动物基因组DNA的分离定量叶

实验一、动物基因组 DNA的分离 实验目的：通过本实验了解并掌握 提取基因组 DNA的原理和步骤。 分离纯化核酸总的原则 ： 应保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求 ： 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过 高浓度的金属离子； 排除其它核酸分子的污染； 其它生物大分子的污染应降低到最低程度。 实 验 目 的 通过实验学习从动物组织中制备染色体 DNA的方 法。 学习琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA的纯度、 DNA的 构型、含量以及分子量的大小。 掌握 DNA样品的纯化和定量检测方法。 组织裂解液裂解细胞 : SDS能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸。 EDTA可抑制 DNA酶的活性。 NaCl; TrisHCl;EDTA； SDS ；蛋白酶 K；无 DNA酶的 RNA 酶 实 验 原 理 用蛋白酶 K水解蛋白质 蛋白酶 K具有广泛的切割活性，可消化细胞，降解 蛋白质。 有机溶剂酚、氯仿抽提 苯酚使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。 氯仿加速有机相与液相分层，最后用氯仿抽提可去除核酸溶 液中的迹量酚。 异戊醇减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡；有助于分相。 在高盐条件下，用乙醇沉淀 DNA DNA不溶于乙醇，乙醇可以沉淀 DNA。 NaAc： Na+中和 DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的 同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀 ;调节 PH值接近 DNA等电 点 ； 再用 70%乙醇洗除沉淀中的盐分 即可获得染色体 DNA 酚：氯仿：异戊醇（ 25： 4： 1） 70%乙醇 TE buffer RNAse 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统 实 验 材 料 溶液与缓冲液 匀浆缓冲液 STE： 100 mmol/L NaCl 10 mmol/L TrisHCl， pH 8.0 25 mmol/L EDTA， pH 8.0。 消化缓冲液 ： 100 mmol/L NaCl 10 mmol/L TrisHCl， pH 8.0 25 mmol/L EDTA， pH 8.0 0.5% SDS （临用前加）。 0.1 mg/mL 蛋白酶 K（临用前加）。 无 DNA酶的 RNA酶 (10 mg/L)：将胰 RNA酶溶于 10 mmol/L TrisHCl， pH 7.5， 15 mmol/L NaCl溶液中，使浓度为 10 mg/L，于 100 水浴处理 15 min，以降解 DNA酶，缓慢冷 却到室温， 20 保存。 TE缓冲液 ： 10 mmol/L TrisHCl， pH 8.0 1 mmol/L EDTA， pH 8.0 平衡酚 :氯仿 :异戊醇 25:24:1（体积比）。 3 mol/L NaAc， pH 5.2：称取 408 g NaAc3H2O溶于水，用 3 mol/L乙酸调节至 pH 5.2。 无水乙醇。 70冷乙醇 实验步骤： DNA提取 1.材料准备 2.破碎细胞或包膜内容物释放 3.核酸分离、纯化 4.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 5.核酸溶解在适量缓冲液或水中 1、先将动物组织进行预处理：大的器官应该切成易处理的小 块（ 1 cm3）以便冻存（用液氮）及处理。任何组织都可采用， 但是，如需肝脏，在杀动物之前应该禁食 24 h，可提高 DNA的质 量。收集的组织可以在 70 下保存几年。 2、取 0.2 g组织块剪碎后，加入 2.0 mL匀浆缓冲液，用组织 匀浆器匀浆至无明显组织块存在（冰浴操作）。 3、将组织细胞的匀浆液体转移至 2.0 mL离心管中， 4、加入蛋白酶 k ，轻轻反转混匀， 37 温育 12 18 h。温育 结束前 1h加 RNAe至终浓度 200 g/mL 5、 加入等体积酚氯仿异戊醇 （ 25： 4： 1）等体积抽提 13 次 ，缓慢颠倒离心管使两相均匀混合形成乳浊液，静置 3min。 12000 rpm，离心 5分钟 ,扩口吸头小心吸出离心管中的上层液 体，即为含 DNA的水相，注意不要吸中间界面上一层厚的白色 物质（蛋白质沉淀）。 6加入 1/10倍体积 3M NaAc（ pH5.2）， 2倍体积无水乙醇 充分 混匀 ， -20 下 15-20min。 7 415000 rpm ，离心 min。 8 DNA沉淀用冰预冷 70 %乙醇洗 1次，开盖 37 干燥 10min （使乙醇挥发）。 9根据沉淀量加入 TE buffer， 37 水浴至沉淀溶解， 20 冰箱保存。 。 如果要对提取的 DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝胶。 方法是取 1 l溶解的 DNA样品，在 0.8的琼脂糖凝胶中进 行电泳，用 dured染色观察结果。 10取 1l DNA 0.8 %琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记 录和分析结果，估计样品 DNA分子量。 11取 10 l DNA母液稀释至 1000ul，在紫外分光光度计 上测 A260和 A280。计算样品 DNA浓度，判断样品浓度和 DNA 纯度。 DNA制备注意事项 1.要颠倒摇动试管悬浮沉淀，不可用枪头 (尤其是没剪去枪头 尖端）吹打沉淀。 2.吸上清枪头使用前必须粗吸头（微量移液枪的枪头剪去尖端， 并用火烧一下，使之圆钝），避免机械剪切力对 DNA链 的损伤。 3.为了获得高分子量的 DNA，操作中必须防止混匀、抽提及 沉淀时剧烈机械震荡造成的 DNA的断裂。 4.如含有 RNA,可用 100ng/ml的 RNase在 37 水解至少半小时。 实验二 .DNA浓度与纯度的测定 DNA浓度的分光光度计测定 原理： 核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键，使相关化合物在 240-290 nm 的紫外波段有强烈的吸收峰， 最大吸收 值在 260nm左右 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线 特性，最大吸收值的波长为 250 270 nm之间。 实 验 原 理 OD260的应用： 1. DNA或 RNA的定量 : OD260= 1.0相当于 50 g/ml双链 DNA 40 g/ml单链 RNA 20 g/ml单链寡聚核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品 : OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品 : OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚， OD260/OD280降低 如果制备的 DNA样品 A260/A2802，说明样品中 RNA过高，可用 RNase消化后， 用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀 DNA； 如果样品 A260/A280为 1.82.0，说明样品中盐的含量过高， 样品沉淀后应用 70%乙醇多洗一遍。 也会出现既含蛋白质又含 RNA的 DNA溶液比值为 1.8的情况， 所以有必要结合凝胶电泳等方法检测有无 RNA，或用测定蛋 白质的方法检测是否存在蛋白质。 纯净的 RNA A260/A280=2.0,提取的 RNA样品 A260/A280应 大于 1.80。 RNA样品含有蛋白质会使 A260/A280比值下降 。 实验步骤： 1. 以 TE缓冲液为空白对照； 2. 将基因组 DNA溶液分别用 TE缓冲液稀释 50倍、 80倍、 100 倍至 4ml，分别测 OD260和 OD280 ； 3. 基因组 DNA浓度为： OD260 核酸稀释倍数 50 （ g/mL）；样品各稀释级别算得的浓度平均值，即作 为该样品的实际 DNA浓度。 4. 以 OD260/OD280初步判断提取基因组 DNA的纯度。 1.为防止读数漂移： 选用 TE缓冲液为溶剂（ PH一定，离子强度低） 合适的稀释浓度，保证吸光值在 0.1-1.5范围内 混合要均匀，无气泡和悬浮物，视窗干净 2.测定光吸收值时，用稀释 DNA样品的溶液做对照。 3.选择稀释要适当，应在检测范围之内。紫外分光 光度法只用于测定浓度大于 0.25 g/mL的核酸溶 液。 DNA定量注意事项 （二） DNA质量与浓度的琼脂凝胶电泳法测定 DNA带负电荷，阴极 阳极 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而 定，后者则主要与分子大小及其构型有关。 DNA分 子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中 向正极移动，在用电泳法测定 DNA分子大小时，应 当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一 定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要 由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨 率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛 效应相对增加而提高分辨率。 DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率取决于： 1. DNA分子的大小 DNA迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比 . 2. 琼脂糖浓度越大， DNA迁移率越低 3. DNA的构象 超螺旋环状 线状 开环状 4.凝胶中、电泳缓冲液中的溴化乙锭 降低 DNA的迁移率 5.电压： 低电压时，迁移率与电压成正比 适宜电压： 5-8V/cm 6.电泳缓冲液： 离子强度适中 主要： TAE, TBE， TPE PH 7.5-7.8 操作步骤 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却， EB(一 ) 根据被分离 DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度 线性 DNA的有效分离范围 kb 0.3 5 60 0.6 1 20 O.7 0.8 10 O.9 0.5 7 1.2 0.4 6 1.5 0.2 4 2.0 0.1 3 实验用 1.2琼脂糖。称取 1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 100mL 1xTAE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。 样品的制备：样品 +1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳： 5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相 溶 胶 凝胶冷却至 50 C，加 EB至终浓度 0.5g/ml (二 )凝胶板的制备： 取干净的有机玻璃内槽，将有机玻璃内槽的两端边缘封好 (一 定封严，不能留缝隙 )。 加梳子，倒胶： 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样 品梳子，将冷到 60 左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃 内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面 (注意不要形成 气泡 )。 凝胶凝固后取出梳子 待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机 玻璃内槽放在电泳槽内。注意： DNA样品孔应朝向负电极一端。 加缓冲液 加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面 1- 1.5毫米。 凝胶上样缓冲液（ 6 ） 蔗 糖 40 溴酚蓝 0.25 点 样 电 泳 注意观察溴酚蓝染液的迁移 紫外灯下观察电泳结果 照 相 电泳注意事项 1. 琼脂糖的质量： 琼脂糖（ agarose）是以质量较好的琼脂作原料制成的。 琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有 硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给 电泳带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼 脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼 脂糖是一种直链多糖，它由 D-半乳糖和 3， 6-脱水 -L-半乳糖 的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相 互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲 水性，不含有带电荷的基因，不引起 DNA变性，又不吸附被分 离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。 2. DNA分子的迁移率： 影响 DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了 决定于 DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压 大小、缓冲液 pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其 分子量的大小，采用一下措施： (1) 每次测定时，要有已知分子量的 DNA片段作为标准， 进行对照。电泳。 (2) 选择最合适的电泳条件。 (3) 提高分子筛效应，降低电荷效应。 3. EB染色 ： EB是核酸的显色剂，使用 EB对 DNA染色的 3种方法： (1) 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入 EB。 (2) 只在胶中加入 EB，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时 双手受 EB污染的可能。 (3) 在电泳结束后，取出凝胶，放在含有 EB的电泳缓冲液或 DDW 中浸染 10-30分钟。 EB为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。 用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让有 EB的面朝里，有 EB的废液和器皿不能随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。 DNA和 RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭 （ ethidiun bromide, EB）嵌入碱基平面之间后， DNA样品在 紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸 含量成正比。使用一系列已知的不同浓度 DNA溶液做标准对 照，可以比较出被测 DNA溶液的浓度。灵敏度可达 1 10 ng。 EB见光易分解，故应存棕色试剂瓶中于 4 条件下保存。染 色时也应避光。电泳后应立即染色观察或拍照记录。若不能 马上拍照，可用保鲜膜或塑料袋封好置于 4 下过夜，核酸带 型改变不大。 染色一般是在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为 0.5 g/mL的 EB，但是由于 EB带正电荷，中和核酸分子的负电 荷，同时它的嵌入增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢， 故不宜用于凝胶电泳测定核酸分子的大小。利用凝胶电泳 比较估计或测定样品 DNA的含量，也不适合在凝胶中直接 加入 EB，因此在凝胶中，游离的 EB分子向负极游动，会 使样品中前后各带染色不均匀，影响定量。故应在电泳后， 将凝胶浸入 0.5 g/mL的 EB水溶液中 10 min进行染色。 4溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用 ： 含有 50%蔗糖，可增加上样 DNA溶液的密度，以确保 DNA样品 沉入点样孔内，起 DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝 的电泳迁移位置相当于 300400bp双链线状 DNA。 5点样量 太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。 点样量太少，分辨不清，影响结果。 如果 DNA已经降解， DNA的带就会拖尾巴，或出现弥散性分 布，而不能形成清晰、紧凑的带纹，这样的 DNA样品不能用 于进一步研究。 比较样品 DNA条带与 DNA标准条带的亮度即可对样品 DNA进行 定量。肉眼（ 10 ng），但通过图像处理设备和凝胶分析软件， 分析，通过 DNA标准绘制出 DNA量与条带亮度的标准曲线，估 算出未知样品中的 DNA含量。 另外在比较时，应该考虑 DNA或 RNA样品中分子大小与标准对 照中核酸分子的长度。 不同大小的 DNA片段在凝胶中的迁移速度不同，据此，科研工作 者们便能判断 DNA的分子质量，其有无降解。同时，通过同已知 分子质量的标准 DNA片段之间的比较，还可以测定出随迁移的 DNA片段的分子质量。 荧光分析法灵敏快速，不但能测定浓度小于 0.25 g/mL 的样品，还可了解核酸样品中由于 RNA或非核酸类杂质的污 染而干扰紫外吸收的情形。但它的荧光强度决定于溴化乙锭 嵌入碱基中的多少，这与 DNA的超螺旋程度密切相关，标准 品与样品难以完全一致，并且还受其它影响荧光发光污染物 的影响。 准备一个对照，只放 TE缓冲液。 1、分光光度计提前 15 min 打开。 2、将 TE缓冲液转入紫外分光光度计的石英比色皿中，校 正零点。 DNA的样品的浓度为 OD260值 核酸稀释倍数 50 （ g/mL）； RNA的样品的浓度为： OD260值 核酸稀释倍数 40 （ g/mL） 。 注意：每次测定完必须用 TE缓冲液冲洗比色皿后，才能加 入第二个样品，以保证测定的准确性。 3、根据 DNA母液的浓度，即可计算出所用 DNA量的体积。 通过电泳检查 DNA质量，没降解的 DNA一般出现一条相对 集中的带，电泳方法见实验。 思 考 题 1. 实验中影响染色体 DNA完整的因素有哪些？如何 减少这些因素对完整性的影响？ 2. 如何判断提取的染色体 DNA样品的质量？ 3. 为了获得清晰的 DNA样品电泳图，在琼脂糖凝胶 电泳过程中应该注意哪些问题？ 4. 如何选择测量 DNA的合适的稀释倍数？ 5. 为什么需要对 DNA进行纯化