AKP活性检测27日教学课件2

AKPAKPAKPAKP活性检测活性检测活性检测活性检测27272727日日日日蛋白检测指标蛋白检测指标1 1 1 1、质、质、质、质活活 性性分子量分子量定定 性性结结 构构2 2 2 2、量、量、量、量表达产率表达产率获得产量获得产量蛋白浓度蛋白浓度纯纯 度度根据蛋白的特性根据蛋白的特性根据蛋白的特性根据蛋白的特性WesternWesternWesternWestern，测序等，测序等，测序等，测序等电泳，分子筛，沉降系数等电泳，分子筛，沉降系数等电泳，分子筛，沉降系数等电泳，分子筛，沉降系数等光光光光/色谱，晶体衍射等色谱，晶体衍射等色谱，晶体衍射等色谱，晶体衍射等分光，分光，分光，分光，凯氏定氮等凯氏定氮等凯氏定氮等凯氏定氮等电泳，沉降、晶体衍射等电泳，沉降、晶体衍射等电泳，沉降、晶体衍射等电泳，沉降、晶体衍射等1 1、酶活测定：底物显色法、酶活测定：底物显色法AKP405nm405nm有特征吸收有特征吸收本实验本实验410nm410nm测定测定ODOD值值pNPPpNPP（对硝基酚磷酸）（对硝基酚磷酸）无色无色PiPipNP pNP（对硝基酚）（对硝基酚）黄色黄色Na3PO4比尔比尔-朗伯定律：朗伯定律：OD=LC pNP=17500L mol-1 cm-1 C:光吸收物质的浓度（光吸收物质的浓度（molL-1）L:光路长度（光路长度（cm）1 1、酶活测定：底物显色法、酶活测定：底物显色法（其中（其中n n为稀释倍数）为稀释倍数）酶活力单位数酶活力单位数 注注:通过调整稀释倍数控制通过调整稀释倍数控制ODOD410410在在0.10.10.80.8之间之间3030反应反应10min10min加入加入3.6ml3.6ml终止液终止反应终止液终止反应于于410nm410nm处测定吸光值处测定吸光值4040L L酶液酶液360360L L测活液测活液+实验操作实验操作1.1.菌体加入菌体加入15mL15mL匀浆液匀浆液2.2.超声破碎：超声破碎：输出功率输出功率1200w1200w，超声，超声2 2秒，秒，间隔间隔1010秒，超声次数：秒，超声次数：4040次次3.3.粗匀浆制样：粗匀浆制样：细胞破碎液细胞破碎液 200uL 200uL 4x 4x 样品处理液样品处理液100uL+100uL+匀浆缓冲液匀浆缓冲液100uL 100uL 9090变性变性5min5min，室温保存准备室温保存准备SDSSDS电泳用。电泳用。4.4.匀浆上清制备：匀浆上清制备：另取另取1.0 mL1.0 mL细胞破碎液，细胞破碎液，4,12000rpm10min4,12000rpm10min离心，留上清液离心，留上清液5.5.上清液制样：上清液制样：匀浆上清匀浆上清 200uL 200uL 4x 4x 样品处理液样品处理液100uL+100uL+匀浆缓冲液匀浆缓冲液100uL 100uL，9090变性变性5min5min，室温保存准备室温保存准备SDSSDS电泳用。电泳用。一、细胞破碎与制样一、细胞破碎与制样组别组别空白空白零对照零对照空载体表达空载体表达阴性对照阴性对照(蓝斑蓝斑)pETBlue-AKPpETBlue-AKP阳性对照阳性对照AKPAKP表达表达粗匀浆粗匀浆上清上清粗匀浆粗匀浆上清上清匀浆液匀浆液（uLuL）40400 00 00 00 00 0粗匀浆粗匀浆（uLuL）0 0404040400 040400 0离心上清离心上清（uLuL）0 00 00 040400 04040测活液测活液（uLuL）360360360360360360360360360360360360室温反应室温反应10min10min终止液终止液（mLmL）3.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.6ODOD410410酶的活力酶的活力二、二、AKPAKP酶活性分析酶活性分析u自然胶电泳；自然胶电泳；u变性胶电泳变性胶电泳u等电聚焦等电聚焦u梯度胶电泳梯度胶电泳u印迹转移电泳印迹转移电泳u双向电泳双向电泳2 2、分子量测定：、分子量测定：SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳SDS-PAGE变性胶电泳用途：变性胶电泳用途：亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等凝胶电泳的分类：凝胶电泳的分类：丙烯酰胺丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺TEMED(TEMED(加速剂加速剂)APS(APS(过硫酸铵过硫酸铵,催化剂催化剂)聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶酰胺凝胶T T分离范围（分离范围（KD)KD).T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度 -改变改变T值改变胶孔径值改变胶孔径一般按一般按a:b=29:1 或或a:b=29.2：0.8配制储液配制储液a：丙烯酰胺的量：丙烯酰胺的量 b：甲叉丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺m：溶液的总体积：溶液的总体积C：表示交联剂所占百分比：表示交联剂所占百分比a+ba+bT T=m m*100%*100%C C b b a+b a+b*100%*100%=PAGEPAGE凝胶电泳原理凝胶电泳原理SDS-PAGE SDS-PAGE 的的 浓浓 缩缩 效效 应应电泳体系为不连续体系电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由凝胶也由PHPH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成凝胶孔径均不相同的两层胶组成电荷效应：电荷效应：ClCl的快速泳动在其后面形成低电导、的快速泳动在其后面形成低电导、高电压梯度区带动高电压梯度区带动PrPr和和GlyGly快速泳动，这样在快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，高电压与低电压区形成界面，PrPr浓缩成狭小薄浓缩成狭小薄层层GlyGly 、PrPr 、ClCl分离胶分离胶 pH pH 8.88.8（12%12%）Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3浓缩后的样品浓缩后的样品浓缩胶浓缩胶 pH 6.8 pH 6.8（4%4%）未浓缩的样品未浓缩的样品SDS-PAGE SDS-PAGE 的的 浓浓 缩缩 效效 应应SDS-PAGESDS-PAGE的变性作用的变性作用wSDSSDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键w巯基乙醇或二硫苏糖醇（巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)DTT)的作用使蛋白质分子中的的作用使蛋白质分子中的二硫键打开二硫键打开 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDSSDS形成蛋白质形成蛋白质SDSSDS复合物复合物w由于由于SDSSDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷wSDSSDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE中，中，中，中，SDSSDSSDSSDS蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关-分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应实验操作实验操作1.1.洗净洗净胶板，架好和固定好胶板胶板，架好和固定好胶板2.2.配置配置12%12%分离胶（分离胶（20mL20mL）3.3.分离胶混匀后用分离胶混匀后用5mL5mL枪头加入两玻枪头加入两玻 璃夹缝中，并璃夹缝中，并小心在胶面上加入小心在胶面上加入 1cm 1cm蒸馏水蒸馏水，3737约约202040min40min后胶自然凝聚后胶自然凝聚4.4.配制配制4%4%浓缩胶（浓缩胶（10mL10mL），浓缩胶混匀后，），浓缩胶混匀后，迅速迅速倾斜倒出蒸倾斜倒出蒸 馏水，将浓缩胶加入两玻璃夹缝馏水，将浓缩胶加入两玻璃夹缝5.5.在两玻璃板夹缝中垂直插入在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm1.5mm的梳子的梳子，浓缩胶凝固后将，浓缩胶凝固后将凝胶装入电泳槽，在槽中加入凝胶装入电泳槽，在槽中加入1SDS1SDS电极缓冲溶液，小心拔出电极缓冲溶液，小心拔出梳子梳子AKPAKP的的SDSSDSPAGEPAGE电泳电泳1).1).电泳加样：电泳加样：将制备好的样品将制备好的样品点甩离心后，点甩离心后，按顺序向胶孔中加入适当体按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品（积的蛋白样品（20uL-30uL20uL-30uL）和分子量）和分子量MarkerMarker（10uL10uL）。）。（注意：同时进行顺序和样品完全一致的两组胶的电泳，（注意：同时进行顺序和样品完全一致的两组胶的电泳，以备分别进行染色和以备分别进行染色和Western blottingWestern blotting分析）分析）2).2).电泳：电泳：浓缩胶部分电泳条件：浓缩胶部分电泳条件：80V80V恒压电泳；恒压电泳；分离胶部分电泳条件：分离胶部分电泳条件：120V120V恒压电泳。恒压电泳。当溴酚蓝移动到前沿时，切断电源，停止电泳当溴酚蓝移动到前沿时，切断电源，停止电泳 从电泳槽中取出胶板，小心剥离凝胶，并将凝胶切成两部分。从电泳槽中取出胶板，小心剥离凝胶，并将凝胶切成两部分。其中：一部分用其中：一部分用R R250250染色、脱色和观察结果染色、脱色和观察结果 另一部分准备免疫印迹另一部分准备免疫印迹6 6、电泳、电泳1).1).染色：染色：将胶置于将胶置于20mL20mL的的R250R250染色液染色液中染色中染色2h2h3).3).脱色：脱色：将胶转移至将胶转移至20mL20mL的的脱色液脱色液中脱色中脱色1.5h1.5h，以目的条带以目的条带清晰显示为准清晰显示为准3).3).观察结果：观察结果：凝胶成像仪照相并保存结果凝胶成像仪照相并保存结果4).4).胶的保存：胶的保存：将胶转移至将胶转移至20mL20mL的的保存液保存液中，可常温保存很长时间。中，可常温保存很长时间。7 7、染色、脱色与保存、染色、脱色与保存空载体空载体离心后离心后离心前离心前M MKd Kd 97976666535336361414n 印迹印迹(blotting)blotting)是是7070年代中后期出现的一种生化技术年代中后期出现的一种生化技术n 印迹类似于吸墨迹的过程印迹类似于吸墨迹的过程n 它常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交它常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交及许多灵敏的检测技术相匹配而进行及许多灵敏的检测技术相匹配而进行n 广泛应用于广泛应用于DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大分子的研究多种生物大分子的研究 电泳电泳 转膜转膜 固定固定/封闭封闭 抗体结合抗体结合 检测检测3 3、蛋白定性：、蛋白定性：Western BlottingWestern BlottingWestern Blotting Western Blotting 基本流程基本流程P1:P1:凝胶电泳凝胶电泳P2:P2:转膜转膜(印记）印记）P3:P3:封闭封闭P4:P4:结合一抗结合一抗P5:P5:结合酶标二抗结合酶标二抗P6:P6:显色显色1）印记方式：）印记方式：虹吸作用转移虹吸作用转移 电转移电转移 真空转移真空转移 斑点斑点/狭缝印记狭缝印记2）膜与蛋白结合方式）膜与蛋白结合方式：非非非非共价结合共价结合共价结合共价结合半干式转移装置半干式转移装置 滤滤纸纸凝胶凝胶NCNC膜膜P2:P2:转膜转膜(印记）印记）3）膜的种类）膜的种类：硝酸纤维素膜（：硝酸纤维素膜（NCNC膜膜膜膜）尼龙膜尼龙膜尼龙膜尼龙膜印迹在印迹在NCNC膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。一般膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。一般经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。一抗一抗对抗原是特异的。酶标二抗是商品化的，对某种动物的一对抗原是特异的。酶标二抗是商品化的，对某种动物的一抗都可以反应。抗都可以反应。二抗二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、生物素、同位常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、生物素、同位素等标记。辣根过氧化物酶的底物有素等标记。辣根过氧化物酶的底物有DABDAB（二氨基联苯氨），（二氨基联苯氨），OPD(OPD(邻苯二氨）等邻苯二氨）等P4-P6:P4-P6:结合一抗，结合酶标二抗，显色结合一抗，结合酶标二抗，显色膜膜蛋白蛋白一抗一抗HRPHRPHRPHRP酶标二抗酶标二抗H H2 2O ODAB-HDAB-H+H H2 2O O2 2DABDAB+显色显色(四甲基二氨基联苯氨四甲基二氨基联苯氨)1.阴性对照阴性对照2.实验组匀浆实验组匀浆4.阳性对照阳性对照3.实验组上清实验组上清 1 2 3 4实验操作实验操作P1:P1:凝胶电泳凝胶电泳P2:P2:转膜转膜(印记）印记）P3:P3:封闭封闭P4:P4:结合一抗结合一抗P5:P5:结合酶标二抗结合酶标二抗P6:P6:显色显色AKPAKP的的Western BlottingWestern Blotting1.1.另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少泡至少3030分钟分钟（甲醇的作用）（甲醇的作用）2.2.正极上铺三层和凝胶正极上铺三层和凝胶一样大小一样大小的滤纸，然后依次将硝酸纤维的滤纸，然后依次将硝酸纤维素（素（NCNC）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸干干“三明治三明治”样结构周围的印迹缓冲液，并压上负极样结构周围的印迹缓冲液，并压上负极（注意不要有气泡注意不要有气泡）(短路与断路短路与断路)3.3.恒流恒流1.0mA/cm1.0mA/cm2 2转移转移1.5hr1.5hr4.4.转移结束后将转移结束后将NCNC膜取出，膜取出，凝胶继续用凝胶继续用R R250250染色以便分析染色以便分析转移的完全程度转移的完全程度5.NC5.NC膜至于膜至于5%5%脱脂奶粉脱脂奶粉中，中，4 4度封闭一周，待用。度封闭一周，待用。半干式转移装置半干式转移装置 滤滤纸纸凝胶凝胶NCNC膜膜非特异结合非特异结合6.6.一抗结合一抗结合：倒去倒去封闭液，封闭液，加入一抗（加入一抗（1xPBS 1xPBS 按按1 1：100100稀释稀释）37370 0C C轻轻摇动轻轻摇动，孵育，孵育60min60min7.7.漂洗漂洗：1xPBS1xPBS清洗清洗3 3次次(每次漂洗每次漂洗5min)5min)8.8.二抗结合二抗结合：按按 1 1：10001000稀释二抗（偶联辣根过氧化物酶）稀释二抗（偶联辣根过氧化物酶）37370 0C C轻轻摇动轻轻摇动，孵育，孵育60min60min9.9.漂洗漂洗：1xPBS1xPBS清洗清洗3 3次次(每次漂洗每次漂洗5min)5min)10.10.显色显色：用显色液显色至出现清晰条带，用显色液显色至出现清晰条带，加水加水冲洗终止显色反应冲洗终止显色反应6.6.到去封闭液，加入到去封闭液，加入1xPBS1xPBS稀释的一抗（稀释的倍稀释的一抗（稀释的倍数为数为ELISAELISA所测效价的所测效价的1/101/10），加入的一抗工作液），加入的一抗工作液覆盖住膜即可。覆盖住膜即可。370C370C轻轻摇动，孵育轻轻摇动，孵育45min45min7.1xPBS7.1xPBS清洗清洗3 3次后次后(每次漂洗每次漂洗5min)5min)，加入按，加入按 1 1：500500倍稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗。倍稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗。370C370C轻轻摇动，孵育轻轻摇动，孵育45min45min8.1xPBS8.1xPBS清洗清洗3 3次次(每次漂洗每次漂洗5min)5min)，用显色液显色，用显色液显色至出现清晰条带，加水冲洗终止显色反应至出现清晰条带，加水冲洗终止显色反应肇庆代办公司注册 zqanju 卯雪晴嵁41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸收都不可耻。阿卜日法拉兹42、只有在人群中间，才能认识自己。德国43、重复别人所说的话，只需要教育；而要挑战别人所说的话，则需要头脑。玛丽佩蒂博恩普尔44、卓越的人一大优点是：在不利与艰难的遭遇里百折不饶。贝多芬45、自己的饭量自己知道。苏联