核医学其它体外分析分子核进展.ppt

,其它体外放射分析,含意：除RIA之外的一切体外放射分析，但它的应用有一定局限性。 一、竞争蛋白结合分析（CPBA）： 待分析物的结合剂：蛋白质 举例：TBG甲状腺素结合球蛋白甲状腺素 CBG皮质醇结合球pro皮质醇 SHBG性激素结合球pro皮质醇 内因子结合蛋白B12 视蛋白视黄醛 蛋白激酶CAMP、cGMP 牛乳蛋白酶、叶酸还原酶叶酸,方法：竞争性与RIA相同 优点：这些蛋白天然存在，来源丰富，制备简单，省时，方法学成熟易建立。 缺点： 比抗体的特异性差、灵敏度也差，为了提高特异性，须在样品制备上下功夫。如纯化，清除干扰物等，不够方便。 该类蛋白种类有限，应用范围受限，已有很多被RIA和IRMA取代。,二、放射受体分析RRA RRA与RBA的区别 含义：以受体为结合剂，利用竞争结合原理对配体进行体外分析。 受体的分类： 膜R：一般为水溶性配体（肽类激素、儿茶酚胺等） 胞内R：（浆or核），一般为脂溶性的配体（甲状腺素，类固醇） 受体样品的制备：与RBA相同。,标记品的要求： 要求配体标记前后生物活性不受影响。因为标记配体在RRA时活性往往是降低的。如125I标上一个不影响，如果有二个125I标上就有变化了。 RRA的优点： 1、R与L的结合反应快、瞬间完成、比RIA出结果快。 2、能反应L的生物学活性。如冬眠灵有多种衍生物，它们均能与特异抗体结合，但只有有生物活性的衍生物才能与受体结合，这种测定反应L的生物学活性，而不是免疫活性。所以研究物质结合与功能RRA占有相当的地位。,RRA的缺点： 1、灵敏度比RIA小10100倍，这是因为不同组织间得来的受体对配体的亲和力有差异，又难以寻找高亲和力的受体。 2、反应条件和环境严格，离子强度，温度、PH值要求高。 3、NSB结合容量大，亲和力又小，NSB较大,临床应用： 1、利用受体来测体内配体的含量。 2、测定体内抗受体抗体的量。 有些疾病发现体内存在着抗R的抗体（自身抗体），如Gtraves disease(TSH、甲状腺素R的抗体)；Insulin B型抗症（Ins R-Ab）、重症肌无力（乙酰胆硷受体抗体）。 这类受体的抗体有两类特征： 1、受体结合部位抗体（RAb）：当R与Ab成复合物时，复合物中的R可再与配体结合，即R的结合位点保留，但复合物却抑制配体与单独存在的游离R相结合。 2、受体非结合部位抗体（Ab）：它的特征是复合物对配体与R的结合无抑制作用。,三、酶的放射分析（REA） 1、酶的活性（力）分析 概念：酶活性（力）：指酶催化加速反应的能力。 表示法：浓度/时间（反应酶促反应速度的快慢） 酶的反应速度，可以是底物的消耗量或产物的生成量 单位：Kat：（催量）指在规定条件下，每秒钟酶催化1mol底物转变所需要酶的量。 旧单位：U；1 U=16.67kat 符号：底物用S表示， S*指标记的底物 酶用E表示 P产物 反应式：*S+E E*S E*P *P+E 经过一般时间，从反应液中分离出*P，测放。,*P的CPS 酶活性（力）的计算（kat）=- SAte *P的CPS 酶的比活力（kat/g）=- SAtew 可知以下几个量：t（分）：*P的放射性CPS；SA标记物的比活度；e仪器效率；W参加反应的酶的蛋白量（mg）。,优点: 1、灵敏度高（放射性标记品） 2、特性性强，由酶的专一性决定。 3、适用广，绝大多数酶可用此法。 缺点: 1、需高质量的定位标记物 2、分离方法复杂，难以自动化。 酶液制备： 标记物制备与选择 PH、激活或抑制剂的使用、温度、时间等（自学）,2、酶促同位素衍生物分析：实际上分析底物含量。,可计算待测物量 （底物）,注意：需要知道一个分子待测物能与标记试剂结合的分子比。如果用双同位素标记可以更准确。,3、酶的激动剂和抑制剂测定法： 原理：激动或抑制剂可加快或减慢酶促反应的速率，用系列浓度的激动或抑制剂与酶进行定时反应，分离产物测放射性，可计算出激动剂或抑制剂的量。 如磷酸吡哆醛能使酪氨酸脱羧基产生Co2，14C标记酪氨酸经磷酸吡哆醛作用产生14Co2，可计算磷酸吡哆醛的量。,4、放射酶促饱和分析法：与酶的底物分析相同,该法类同RIA的竞争，不同之处是E不断从E*S和ES中释放出来而再去与S反应，如果反应时间足够长，因*S与S为同一物，会均被转化为产物，失去竞争之间的函数关系，所以不能象RIA那样等待反应平衡，而应该在一定时间就得分离测定。 这是它的关键（特点之一） 5， ELISA：固相酶标记-免疫分析 待测抗原固相化，然后与酶标记的抗体结合形成复合物，最后不测放射性而是让酶显色计算物质含量。,6、整体酶活力测定及应用 二氧化碳呼气试验： 用14C或13C等标记酶的底物，如经过酶的作用，其产物中可收集到CO2等，反映酶活力。 应用：幽门螺杆菌可产生尿素酶。 如果胃内有幽门螺杆菌，可将14C标记的尿素分解为14CO2。因此有了呼气14CO2。检测幽菌的检验。,7、其它体外分析的新进展 化学发光分析（CLIA）： 如发光剂鲁米诺经氧化剂H2O2和催化剂（HRP）作用下放出光子（发光） 特点： a、用发光物质代替放素建立的免疫分析。 b、试剂盒稳定性更好，发光物用特殊处理后才发光。 c、无放射性污染 d、设备相对简单（仍昂贵，但RIA也贵） e、发光效率与温度有关，须配备恒温设备 f、 临床上可应用项目有限，价格高于RIA,时间分辨荧光免疫分析（TrFIA） 概念：稀土元素：稀土元素不是土,是周期表中5771号元素的总称，现又新发现二个钪、钇，共计17个元素。 如果用稀土元素标记化合物，而这些稀土元素如Eu（铕）、Tb（铽）Te、Sm（钐）、Dy（镝）等可发射荧光，在紫外线激发下其发光能谱和发光时间相对集中而稳定。而干扰因素的本底发光寿命很短，可将标记物放置短时间，待本底光暴光后再去测量稀土荧光，所以叫时间分辨。必要时其发光还可做些增效处理。,该方法优点： 1、灵敏度高，特异性强 2、出结果快 3、样品荧光能重现 4、无放射性污染 缺点：仪器价格贵 配套试剂制备困难,免疫PCR 原理：用DNA做标记物，用PCR法扩增产物上的DNA，通量测定DNA的量进行定性研究。 基本反应： 1）将待测物抗原固化试管底部 2）加入生物素标记的特异抗体Ab-b 3）加入亲和素A做为连接分子 Ag+Ab-b+AAgAb-b-A 4）再加入生物素标记的DNA-b 得AgAb-b-A-b-DNA 引物 PCR扩增 染色 记录PCR扩增的DNA量确定Ab的含量。,优点： 1） 特异性强（与RIA相同） 2）灵敏度高（比酶标高1000倍，也高于RIA） 3）操作简单 缺点： 1）假阳性高 2）影响实验准确度的因素多 3）未商品化,还有化学发光酶免疫分析（CLEIA）p209 用硷性磷酸酶标记Ab，反应的复合物带有酶，加入底物金刚烷（dioxetane phosphate）后酶促底物断裂而发光。 电化学发光免疫分析（ECL） p209,8、活化分析： 基本原理，用粒子束（射线）照射样品，使其中待测稳定核素发生核反应变为放素，由于这些放素各具有一定的半衰期、固定的能量特征r射线或其它射线，测量其衰变出的射线能量和活度就可确定样品中各元素的种类和活度。 临床应用：微量元素分析,活化分析的类型： 1）中活化分析： a、反应堆中子活化分析（广泛） b、中子高压倍加器（启动费用高） c、中子源，如Ra-Be中子源（Ra的a粒子轰击Be可产生中子） d、自发裂变中子源252Cf（价格贵），将239Pu在反应堆照射二年吸收13个中子才能得到252Cf产额很低。 2）带电粒子活化分析：一般将带电子粒子如P、d、a加速，然后轰击待测元素，产生新的放素或稳定核素。如12C（p,r）13N 3）r射线活化分析：较危险，目前很少用。,活化分析的优点： 灵敏度高10-9克左右 没有试剂污染 可进行非破坏性分析 一次可同时分析几十种元素 缺点： 精确度低 有干扰反应（副反应） 方法不易普及 不能测化合物的量和结构。,最常用的计算公式（相对测量法） WX AX - = - WS AS,8、质子激发X线发射分析PIXEA 原理：用高速运动的质子轰击待测元素，待测元素原子核外电子被击出，留下的空穴将被外层电子来填补，多余的能量以特征X线放出。 特征（产生射线的能量与入射粒子无关，它只与被测元素的种类有关。不同的元素产生不同的特征X线。,分子核医学进展,内涵：利用示踪技术观察体内的生化过程并与相关基因联系起来的一门分支学科，分子识别是其重要理论基础。 研究领域：受体显像 基因显像 重组单抗片段、肽类放射性药物及微型抗体。,特 点,1）深入分子水平认识疾病， 通过细胞信息传导、基因表达、 生化代谢等多个方面，在解剖学 和功能症状出现之前发现病变信息。 2）通过特定示踪剂，将疾病与基因表达的改变联系起来，提高疾病诊治的层次。 3）当代分子生物学研究成果是其理论源泉。 4）分子识别是分子核医学的理论基石。 5）生化代谢的评价是其理论重要组成部分,