的的培培养养基基上上生生长长，从从具具有有粘粘液液性性的的菌菌落落外外观观上上就就可可以以初初步识别。步识别。q 从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养在培养时以产物的形成有目的的设计培养基基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素2.2 工业化菌种的要求1.能够利用廉价的原料，或使用来源丰富的原料能够利用廉价的原料，或使用来源丰富的原料.2.2.菌体温度应适应较高的温度菌体温度应适应较高的温度.3.遗传性能要相对稳定遗传性能要相对稳定4.菌对所采用的设备和生产过程的适应性菌对所采用的设备和生产过程的适应性7.产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）5.菌的产物得率和产物在培养基中的浓度菌的产物得率和产物在培养基中的浓度6.产物容易从发酵液（细胞）中提取产物容易从发酵液（细胞）中提取2.3 施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法1.富集液体培养法富集液体培养法:连续培养菌种的筛选连续培养菌种的筛选比生长速率比生长速率(u):每克菌体每小时增长的每克菌体每小时增长的菌体量菌体量.u=1/XdX/dt.比比生生长长速速率率u基质浓度基质浓度BAr限限制制性性基基质质培养液培养液当进行流加时基质浓度当进行流加时基质浓度r时时,B菌先被洗出菌先被洗出;2.固体培养基的使用固体培养基的使用主要适用于初级代谢产物菌株的筛选主要适用于初级代谢产物菌株的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）文献文献:产生菌为中性芽孢杆菌，产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型2.4 随机分离方法随机分离方法1.抗生素产生菌筛选抗生素产生菌筛选2.药理活性化合物的筛选药理活性化合物的筛选3.生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选4.多糖生产菌的筛选多糖生产菌的筛选2.4 菌种选育菌种选育目的目的:防止菌种退化防止菌种退化解决生产实际问题解决生产实际问题提高生产能力提高生产能力提高产品质量提高产品质量开发新产品开发新产品2.4.1自然选育自然选育自然选育自然选育:在生产过程中在生产过程中,不经过人工处理不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种的筛选利用菌种的自然突变而进行菌种的筛选的过程的过程.自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9自然突变有两种情况自然突变有两种情况：一一种种是是我我们们生生产产上上所所不不希希望望看看到到的的，表表现现为为菌菌株株的的衰衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另另一一种种是是我我们们生生产产上上希希望望看看到到的的，对对生生产产有有利利，这这种种突突变成为正突变。变成为正突变。自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义问题：问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？回回复复突突变变：高高产产菌菌株株在在传传代代的的过过程程中中，由由于于自自然然突突变变导导致致高高产产性性状状的的丢丢失失，生生产产性性能能下下降降，这这种种情情况况我我们们称称为为回回复复突变突变自自然然选选育育虽虽然然突突变变率率很很低低，但但却却是是工工厂厂保保证证稳稳产产高高产产的的重要措施。重要措施。自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验2.4.2 诱变育种诱变育种用用各各种种物物理理、化化学学的的因因素素人人工工诱诱发发基基因因突突变变进进行行的的筛筛选选，称为诱变育种称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变诱变剂剂物理：紫外，快中物理：紫外，快中子子化学：硫酸二乙酯，亚硝基化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍胍生物诱变剂生物诱变剂 噬菌体噬菌体2.4.2.1 诱变育种的一般步骤见诱变育种的一般步骤见(p38)整个流程主要包括整个流程主要包括:诱变和筛选诱变和筛选.诱变育种中的几个注意问题诱变育种中的几个注意问题1.出发菌株的选择出发菌株的选择 出发菌株标准出发菌株标准:产量高、对诱变剂的产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。敏感性大、变异幅度大。待处理的菌悬液应考虑微生物的生理待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长施促使细胞处于同步生长,这样有利于变这样有利于变异率提高得到很好的重现性。异率提高得到很好的重现性。2.复合诱变因素的使用复合诱变因素的使用出发菌株通常有三种出发菌株通常有三种:从自然界分离得到的野生型从自然界分离得到的野生型;通过生产选育的菌株即自发突变选育通过生产选育的菌株即自发突变选育已经通过诱变选育的菌株已经通过诱变选育的菌株.对于不同出发菌株考虑采用不同的对于不同出发菌株考虑采用不同的诱变剂进行处理诱变剂进行处理3.剂量的选择剂量的选择 变异率与致死率有一定的关系变异率与致死率有一定的关系,利利用致死率作为剂量选择的依据用致死率作为剂量选择的依据.4.变异菌株的筛选变异菌株的筛选初筛初筛:总结变异的菌落总结变异的菌落“形态形态”特性和产量特性和产量之间的关系之间的关系.根据平皿反应直接挑取高产菌株根据平皿反应直接挑取高产菌株:平皿反应平皿反应:每个菌落产生的代谢产物与每个菌落产生的代谢产物与培养基的指示物作用后的变色圈和抑制培养基的指示物作用后的变色圈和抑制圈等等圈等等.常用方法常用方法:纸片培养显色法、透明圈法、纸片培养显色法、透明圈法、琼脂片法、浓度梯度法等等。琼脂片法、浓度梯度法等等。以上为产量型的筛选以上为产量型的筛选营养缺陷型的筛选：营养缺陷型的筛选：经过诱变后，经过中间培养，淘汰野生经过诱变后，经过中间培养，淘汰野生型、检出营养缺陷型确定生长谱。型、检出营养缺陷型确定生长谱。淘汰野生型的方法有：抗生素法、菌丝淘汰野生型的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等，其目过滤法、差别杀菌法和饥饿法等，其目的是浓缩营养缺陷型。的是浓缩营养缺陷型。营养缺陷型检查方法：逐个测定法、夹营养缺陷型检查方法：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法等等。层平板法、限量营养法等等。5.高产菌株的获得与筛选条件的配合高产菌株的获得与筛选条件的配合 出发菌株、诱变因素、筛选条件出发菌株、诱变因素、筛选条件2.4.3 物理、化学诱变剂的使用原理方法物理、化学诱变剂的使用原理方法1.紫外线：有效波长紫外线：有效波长260nm左右；诱变左右；诱变条件，一般选择条件，一般选择15W紫外灯，距菌（孢紫外灯，距菌（孢子）悬液子）悬液30cm左右，在黑暗或红灯照射左右，在黑暗或红灯照射环境下进行。环境下进行。作用机制：形成胸腺嘧啶二聚体以改变作用机制：形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡。生物活性，造成菌体变异甚至死亡。2.快中子快中子 快中子的生物学效应是由其撞击原快中子的生物学效应是由其撞击原子核后产生的质子产生的。子核后产生的质子产生的。能够引起较多的点突变和染色体变，能够引起较多的点突变和染色体变，而产生诱变育种的效应。而产生诱变育种的效应。3.氮芥氮芥(p40)机理：氮芥的盐酸盐和碳酸氢钠机理：氮芥的盐酸盐和碳酸氢钠反应释放出氮芥子气，再与细胞作反应释放出氮芥子气，再与细胞作用引起染色体发生畸变。用引起染色体发生畸变。使用方法：使用方法：活化剂和解毒剂的配置活化剂和解毒剂的配置氮芥的盐酸盐配置氮芥的盐酸盐配置诱变作用诱变作用诱变终止诱变终止4.亚硝酸亚硝酸 作用机制：脱去碱基中的氨基，引作用机制：脱去碱基中的氨基，引起碱基对的转换作用从而造成突变。起碱基对的转换作用从而造成突变。5.N-甲基甲基-N/-亚基胍（亚基胍（NTG)对对DNA起到烷化剂和亚硝酸的作用。起到烷化剂和亚硝酸的作用。6.航天育种航天育种利用空间高真空、微重力和强辐射的利用空间高真空、微重力和强辐射的特点特点2.5 抗噬菌体菌株的筛选抗噬菌体菌株的筛选 证明抗噬菌体突变在发生与噬菌体接触证明抗噬菌体突变在发生与噬菌体接触之前的经典实验：之前的经典实验：波动实验、涂布实验、影印实验。波动实验、涂布实验、影印实验。2.5.1 抗噬菌体菌株选育方法：抗噬菌体菌株选育方法：1.自然突变；自然突变；2.诱发突变。诱发突变。2.2.5.2 抗噬菌体的特性实验抗噬菌体的特性实验1.抗噬菌体性状的稳定性实验抗噬菌体性状的稳定性实验 点滴法、双层琼脂法。点滴法、双层琼脂法。2.抗性菌株的产量实验抗性菌株的产量实验3.真正抗性和溶原性的区别真正抗性和溶原性的区别2.5.3 噬菌体的防治噬菌体的防治 噬菌体的危害：引起发酵液变稀噬菌体的危害：引起发酵液变稀,引引起菌丝体变形起菌丝体变形,消解消解,发酵终产物积累停发酵终产物积累停止甚至下降止甚至下降.怎样防治怎样防治?1.正确判断正确判断2.普及有关噬菌体的知识普及有关噬菌体的知识3.选育抗噬菌体菌株选育抗噬菌体菌株4.消灭噬菌体消灭噬菌体5.收集和保存噬菌体收集和保存噬菌体2.6杂交育种杂交育种杂交育种杂交育种:将两个基因型不同的菌株经吻将两个基因型不同的菌株经吻合合(接合接合)使遗传物质重新组合使遗传物质重新组合,从中分离从中分离和筛选具有遗传新性状的菌株和筛选具有遗传新性状的菌株.杂交育种的目的杂交育种的目的1.改变遗传物质基础改变遗传物质基础,获得杂种菌株获得杂种菌株;2.获得优良菌种获得优良菌种,克服由于长期诱变造成克服由于长期诱变造成的菌株生活能力下降等缺陷的菌株生活能力下降等缺陷;3.扩大变异范围扩大变异范围,改变产品质量和产量改变产品质量和产量,甚甚至出现新的品种至出现新的品种;4.促进遗传学理论发展促进遗传学理论发展.营养缺陷性营养缺陷性:微生物经诱变剂处理微生物经诱变剂处理,由于基因突变由于基因突变,失去了合成某种物质失去了合成某种物质的能力的能力,不能在基本培养基上生长需不能在基本培养基上生长需要补加一定种类的有机物质后才能要补加一定种类的有机物质后才能生长生长.2.6.1 细菌的杂交育种细菌的杂交育种A-B+Lac-SMrT1sA+B-Lac+SMsT1rA-B+Lac-SMrT1sA+B-Lac+SMsT1rA+B+Lac+SMsT1rA-B-Lac+SMsT1rA+B+Lac+SMrT1sA+B+Lac+SMsT1sA+B+Lac+SMrT1r等等组合型等等组合型细菌的杂交育种其他方式：细菌的杂交育种其他方式：F因子的转移、转化和转导等发因子的转移、转化和转导等发生基因重组的方式。生基因重组的方式。例如：例如：F因子的转移：（因子的转移：（Hfr)F+Hfr+2.6.2放线菌的杂交育种放线菌的杂交育种链霉菌基因重组主要过程链霉菌基因重组主要过程亲本亲本亲本亲本混合菌丝体混合菌丝体异核体异核体亲亲本本分分离离子子部分合子部分合子异核系异核系重组体重组体v基因重组过程中的四种遗传体系基因重组过程中的四种遗传体系:v1.异核体异核体:在同一菌丝或菌体中存在不同基因在同一菌丝或菌体中存在不同基因型的细胞核型的细胞核.2.接合现象接合现象供体染色体片段供体染色体片段和受体染色体相和受体染色体相结合形成了部分结合形成了部分合子又称半合子合子又称半合子3.异核系的形成异核系的形成 当部分合子形成后，就会形当部分合子形成后，就会形成杂合的无性繁殖系。产生的孢成杂合的无性繁殖系。产生的孢子多为单倍体。子多为单倍体。如果没有发生染色体的重组不能如果没有发生染色体的重组不能在基本培养基上生长。在基本培养基上生长。分生孢子分生孢子4.重组体的形成重组体的形成 异核体菌落在生长过程中，染色体异核体菌落在生长过程中，染色体重叠的两节段（二体区）的不同位置发重叠的两节段（二体区）的不同位置发生交换后能生交换后能 产生重组体孢子。产生重组体孢子。+重组体重组体2.6.2.1放线菌的杂交技术放线菌的杂交技术1.混合培养法混合培养法a.选择性平板法选择性平板法b.异核系分析法异核系分析法2.平板杂交法平板杂交法3.玻璃纸转移法玻璃纸转移法成功报道：金霉素、土霉素、新霉素、红成功报道：金霉素、土霉素、新霉素、红霉素、新霉素等抗生素杂交育种方面。霉素、新霉素等抗生素杂交育种方面。2.6.3 霉菌的杂交育种霉菌的杂交育种2.6.3.1准性生殖过程准性生殖过程形成异核体形成异核体杂合双倍体的形成（核融合或核配）杂合双倍体的形成（核融合或核配）体细胞重组（体细胞交换、分离和单倍体细胞重组（体细胞交换、分离和单倍体化）体化）2.6.3.2霉菌杂交技术霉菌杂交技术1.选择直接亲本选择直接亲本突变菌株突变菌株（遗传标记）（遗传标记）诱变诱变原始亲本原始亲本杂交杂交直接亲本直接亲本遗传标记的多样性：遗传标记的多样性：营养突变型、抗药性突变型、形态突变型等。营养突变型、抗药性突变型、形态突变型等。遗传标记要求：遗传标记要求：菌体形态稳定菌体形态稳定能在基本培养基上形成丰富的孢能在基本培养基上形成丰富的孢子子不影响产量不影响产量在配对过程中容易形成异核体在配对过程中容易形成异核体2.异核体的形成（强制异合）异核体的形成（强制异合）方法：完全培养基液体混合法、完方法：完全培养基液体混合法、完全培养基等方法（见全培养基等方法（见P47).3.双倍体的检出。双倍体的检出。4.分离子的检出分离子的检出 2.6.4原生质体融合技术原生质体融合技术原生质融合原生质融合:把亲本的细胞壁在酶的作用把亲本的细胞壁在酶的作用下瓦解下瓦解,形成原生质体形成原生质体.两个原生质体在高两个原生质体在高渗环境条件下渗环境条件下,在助融剂的作用下在助融剂的作用下,发生细发生细胞融合胞融合,基因组通过接触到交换基因组通过接触到交换,从而实现从而实现遗传重组遗传重组.标记菌株筛选标记菌株筛选原生质体制备原生质体制备融合融合再生再生融合子选择融合子选择实用菌株筛选实用菌株筛选2.6.4.1原生质融合的优点原生质融合的优点1.诱变、遗传转化、原生质体融合诱变、遗传转化、原生质体融合效率高效率高;2.能够得到多种类型的重组子能够得到多种类型的重组子;3.重组频率高重组频率高4.可以和其他育种技术相结合可以和其他育种技术相结合5.便于提高筛选效率便于提高筛选效率原生质体融合技术的应用原生质体融合技术的应用原生质体制备和再生过程引起产量突原生质体制备和再生过程引起产量突变。变。原生质体制备和再生过程引起质粒丢原生质体制备和再生过程引起质粒丢失。失。种内融合引起抗生素合成中限速酶得种内融合引起抗生素合成中限速酶得到修饰到修饰种间融合可能引起种间融合可能引起“沉默基因沉默基因”的表达。的表达。2.7 DNA重组技术重组技术DNA重组技术：按照人的意志，将某一重组技术：按照人的意志，将某一（供体）的遗传信息在体外经人工与载（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组体相接（重组），构成重组DNA分子，分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源使被引入的外源DNA片段在后者内部得片段在后者内部得以表达和遗传。以表达和遗传。开辟了一个分子育种的新领域开辟了一个分子育种的新领域-分子育分子育种种分子育种：利用基因工程技术、原理和设备，分子育种：利用基因工程技术、原理和设备，在分子水平上改良菌种。在分子水平上改良菌种。2.7.1 优越性：优越性：1.增加生物合成基因量而增加抗生素的产量；增加生物合成基因量而增加抗生素的产量；2.导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量；导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量；3.两种不同基因在体外重组后再导入受体内可两种不同基因在体外重组后再导入受体内可以合成杂交抗生素；以合成杂交抗生素；4.激活沉默基因激活沉默基因5.把异源基因克隆到宿主中表达，以期彻底改把异源基因克隆到宿主中表达，以期彻底改变生产工艺。变生产工艺。2.7.2 DNA重组技术的基本过程重组技术的基本过程1.目的基因的取得目的基因的取得有三种途径：有三种途径：从供体中直接提取从供体中直接提取通过反转录取得通过反转录取得cDNA化学合成特定功能的目的基因化学合成特定功能的目的基因2.优良载体的选择优良载体的选择具有一个自我复制能力的复制子具有一个自我复制能力的复制子能在受体细胞内大量繁殖；能在受体细胞内大量繁殖；最好只有一个限制性内切核酸酶的切口；最好只有一个限制性内切核酸酶的切口；必须有一种选择性遗传标记必须有一种选择性遗传标记3.目的基因与载体目的基因与载体DNA的体外重组的体外重组采用限制性酶切或人为地在采用限制性酶切或人为地在DNA的的3端接上端接上polyA和和polyT可以使重可以使重组组的两个的两个DNA分子分子产产生生“卯眼卯眼”似的粘性末端。然后两者在似的粘性末端。然后两者在56下下“退火退火”形成新的双链，在连接酶的形成新的双链，在连接酶的作用下形成重组载体作用下形成重组载体4.重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞5.重组受体细胞的筛选和鉴定重组受体细胞的筛选和鉴定筛选类别筛选类别遗传学直接筛选法：抗药性、遗传学直接筛选法：抗药性、噬菌斑形成能力等噬菌斑形成能力等分子生物学间接法：酶切相对分子生物学间接法：酶切相对分子量的大小、分子杂交等分子量的大小、分子杂交等举例抗药性变化检测：举例抗药性变化检测：质粒质粒AprTcrApr+含氨卞青霉素培养基含氨卞青霉素培养基含四环素培养基含四环素培养基6.工程菌的大规模培养工程菌的大规模培养基因工程菌不稳定具体表现基因工程菌不稳定具体表现质粒的丢失质粒的丢失重组质粒发生重组质粒发生DNA片段脱落片段脱落表达产物不稳定表达产物不稳定解决不稳定性对策解决不稳定性对策组建适当载体组建适当载体(质粒上插入质粒上插入 特殊特殊DNA片段片段)选择适当宿主选择适当宿主施加选择压力（抗生素添加法、抗生素依施加选择压力（抗生素添加法、抗生素依赖变异法、营养缺陷型法）赖变异法、营养缺陷型法）控制基因过量表达控制基因过量表达控制培养条件控制培养条件改良质粒改良质粒固定化工程菌固定化工程菌2.8 菌种的保藏菌种的保藏2.8.1 意义：菌种保藏首先是菌种不死亡，意义：菌种保藏首先是菌种不死亡，保持优良的生产性状。保持优良的生产性状。2.8.2菌种保藏的原理和方法菌种保藏的原理和方法原理：根据菌种的生理生化特点，人工创造原理：根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少变异。低，以减少变异。菌种保藏的几种方法：菌种保藏的几种方法：1.斜面冰箱保藏法；斜面冰箱保藏法；2.沙土管保藏法；沙土管保藏法；3.菌丝速冻法；菌丝速冻法；4.石蜡油封存法；石蜡油封存法；5.真空冷冻干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法6.液氮超低温保存法液氮超低温保存法作业作业通过查阅资料请你设计一套从自然界筛选构通过查阅资料请你设计一套从自然界筛选构建高产纤维素菌株的方法建高产纤维素菌株的方法.要求要求:1.