植物组织培养校本教材(共10页)

植物组织培养目录一.植物组织培养综述1.1概念1.2 研究历史1.3技术原理1.4培养特点二. 实验实施预先准备2.1培养基贮备液配制2.2各种植物激素配制2.3各种培养基配制和灭菌三、植物组织培养过程3.1接种过程3.2试管苗的培养3.2.1丛生芽诱导培养3.2.2继代增殖培养3.2.3生根诱导培养3.2.4 移栽定植植物组织培养一.植物组织培养综述1.1概念植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义组织培养是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。1.2 研究历史19世纪30年代，德国家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植物学家哈伯兰特的理论是的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从传向世界各地，美国植物学家斯等人，用的细胞进行培养，终于得到了完整，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。近几十年来植物组织培养技术已经发展成为一项新兴无性繁殖技术。1.3技术原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。 1.4培养特点1.4.1培养条件可以人为控制采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。 1.4.2生长周期短，繁殖率高组培是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。1.4.3管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。二.实验实施预先准备2.1培养基贮备液配制2.1.1培养基简述培养基是植物组织培养中离体植物材料赖以生存的“土壤”。不同组织培养类型、外植体需要的培养基配方不同，组织培养是否成功，培养基的选择具有重要作用。目前常用的培养基有MS、B5、White等。无论何种培养基，都由矿物营养、维生素、碳源、植物激素、有机附加物等无类物质组成。在植物组织培养中应该培养植物的种类和部位，选择最适的培养基，才能获得植物组织培养的成功。本实验以MS为基本培养基。2.1.2 仪器试剂仪器和用具分析天平、恒温水浴锅、电炉、量筒、移液管、烧杯、容量瓶、试剂瓶等试剂MS培养基、植物激素BA、植物激素NAA2.1.3步骤1）根据扩大倍数和配制母液量计算每种化合物称取量；2）称取大量元素化合物，分别溶解后顺次逐个加入并混合，加水定容止所需体积；3）称取微量元素化合物，分别溶解后顺次逐个加入并混合，加水定容止所需体积；4）称取FeSo4 .7H2O和Na2EDTA，分别溶解后混合，加水定容止所需体积；5）称取各种维生素和氨基酸，分别溶解后混合，加水定容止所需体积；6)称取25mgBA先溶解于1mol/L HCL中，再加水定容至25ml（1mg/ml）；7）称取25mgNAA，用NaOH溶解后再加水定容至25ml（1mg/ml）。附表：MS培养基母液配制表2.1.4注意事项1)注意大量元素母液配制的程序： 除钙盐外，其他大量元素分别称量并按顺序融于蒸馏水中，钙盐单独配置，组合混合后，用蒸馏水定容；2)微量元素母液配制的小窍门：因其用量小，为称量方便及精确起见常配置成100或1000倍母液；3)注意不同母液的储存方法：激素母液装入棕色试剂瓶中，铁盐，有机母液，激素母液放于4度冰箱中，大量元素和微量元素母液常温下保存于柜子中，NaOH瓶子的瓶塞上应缠一圈纸。2.2各种植物激素配制2.2.1植物激素配制方法总结原则植物激素：每种激素必须单独配制成母液，浓度为0.1mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml，激素浓度的表示方法多种，ppm（mg/L）、mol/L、mg/ml，用时根据需要取用。l 可高压灭菌: IBA，NAA ，6-BA，2,4-D;、KTl 不可高压灭菌:ZT、2-IP 、IAA，GA3l 配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。l 细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加34滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。l 配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。配制方法除菌方式母液浓度生长素IBA（3-吲哚丁酸）用适量无水乙醇或1M NaOH彻底溶解后，再缓慢加入水定容到一定浓度。除菌方式：与培养基高压共灭菌。0.2g/LIAA（3-吲哚乙酸）用适量无水乙醇或1M NaOH彻底溶解后，再缓慢加入水定容到一定浓度。除菌方式：抽滤除菌。0.2g/L-NAA（ a-萘乙酸）可用1M NaOH彻底溶解后，再加水定溶到一定浓度。除菌方式：与培养基高压共灭菌。0.2g/L2，4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）用无水乙醇或1M NaOH彻底溶解后，再加水定容至一定浓度。除菌方式：与培养基高压共灭菌。0.2g/L细胞分裂素KT（激动素 6-糖氨基嘌呤）和6-BA（6-苄氨基嘌呤）先溶于少量1M NaOH中，再加水定容。除菌方式：与培养基高压共灭菌。0.2g/LZT（反式玉米素）先溶于适量1M NaOH中，再加水至一定浓度。除菌方式：抽滤除菌。（反式玉米素是天然酶）0.1g/L2-ip可用少量1M NaOH溶解后，再加水定容至一定浓度。除菌方式：抽滤除菌。0.2g/L赤霉素GA3先溶于适量无水乙醇中，再加水定容到一定浓度。除菌方式：抽滤除菌。0.2g/L脱落酸ABA（脱落酸）可用少量1M NaOH溶解后，再加水定容至一定浓度。除菌方式：与培养基高压共灭菌。0.2g/L2.2.2植物组培中，有些植物激素不能加入培养基中随之高压蒸汽灭菌，那么这些激素该如何加入培养皿中？过滤灭菌后，在无菌条件下将其加入到高压灭菌后的温度下降到约50至60度的未凝固的培养基中，或者适当加热（如5070C水浴加热）使之溶解后的培养基中，摇匀，待培养基冷却凝固再接种培养物。 2.3各种培养基配制和灭菌2.3.1愈伤组织诱导培养基（丛生芽诱导培养基）配制1）计算各种母液用量（按配置1000mlMS培养基计算）2）每组取50ml的烧杯一只，按上述用量用量筒或移液管（不能混用 ），量取或吸取各种母液，放于烧杯中，同时加上激素BA（浓度2mg/l）备用；3）每组取1000ml的烧杯一只，加300ml蒸馏水，加入琼脂6g，在石棉网上加热溶解，称取30g蔗糖放入溶解的琼脂中，同时加入各种取好的母液，用玻璃棒不断搅拌混合，并加蒸馏水至1000ml；4）调整pH:将培养基搅匀，用pH试纸或pH计测其pH值，可用一定浓度的HCL和NaOH调节至5.8；5）培养基分装、封口：把配置好的培养基趁热分装到培养瓶中，培养基应占试管或三角瓶的1/4-1/3左右为宜，注意不要将培养基沾在管壁上，以免引起污染，分装后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培养基名称及配制时间等。2.3.2继代培养基配制1）计算各种母液用量（按配置1000mlMS培养基计算）2）每组取50ml的烧杯一只，按上述用量用量筒或移液管（不能混用 ），量取或吸取各种母液，放于烧杯中，同时加上激素备用；附表：各组植物激素用量组别一二三四BA浓度（mg/L）0.10.50.50.5NAA浓度（mg/L）000.10.53）每组取1000ml的烧杯一只，加300ml蒸馏水，加入琼脂6g，在石棉网上加热溶解，称取30g蔗糖放入溶解的琼脂中，同时加入各种取好的母液，用玻璃棒不断搅拌混合，并加蒸馏水至1000ml；4）调整pH:将培养基搅匀，用pH试纸或pH计测其pH值，可用一定浓度的HCL和NaOH调节至5.8；5）培养基分装、封口：把配置好的培养基趁热分装到培养瓶中，培养基应占试管或三角瓶的1/4-1/3左右为宜，注意不要将培养基沾在管壁上，以免引起污染，分装后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培养基名称及配制时间等。2.3.3生根培养基配制1）计算各种母液用量（按配置1000mlMS培养基计算）2）每组取50ml的烧杯一只，按上述用量用量筒或移液管（不能混用 ），量取或吸取各种母液，放于烧杯中，同时加上激素备用；附表：各组植物激素用量组别一二三四IBA浓度（mg/L）0.10.500吲哚丁酸浓度（mg/L）001.01.53）每组取1000ml的烧杯一只，加300ml蒸馏水，加入琼脂6g，在石棉网上加热溶解，称取30g蔗糖放入溶解的琼脂中，同时加入各种取好的母液，用玻璃棒不断搅拌混合，并加蒸馏水至1000ml；4）调整pH:将培养基搅匀，用pH试纸或pH计测其pH值，可用一定浓度的HCL和NaOH调节至5.8；5）培养基分装、封口：把配置好的培养基趁热分装到培养瓶中，培养基应占试管或三角瓶的1/4-1/3左右为宜，注意不要将培养基沾在管壁上，以免引起污染，分装后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培养基名称及配制时间等。2.3.4培养基灭菌.全自动立式高压蒸汽灭菌锅操作步骤：1） 检查灭菌锅内的水位，应当浸没加热圈并不要高于套桶底部，可以通过底部隔板中心的孔观察到有水即可。若水量不足请加入蒸馏水或去离子水使得加热圈被浸没；若不慎加入过量的水，请使用底下带有绿色扳手的排液阀排出多余的水后使水位合适。灭菌锅在使用以前排液阀必须关闭。2） 检查左侧下方排气管，使其浸在水盆里，并确保管口一定浸在水面以下。3）将要进行高压灭菌的物品放入灭菌金属筐内，再放入灭菌锅内进行灭菌。4） 将灭菌锅的顶盖转到正上方并旋紧，当仪表盘上“LOCKED”变红色时表示OK； 5）关上安全阀；打开电源，选择已设定好的模式，比如U01等。6）顺时针关闭出气旋纽，长按START键，仪表盘显示“STER”红色，开始高压灭菌；7）灭菌结束，灭菌锅开始发出五声警报声，将根据设定的模式进行降温减压过程。8）如果需要末凝固前添加植物激素，则温度降低到80C、压力表读数为零时，关闭总电源后开启顶盖。开启时操作者应头部略微后仰，缓慢地打开盖后，先让蒸气散去、锅内物品稍微冷却后再取出。注意事项：1）灭菌前请注意灭菌锅内的水位是否合适；顶盖是否已经盖紧；安全阀是否已关闭；左侧下方排气管是否浸在水面以下。2）打开灭菌锅顶盖一定确定压力表显示压力为零；3）使用后应当用蒸馏水或去离子水清洗灭菌锅，将清洗液经排液阀排出干净，备用。4）液体灭菌时，至多不超过容器3/4体积的空间，防止沸腾的液体溢出；5）灭菌时要把容器的盖子松开，防止容器内压力过大而破裂；取出时要拧紧容器的盖子，防止与空气接触容器内染菌。三、植物组织培养过程3.1接种过程：无菌操作技术3.4.1 准备用品超净工作台、75的酒精、95的酒精、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主要指 解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、培养材料（根、茎、叶或种子等）、0.1的升汞（或漂白粉）、无菌水等；3.4.2方法步骤（1）在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min；高锰酸钾甲醛熏蒸消毒操作过程按照甲醛（40%）10毫升立方米、高锰酸钾5克立方米计算用量。不同情况下，用量有所不同，但比例为2：1。盛药容器要大、耐热、耐腐蚀：一般用陶瓷或玻璃容器，因为高锰酸钾和甲醛都具有腐蚀性，且混合后反应剧烈，释放热量。房间要密闭：这样熏蒸效果才会好。容器应尽量靠近门，以便操作人员迅速撤离；先将温水倒入容器内，后加入高锰酸钾，搅拌均匀；再加入甲醛；加入甲醛后人立即离开，密闭房间。注意顺序：是将甲醛倒入高锰酸钾溶液内。消毒时间一般为20-30分钟。消毒后要打开门窗通风换气。这里说的甲醛就是40%的甲醛溶液，也就是福尔马林，一般包装上写的是37%（2）正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，2030min后接种；（3）用肥皂水洗净双手，穿上灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室；（4）用75的酒精擦拭工作台面和双手；（5）用蘸有75酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台；（6）把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95 酒 精 中，在 火 焰 上 灭 菌 后 ，放 在器 械 架 上 ；（7）将植物材料（外植体）进行灭菌消毒处理在晴好天气的中午或下午在健壮无病害的植株上剪取8cm小段细嫩的茎段，每个茎段含2个节，去掉基端节上的叶片，留上节的片叶，在搅匀的洗衣液中浸泡5min,再用自来水流水冲洗1h,在无菌条件下，用75%的酒精洗涤30s，再使用0.1%的升汞溶液灭菌12min,用无菌水冲洗5次，备用（8）用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开封口塑料；（9）取下接种器械，在火焰上灭菌；（10）把培养材料迅速放入培养瓶，扎上瓶口（每人接种510瓶）。操作期间应经常用75酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95的酒精中浸泡和在火焰上灭菌；（11）接种结束后，清理和关闭超净工作台。3.2试管苗的培养3.2.1丛生芽诱导培养将准备好的材料茎段接种到愈伤组织诱导培养基中，每瓶培养基接种2-3个茎段，将接种好的培养瓶放在光照2000LX、温度25的培养室中培养。3.2.2继代增殖培养将诱导获得的丛生芽，从其基部切下，接种在继代培养基中，通过芽生芽途径进行增殖，接种后5-7d,基部膨大，15d长出一些细小的丛生芽，25d左右小芽长大，变成一簇丛生芽。3.2.3生根诱导培养待不定芽长至2cm高时，把丛生状的幼苗切割成单株小苗，接入生根培养基中，进行生根诱导。3.2.4 移栽定植当植株根长至2-3cm时，进行驯化移栽，将培养瓶从培养室移入温室，先将瓶口打开，在自然光下锻炼2-3d，然后用镊子取出幼苗，洗净根部培养基，移栽于营养钵中的营养土，栽植好后，浇足定根水，放置于带有遮阳网的塑料大棚内，注意遮荫、保湿、通气；10-15d后就可长出新根和新叶，移栽到果园，按常规种植管理。