细胞免疫荧光技术

细胞免疫荧光技术细胞免疫荧光技术实验目的实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理掌握免疫荧光技术的基本原理掌握免疫荧光技术的基本原理掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法熟悉细胞免疫荧光技术的方法熟悉细胞免疫荧光技术的方法熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如何了解在免疫细胞化学技术中如何了解在免疫细胞化学技术中如何了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果获得好的实验结果获得好的实验结果获得好的实验结果实验原理实验原理原位检测原位检测抗原抗体特异反应抗原抗体特异反应间接法间接法 间接荧光抗体染色法示意图抗原抗原抗体抗体荧光素标记荧光素标记的抗抗体的抗抗体激发光激发光显示荧光显示荧光Hela细胞细胞Vinculin实验用品实验用品试剂：试剂：固定液：固定液：4%PFA细胞通透：细胞通透：0.2%TritonX封闭试剂：封闭试剂：10%正常山羊血清正常山羊血清一抗：小鼠源抗一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体单克隆抗体二抗二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠标记的山羊抗小鼠IgGDAPI（4,6-二脒基二脒基-2-苯基吲哚）苯基吲哚）PBS洗涤缓冲液：洗涤缓冲液：PH7.4材料：材料：Hela细胞细胞细胞培养皿细胞培养皿仪器：仪器：荧光显微镜荧光显微镜实验步骤实验步骤 一，细胞制备和细胞固定一，细胞制备和细胞固定将细胞铺在将细胞铺在24孔板中孔板中将细胞培养将细胞培养至所需密度至所需密度加入加入4%PFA固定固定10min染色染色或保存或保存PBS洗涤洗涤PBS洗涤洗涤实验步骤实验步骤 二，细胞免疫荧光二，细胞免疫荧光ICC染色染色0.2%TritonX处理处理5min 封闭封闭室温室温30min4过夜过夜371-2小时小时375-10min荧光显微镜荧光显微镜观察观察加入一抗加入一抗加入二抗加入二抗加入加入DAPI复染复染PBS洗涤洗涤PBS洗涤洗涤PBS洗涤洗涤实验结果实验结果三，观察三，观察humanHeLacells实验中应注意的问题实验中应注意的问题 细胞不要铺的过密细胞不要铺的过密:60-70%防止细胞污染防止细胞污染 固定时间不要太长固定时间不要太长,一般一般10-30minTrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 选择合适的封闭液选择合适的封闭液 二抗孵育后二抗孵育后,一定要洗干净一定要洗干净 必要时用恒温摇床摇洗必要时用恒温摇床摇洗 1.1.免疫荧光技术免疫荧光技术 2.2.免疫酶技术免疫酶技术 3.3.免疫亲和技术免疫亲和技术 4.4.胶体金技术胶体金技术 标记物标记物 使抗体或抗原使抗体或抗原 抗体复合物在抗体复合物在 各种显微镜下各种显微镜下 可见的物质可见的物质免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术注意事项免疫细胞化学技术注意事项 选择合适的方法选择合适的方法 材料要留好材料要留好 选择抗体选择抗体 选择标记酶选择标记酶 封闭液的选择封闭液的选择 设定对照实验设定对照实验思考题思考题检测检测Hela细胞中蛋白细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法，定位情况，思考应选择什么方法，用什么仪器观察？用什么仪器观察？A疑难解答疑难解答一，缺乏染色一，缺乏染色一，缺乏染色一，缺乏染色 可能的原因可能的原因 无抗原无抗原 抗体失效抗体失效 固定不充分固定不充分 过度固定过度固定 抗原修复无效抗原修复无效 不兼容的二抗和一抗不兼容的二抗和一抗 漏用试剂或未按正确的顺序漏用试剂或未按正确的顺序 加入试剂加入试剂相应的措施相应的措施 用原位杂交方法检测蛋白表达用原位杂交方法检测蛋白表达 按说明书储存抗体按说明书储存抗体;分装抗体分装抗体;避免反复冻融避免反复冻融 增加固定时间或改用不同的固定剂增加固定时间或改用不同的固定剂 减少固定时间减少固定时间;抗原修复抗原修复 增加修复时间或更换修复液增加修复时间或更换修复液 使用可以与一抗结合的二抗使用可以与一抗结合的二抗 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序二，高背景二，高背景可能的原因可能的原因 一抗或二抗的浓度过高一抗或二抗的浓度过高 一抗和一抗和/或二抗与组织的或二抗与组织的 非特异性结合非特异性结合 组织过于干燥组织过于干燥 试剂粘附在旧的试剂粘附在旧的 或未制备好的玻片上或未制备好的玻片上相应的措施相应的措施预实验摸索最佳浓度预实验摸索最佳浓度一抗孵育前封闭一抗孵育前封闭 (最好是二抗来源的血清最好是二抗来源的血清)在染色过程中避免组织干燥在染色过程中避免组织干燥用新鲜制备或购买的玻片进行实验用新鲜制备或购买的玻片进行实验三，细胞三，细胞/组织的形态被破坏组织的形态被破坏可能的原因可能的原因 抗原修复方法过于剧烈抗原修复方法过于剧烈 组织切片从玻片上脱落组织切片从玻片上脱落 组织切片撕裂或褶皱组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡切片下有气泡 组织形态难以分辨组织形态难以分辨 组织固定不充分组织固定不充分,自发裂解自发裂解相应的措施相应的措施 预实验摸索合适的修复条件预实验摸索合适的修复条件 增加固定时间增加固定时间;烤片烤片;使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片 使用锋利的刀片使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域分析时避开受损的区域 切片薄一些切片薄一些;冰冻过程形成冰晶冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水蔗糖脱水 及时固定及时固定;增加固定时间增加固定时间;提高固定剂提高固定剂/组织的比例组织的比例;将组织切得较小将组织切得较小四，染色不正确四，染色不正确可能的原因可能的原因 固定方法对于抗原不合适固定方法对于抗原不合适 抗原修复方法不合适抗原修复方法不合适 没有及时固定引起抗原的扩散没有及时固定引起抗原的扩散相应的措施相应的措施 尝试不同的固定剂或增加固定时间尝试不同的固定剂或增加固定时间 尝试改变抗原修复条件尝试改变抗原修复条件 立即固定组织立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换尝试用交联性固定剂替换 有机有机(醇类醇类)固定剂固定剂