细胞培养基质量控制(定稿)课件

细胞培养基的质量控制细胞培养基的质量控制中国兽医药品监察所菌种室细胞组中国兽医药品监察所菌种室细胞组20102010年年6 6月月v前言前言v细胞培养细胞培养基在生物制药领域的基在生物制药领域的应用应用v国内外对细胞培养基的管理国内外对细胞培养基的管理v细胞培养基的质量控制细胞培养基的质量控制报告内容前言前言 细胞培养基从1903年开始发展 最初：天然组织液血液血清组织提取物体液的化学分析 1950年，199培养基 上世纪60年代，设计出无血清培养基简单基础培养基简单基础培养基 BME(Eagles 基础培养基)EMEM(Eagles 最低必需培养基)GMEM(Glasgows 改良Eagles培养基)DMEM(Dulbeccos改良Eagles培养基)RPMI(Roswell Park Memorial Institute洛斯维公园纪念研究所培养基)BME BME(EAGLES(EAGLES 基础培养基基础培养基)最初为培养 mouseL 和 HeLa细胞而设计 在所有合成细胞培养基中使用最广泛的一种 可用于测定正常(WI38)和转化(鼠L和HeLa)细胞单层的生长反应 BME 是Eagles 最低必需培养基(EMEM or MEM)和Dulbeccos改良Eagles培养基(DMEM)的前身EMEM(EMEM(EAGLES EAGLES 最低必需培养基最低必需培养基)13种氨基酸 8种维生素 6种离子 可补充血清（提供必要的不明成分）必需氨基酸必需氨基酸组氨酸 异亮氨酸亮氨酸赖氨酸甲硫氨酸(和/或 半胱氨酸)苯丙氨酸(和/或 酪氨酸)苏氨酸色氨酸缬氨酸GMEM GMEM(GLASGOWS(GLASGOWS 改良改良EAGLESEAGLES培养基培养基)由lan MacPherson和Michael Stoker发明，以改良EAGLES培养基 该培养基用于研究遗传因子对细胞特性的影响。该培养基是中BME的基础上，添加10%胰蛋白示磷酸盐和两倍常规浓度的氨基酸和维生素。DMEM DMEM(DULBECCOS(DULBECCOS改良改良EAGLESEAGLES培养基培养基)DMEM 最应用最广泛的改良Eagles培养基。DMEM 是由基础Eagle培养基(BME)改良而来，含有4倍浓度的氨酸酸和维生素，以及其它补充成分 最初的DMEM 含有1000 mg/L的葡萄糖，最初用于培养鼠胚胎细胞 为培养特定细胞，可将葡萄糖浓度优化为4500。RenatoDulbecco,因1955年发明DMEM，于1975年获诺贝尔医学奖RPMIRPMI(ROSWELL PARK MEMORIAL(ROSWELL PARK MEMORIAL INSTITUTE)INSTITUTE)由lan MacPherson和Michael Stoker发明，以改良EAGLES培养基 该培养基用于研究遗传因子对细胞特性的影响。该培养基是中BME的基础上，添加10%胰蛋白示磷酸盐和两倍常规浓度的氨基酸和维生素。细胞培养基在生物制药领域的应用n n细胞培养基是以动物细胞大规模培养为技术平台，研发及细胞培养基是以动物细胞大规模培养为技术平台，研发及生产生物药品的关键原材料之一生产生物药品的关键原材料之一n n蛋白药物蛋白药物n n抗体药物抗体药物n n人用疫苗人用疫苗n n兽用疫苗兽用疫苗n n其它新药研发和科学实验其它新药研发和科学实验等等“培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确实是最重要的一种培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确实是最重要的一种”WurmWurm博士，瑞士联邦科技学会生物工艺学教授博士，瑞士联邦科技学会生物工艺学教授 20052005，Genetic Engineering News Genetic Engineering News生物制药生物制药核心要素核心要素细胞培养基在生物制药领域的应用l l20112011年年全球生物制药市场销售额为全球生物制药市场销售额为16001600亿，占据全球制药份额的亿，占据全球制药份额的19%19%l l预计预计20152015年生物制药产品的销售额将超过年生物制药产品的销售额将超过24002400亿亿 l l生物制药在制药行业比重的增加决定着细胞培养基市场的不断扩大与生物制药在制药行业比重的增加决定着细胞培养基市场的不断扩大与发展，而生物制药行业的发展趋势也决定着细胞培养基市场的发展趋发展，而生物制药行业的发展趋势也决定着细胞培养基市场的发展趋势。势。全球利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的普及率到达全球利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的普及率到达80%80%，均使用个性化（或定制）的细胞培养基，均使用个性化（或定制）的细胞培养基。个性化配方（属于非公开、商业秘密）的细胞培养基占世界主要细胞个性化配方（属于非公开、商业秘密）的细胞培养基占世界主要细胞培养基制造商销售额的培养基制造商销售额的70-90%70-90%；无血清无动物来源成分细胞培养有逐渐取代传统的加血清培养方式的无血清无动物来源成分细胞培养有逐渐取代传统的加血清培养方式的趋势趋势细胞培养基在生物制药中的重要性细胞培养基在生物制药中的重要性细胞培养细胞培养基实际上就是生物技术产业的一个基实际上就是生物技术产业的一个“菜篮子菜篮子”工程，只要工程，只要用到细胞来做生物技术产品就必须要用到细胞培养基。用到细胞来做生物技术产品就必须要用到细胞培养基。营养丰富的细胞培养基可以缩短细胞生长周期从而缩短生产周期，营养丰富的细胞培养基可以缩短细胞生长周期从而缩短生产周期，可以增加细胞密度、增加收获次数、提高表达量，提高生物制品可以增加细胞密度、增加收获次数、提高表达量，提高生物制品的产量的产量培养基可能给生物制品带来潜在污染，影响产品的分离纯化，关培养基可能给生物制品带来潜在污染，影响产品的分离纯化，关系到生物制品的质量安全系到生物制品的质量安全细胞培养动物疫苗细胞培养动物疫苗疫苗疫苗细胞系细胞系疫苗疫苗细胞系细胞系口蹄疫病毒口蹄疫病毒BHK-21牛副流感病毒牛副流感病毒3 3型型MDBK猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒(中国中国)Marc-145牛腹泻病毒牛腹泻病毒MDBK猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒(美国美国)MA-104牛呼吸道合胞病毒牛呼吸道合胞病毒MDBK狂犬病毒狂犬病毒BHK-21牛鼻气管炎病毒牛鼻气管炎病毒MDBK猪流感病毒猪流感病毒MDCK犬腺病毒犬腺病毒2 2型型MDCK,VERO猪瘟活疫苗（暂行）猪瘟活疫苗（暂行）ST犬细小病毒犬细小病毒CrFK,F81猪回肠炎活疫苗猪回肠炎活疫苗（胞内劳森氏菌）（胞内劳森氏菌）McCoy犬瘟热病毒犬瘟热病毒VERO,MA104猪伪狂犬病毒猪伪狂犬病毒PK(15)犬副流感病毒犬副流感病毒2 2型型MDCK,Vero猪细小病毒猪细小病毒ST,PK(15),IBRS-2狗狗 EHRLICHIA(EHRLICHIA(一种一种立克次氏体病立克次氏体病)DH82马轮状病毒马轮状病毒MA104猫瘟病毒猫瘟病毒CRFK马流感病毒马流感病毒MDCK猫腺病毒猫腺病毒2 2型型CRFK东方马脑炎东方马脑炎VERO猫白血病病毒猫白血病病毒FL72西方马脑炎西方马脑炎VERO马病毒流产马病毒流产1 1型型4 4型型马皮肤马皮肤FDAFDA对细胞培养基的管理对细胞培养基的管理l lFDAFDA将细胞培养基产品列为医疗器械中的将细胞培养基产品列为医疗器械中的类类器械。器械。大多数在美国进大多数在美国进行商业销售的医疗器械都是通过上市前通告行商业销售的医疗器械都是通过上市前通告510(k)510(k)的形式得到批准的形式得到批准的，对的，对类医疗器械产品（占类医疗器械产品（占46%46%左右），实行的是特殊控制，即企左右），实行的是特殊控制，即企业在进行注册和列名后，还需实施业在进行注册和列名后，还需实施GMPGMP和递交和递交510510（K K）申请）申请。l lFDA regards CCM product as type II apparatus in medical FDA regards CCM product as type II apparatus in medical apparatus,most medical apparatuses for commerce sales apparatus,most medical apparatuses for commerce sales are approved by form of giving public notice 510(k)before are approved by form of giving public notice 510(k)before they come into the market,the type II medical apparatus they come into the market,the type II medical apparatus(about 46%)was implemented special control,that to say(about 46%)was implemented special control,that to say after the enterprise registered it still also implement GMP after the enterprise registered it still also implement GMP and submit 510(K)application.and submit 510(K)application.欧盟对细胞培养基的管理欧盟对细胞培养基的管理l l在欧盟，细胞培养基产品作为一种由多种成分混合组成的物质，必在欧盟，细胞培养基产品作为一种由多种成分混合组成的物质，必须向欧洲化学品管理局（须向欧洲化学品管理局（ECHAECHA）注册，才能获准得进入欧盟市场）注册，才能获准得进入欧盟市场l lCCMCCM,one material that composed of various ingredients,one material that composed of various ingredients,must register in ECHA can be qualified to enter into must register in ECHA can be qualified to enter into European Union market.European Union market.生物制药企业对细胞培养基的要求生物制药企业对细胞培养基的要求l l台湾生物制药企业对细胞培养基生产企业的台湾生物制药企业对细胞培养基生产企业的CGMPCGMP稽核稽核 依据台湾依据台湾药品优良制造规范药品优良制造规范原料药作业基准原料药作业基准以及国际医药品稽查协约组以及国际医药品稽查协约组织（织（PIC/SPIC/S）的规定对细胞培养基厂商进行的规定对细胞培养基厂商进行cGMPcGMP稽核，要求多达稽核，要求多达 179179项项条款条款l l国内抗体制药企业向美国申报新药的资料中，对细胞培养基的质量国内抗体制药企业向美国申报新药的资料中，对细胞培养基的质量要求：要求：明确细胞培养基组分明确细胞培养基组分 明确原辅料质量标准明确原辅料质量标准 现场质量体系稽核报告现场质量体系稽核报告国内细胞培养基行业的现状国内细胞培养基行业的现状l l生产企业生产企业 国内生产企业：国内生产企业：8 8家左右家左右 在华销售的国外企业（包括进口分装）：在华销售的国外企业（包括进口分装）：6 6家家左右左右l l生产条件：相差生产条件：相差较大较大l l市售产品市售产品 有些产品没有标明组分有些产品没有标明组分 添加动物来源成分物质添加动物来源成分物质 某些进口细胞培养基产品无有效期某些进口细胞培养基产品无有效期 进口分装培养基，分装后未经检验就销售进口分装培养基，分装后未经检验就销售l l缺少相关专业学历或资质的生产和质量管理人员缺少相关专业学历或资质的生产和质量管理人员l l生产环境简陋生产环境简陋l l检验条件不足，不具备细胞培养基产品全部质量指标的检验条件，检验条件不足，不具备细胞培养基产品全部质量指标的检验条件，也不具备对原材料检验的条件和能力也不具备对原材料检验的条件和能力l l无最终混合的批量概念无最终混合的批量概念l l没有实行没有实行GMPGMP管理管理国内细胞培养基生产企业存在的问题国内细胞培养基生产企业存在的问题l l没有实现行业管理没有实现行业管理 目前，目前，培养基即不属于药品，也不属于按药品管理的辅料，国家培养基即不属于药品，也不属于按药品管理的辅料，国家对细胞培养基没对细胞培养基没有强制性有强制性质量标准，也未列入药品生产管理范畴质量标准，也未列入药品生产管理范畴国内监管存在一定缺失国内监管存在一定缺失l l动物动物细胞可以耐受的体外环境的各种成分的范围比较窄（下表），所以对细胞可以耐受的体外环境的各种成分的范围比较窄（下表），所以对与之相关的与之相关的培养基的培养基的质量有必要进行严格的质量控制。质量有必要进行严格的质量控制。细胞培养基质量细胞培养基质量控制控制n n细胞类型不同，采用的培养基类型也有差异细胞类型不同，采用的培养基类型也有差异n n一般要求一般要求 离子：离子：Na,K,Ca,Mg,Cl,P,Na,K,Ca,Mg,Cl,P,磷酸氢根磷酸氢根 微量元素：铁微量元素：铁，锌，锌，硒硒 糖，如葡萄糖糖，如葡萄糖 氨基酸氨基酸 血清血清;含有激素和促生长因子含有激素和促生长因子n n同时，含抗生素，细胞生长不需要，但用于控制细菌污染同时，含抗生素，细胞生长不需要，但用于控制细菌污染n n此外，多数培养基含有此外，多数培养基含有pH pH 指示剂指示剂，酚红酚红哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本要求的基本要求n n一一、水水n n二、低分子量营养物质二、低分子量营养物质pp能量来源能量来源uu六碳糖六碳糖uu丙酮酸盐和核榶丙酮酸盐和核榶uu谷氨酰胺谷氨酰胺pp营养来源（氨基酸营养来源（氨基酸）pp维生素维生素pp离子离子pp微量元素微量元素pp脂类和磷脂前体脂类和磷脂前体pp核酸（核酸（DNADNA和和RNARNA）前体）前体n n三、无营养物质三、无营养物质pp抗生素抗生素pp缓冲缓冲体系体系pp酚红酚红pp保护剂保护剂pp抗氧化剂抗氧化剂pp还原剂还原剂 哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分n n一一、水水水质是至关重要的水质是至关重要的pp水纯化方法水纯化方法uu反渗透或蒸馏（去除主要的化学物质）反渗透或蒸馏（去除主要的化学物质）uu活性炭过滤（有机和无机杂质）活性炭过滤（有机和无机杂质）uu离子交换（微量的金属或离子）离子交换（微量的金属或离子）uu微孔滤膜（微生物污染）微孔滤膜（微生物污染）pp评估水的纯度评估水的纯度uu电阻电阻uu标准：标准：2525C C时，时，20 20 McmMcm哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分n n二二、低分子量营养物质低分子量营养物质1 1、能量、能量来源来源p6碳糖(5-20mM):除了glucose,也可以为细胞提供半乳糖和果糖等。在大多数细胞的膜上存在的是Glut1单糖转运载体，同时也有一定数量的Glut2,Glut3等，负责转运其他不同种类的单糖，如果添加其他种类的单糖有助于调节glucose的转运速度，降低lactate的生成，维持pH稳态。但是Glut5仅存在于一些特殊种类的细胞上，负责转运Fructose入胞。p丙酮酸盐,核榶哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分p谷氨酰胺(1-20mM)，37度的半衰期t1/2=8days，终产物是游离的胺类物质，具有细胞毒性;哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分L-Glutamine属于温度敏感性氨基酸，降解迅速n n2 2、营养营养来源（氨基酸）来源（氨基酸）主要分为EAA，NEAA哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分n n3 3、维生素哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分维生素包括：n n4 4、离子哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分几种常见培养基的离子浓度（M）：n n5 5、微量元素哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分n n6 6、脂肪酸哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分无血清脂肪酸添加物组合预混试剂SupplementsSuppliersContentsNuserumCo.LabsSerum formulation replacementCPSR-1SigmaSerum formulation replacementCPSR-3SigmaSerum formulation replacementCDGibcoMixture of defined formulation of fatty acidLipid ConsKabi Bitrum Inc.Mixture of LipidsLipid Mix-1Neuronbc Inc.Mixture of fatty acidLipid Mix-2Neuronbc Inc.Mixture of fatty acidn n7 7、核核酸哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分l通常不是基础培养基的必需成分l当叶酸不足时，可添加嘌呤和胸苷n n三三、无营养物质无营养物质 1 1、抗、抗 生素生素 细胞细胞生长不需要，但用于控制细菌污染生长不需要，但用于控制细菌污染n n2 2、缓冲液缓冲液pp一般采用碳酸氢根（一般采用碳酸氢根（HCO3HCO3），与培养环境中的，与培养环境中的CO2CO2（5 510%10%）共同形成缓冲体系共同形成缓冲体系哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分n n2 2、缓冲液缓冲液pp通常通常会向培养基中添加有机缓冲剂会向培养基中添加有机缓冲剂HEPESHEPES（pH 7.0pH 7.0）哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分n n2 2、缓冲液缓冲液哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分培养液pH值与培养环境中CO2压力的关系n n3 3、酚红酚红p用作pH指示剂p会干扰纯化哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分n n4 4、抗剪切力保护系统哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分n n5 5、抗氧化保护剂哺乳动物哺乳动物细胞培养基细胞培养基的基本成分的基本成分6、还原剂l l国家国家化工行业标准化工行业标准哺乳类动物细胞培养基哺乳类动物细胞培养基（HG/T 3935-2007HG/T 3935-2007）中）中的七项检验的七项检验指标指标:细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法干燥减重的质量分数干燥减重的质量分数5Dryingloseweight5pH渗透压渗透压osmoticpressure微生物限度微生物限度:Microbiallimit细菌细菌200CFU/gbacterium200CFU/g霉菌霉菌50CFU/gMould50CFU/g内毒素内毒素10EU/mlEndomycin10EU/ml细胞生长细胞生长Cellgrowth澄清度澄清度Clarity细胞培养基细胞培养基CellCultureMediuml哺乳细胞无血清培养基应符合以下技术要求项目项目指标指标澄清度澄清度澄清澄清pH值（每升标示量值（每升标示量/L）3.07.0干燥减重的质量分数（干燥减重的质量分数（%）5.0渗透压（渗透压（mOsm/kgH2O）225290细菌内毒素（细菌内毒素（EU/ml）10微生物限度微生物限度细菌数（CFU/g）200霉菌数（CFU/g）50细胞生长试验细胞生长试验细胞形态正常正常细胞生长试验合格合格细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法l l考虑考虑到生物制品的质量和安全性对细胞培养基这种原材料的要求到生物制品的质量和安全性对细胞培养基这种原材料的要求，个人认个人认为，若条件许可，应为，若条件许可，应增加增加了对细胞培养基了对细胞培养基中中支支原体污染原体污染、牛牛血清白蛋白残血清白蛋白残留量留量、抗生素残留量抗生素残留量检测。检测。细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法l1、澄清度检查称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录IX B澄清度检查法进行。l2、pH值的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录VI H pH值测定法进行。l3、干燥减重的测定中华人民共和国药典2010版二部附录VIII L干燥失重测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法l4、渗透压的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录IX G渗透压摩尔浓度测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。l5、细菌内毒素的测定按中华人民共和国药典2010版二部附录XI E细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。称取1/100每升标示量的实验室样品，精确至0.0001g，加入细菌内毒素检查用水（市售）10ml溶解，吸取该溶液0.1ml加细菌内毒素检查用水（市售）3.9ml，混匀即得试验溶液。细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法l6、微生物限度的测定按中华人民共和国药典2010版二部附录XI J微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。称取实验室样品1g，精确至0.01g，加入无菌纯化水10ml溶解，混匀即得试验溶液。细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法l7、细胞生长试验按中华人民共和国药典2010版二部附录XI E细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。7.1 方法提要（以无血清培养基为例）l本试验所用器具及溶液均为无菌，试验操作过程均为无菌操作。l细胞在37恒温条件下，在不含血清的细胞培养中生长168 h，观察细胞形态并进行细胞计数，计算存活率。7.2 试剂和材料l悬浮的CHO-s细胞。l细胞培养液：按产品使用说明书要求配制。lPBS溶液：称取十二水磷酸氢二钠3.4949g，无水磷酸二氢钾0.2g，氯化钾0.2g，氯化钠8.0g，精确至0.001g；加纯化水1L，混匀，过滤除菌。l 0.4%台盼蓝染色液（工作液的10倍母液）：称取0.4g台盼蓝染料，加100ml PBS溶液溶解，滤纸过滤，4保存。细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法7.3 仪器l医用净化工作台，洁净级别为百级。lCO2培养箱：能在371恒温。l三角摇瓶：100ml，无菌。l显微镜：倒置、相差。l血球计数板。l血盖片：与血球计数板配套使用。7.4 试验步骤l制备接种细胞悬液取一定量的细胞悬液，离心，去上清，用PBS溶液洗细胞一次，离心，加入适量的待测培养液重悬。根据细胞量确定稀释倍数，再根据稀释倍数取适量悬液稀释，同时以0.4%台盼蓝染色液染色，染色3分钟（不能超过10分钟）。稀释后的样品在血球计数板四个大方格中的细胞数应该保证50150个/大方格，四个大方格的总数应大于200个。可用于检测培养基的细胞，活率应高于90%。根据以上计数结果，将细胞悬液用待测培养液稀释至3105cells/ml，即得接种细胞悬液。细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法7.4 试验步骤（续）l细胞培养和计数每个样品接种3瓶，细胞接种密度均为3105cells/ml，活率在90%以上，于37CO2培养箱中90rpm转速下连续培养168h。每24h取样检测，在显微镜下观察细胞形态是否正常，并进行细胞计数，计数方法同6.7.4.1，计算各时间点每毫升悬液的总细胞数、活细胞数以及细胞活率。根据细胞量确定稀释倍数，再根据稀释倍数取适量悬液稀释，同时以0.4%台盼蓝染色液染色，染色3分钟（不能超过10分钟）。稀释后的样品在血球计数板四个大方格中的细胞数应该保证50150个/大方格，四个大方格的总数应大于200个。l分析结果的表述培养168h的细胞形态应为正常形态，168h内细胞密度应达到8106cells/ml，活率应为85%以上。细胞培养基质量指标及检测方法细胞培养基质量指标及检测方法Thank you！The END