12基因工程的基本操作程序000

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,基因工程的基本操作程序,基因工程培,育,育抗虫棉的,简,简要过程：,提取,棉花细胞(含,抗虫基因,),苏云金芽孢杆菌,抗虫基因,与运载体DNA拼接,导入,普通棉花(无抗虫特性),棉花植株(有,抗虫特性,),基因工程的,基,基本操作程,序,序,（,1,）目的基因,的,的获取,（,2,）,（,3,）将目的基,因,因导入受体,细,细胞,（,4,）目的基因,的,的检测与鉴,定,定,基因表达载体的构建,一、目的基,因,因的获取,1,、目的基因,：,：主要指的,是,是编码蛋白,质,质的结构基因，也可以是,一,一些具有调,控,控作用的因,子,子。,2,、获取方法,：,：,（,1,）从,基因文库,中获取目的,基,基因；,（,2,）利用,PCR,技术扩增目,的,的基因；,（,3,）通过,DNA,合成仪用化,学,学方法直接,合,合成,（一）从基,因,因文库中获,取,取目的基因,1.,什么叫基因,文,文库？,将含有某种,生,生物不同基,因,因的许多,DNA,片断，导入,到,到受体菌的群,体,体中，各个受,体,体菌分别含,有,有这种生物,的,的不同基因,，,，称为基因,文,文库。,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（cDNA文库）,基因组DNA文库,cDNA,文库,基因组DNA文库与cDNA文库,的,的比较,补：原核细,胞,胞的基因结,构,构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚,合,合酶结合位,点,点,启动子,终止子,RNA聚合,酶,酶能够识别,调,调控序列中,的,的结合位点,，,，并与其结,合,合。,转录开始后,，,，RNA聚,合,合酶沿DNA分子移动,，,，并以DNA分子的一,条,条链为模板,合,合成RNA,。,。,转录完毕后,，,，RNA链,释,释放出来，,紧,紧接着RNA聚合酶也,从,从DNA模,板,板链上脱落,下,下来。,不能转录,为,为信使RNA，不能,编码蛋白质,。,。,：能转录相,应,应的信使RNA，能,编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的,基,基因结构,有调控遗传,信,信息表达的,核,核,苷酸序列，在该序列,中,中，,最重要的是,位,位于编码区,上,上,游的RNA,聚,聚合酶结合,位,位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,补：真核细,胞,胞的基因结,构,构,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚,合,合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋,白,白质的序列,叫,叫做外显子,不能够编码,蛋,蛋白质的序,列,列叫做内含,子,子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的,基,基因结,构,构,编码区,非编码区,外显子：能,编,编码蛋白质,的,的序列,内含子：不,能,能编码蛋白,质,质的序列,：有调控作,用,用的核苷酸,序,序列，,包括位于编,码,码区上游的RNA,聚合酶结合,位,位点。,非编码序列,：,：,包括非编码,区,区和内含子,结构基因,外显子,内含子,转录、加工,修,修饰,mRNA,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_ _,和具有调控作用的_,区组成的,原核细胞与,真,真核细胞的,基,基因结构比,较,较,思考,编码相同数,目,目氨基酸的,蛋,蛋白质，原,核,核细胞与真,核,核细胞基因,结,结构一样长,吗,吗？,连续,不连续,编码区,非编码,基因表达的,计,计算,在真核生物,中,中，对应的,是,是的碱基数,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,631,氨基酸数,碱基数,？,补充资料,基因中外显,子,子,基因组文库,与,与部分基因,文,文库的关系,基因组文库,和,和部分基因,文,文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子,基因中内含子,基因多少,物种间基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的,部,部分基因,某种生物的,全,全部基因,可以,部分基因可,以,以,概念辨析,基因文库与,基,基因库,基因库是指,某,某一生物群,体,体中的全部,基,基因。,基因文库与,基,基因克隆,基因克隆是,只,只包含某些,特,特定基因或DNA片段,的,的克隆。,基因文库中,包,包含着为数,众,众多的克隆,，,，建成后可,供,供随时选取,其,其中任何一,个,个基因克隆,之,之用。,基因组文库,的,的构建模式,图,图,通过对,受体菌,的培养而储,存,存基因,2.,基因文库的,构,构建方法,（1）鸟枪法,（2）反转录法,（3）根据已知的,氨,氨基酸序列,合,合成DNA,法,法,人工合成法,（真核生物）,多,用,用,于,于,原,原,核,核,生,生,物,物,直,接,接,分,分,离,离,法,法,（1,）,）,鸟,鸟,枪,枪,法,法,：,：,供,体,体,细,细,胞,胞,中,中,的,的DNA,许,多,多DNA,片,片,段,段,运,载,载,体,体,限,制,制,酶,酶,与,载,载,体,体,连,连,接,接,受,体,体,细,细,胞,胞,产,生,生,特,特,定,定,性,性,状,状,导,入,入,外,源,源DNA,扩,扩,增,增,目,的,的,基,基,因,因,分,离,离,(,直,接,接,分,分,离,离,法,法),以,目,目,的,的,基,基,因,因,转,转,录,录,成,成,的,的信,使,使,RNA,为,模,模,板,板,，,，,在,在反,转,转,录,录,酶,酶的,催,催,化,化,下,下,反,反,转,转,录,录,成,成,互,互,补,补,的,的,单,单,链,链,DNA,，,然,然,后,后,在,在,DNA,聚,合,合,酶,酶,的,的,作,作,用,用,下,下,合,合,成,成,双,双,链,链,DNA,，,即,即,cDNA,，,从,从,而,而,获,获,得,得,所,所,需,需,的,的,基,基,因,因,。,。,（,2,）反,转,转,录,录,法,法（,cDNA,文,库,库,的,的,构,构,建,建,方,方,法,法,）,（3,）,）,根,根,据,据,已,已,知,知,的,的,氨,氨,基,基,酸,酸,序,序,列,列,合,合,成,成DNA,法,法,：,：,根,据,据,已,已,知,知,蛋,蛋,白,白,质,质,的,的,氨,氨,基,基,酸,酸,序,序,列,列,，,，,推,推,测,测,出,出,相,相,应,应,的,的,信,信,使,使RNA,序,序,列,列,，,，,然,然,后,后,按,按,照,照,碱,碱,基,基,互,互,补,补,配,配,对,对,原,原,则,则,，,，,推,推,测,测,出,出,它,它,的,的,结,结,构,构,基,基,因,因,的,的,核,核,苷,苷,酸,酸,序,序,列,列,，,，,再,再,通,通,过,过,化,化,学,学,方,方,法,法,，,，,以,以,单,单,核,核,苷,苷,酸,酸,为,为,原,原,料,料,合,合,成,成,目,目,的,的,基,基,因,因,。,。,蛋,白,白,质,质,的,的,氨,氨,基,基,酸,酸,序,序,列,列,mRNA,的,核,核,苷,苷,酸,酸,序,序,列,列,结,构,构,基,基,因,因,的,的,核,核,苷,苷,酸,酸,序,序,列,列,推,测,测,推,测,测,目,的,的,基,基,因,因,化,学,学,合,合,成,成,上,述,述,三,三,种,种,目,目,的,的,基,基,因,因,提,提,取,取,的,的,方,方,法,法,有,有,何,何,优,优,缺,缺,点,点,？,？,优点,缺点,鸟枪法,反转录法,根据已知氨基酸合成DNA法,操,作,作,简,简,便,便,广,广,泛,泛,使,使,用,用,工,作,作,量,量,大,大,，,，,盲,盲,目,目,，,，,分,分,离,离,出,出,来,来,的,的,有,有,时,时,并,并,非,非,一,一,个,个,基,基,因,因,专,一,一,性,性,强,强,操,作,作,过,过,程,程,麻,麻,烦,烦,，,，mRNA,很,很,不,不,稳,稳,定,定,，,，,要,要,求,求,的,的,技,技,术,术,条,条,件,件,较,较,高,高,专,一,一,性,性,最,最,强,强,仅,限,限,于,于,合,合,成,成,核,核,苷,苷,酸,酸,对,对,较,较,少,少,的,的,简,简,单,单,基,基,因,因,思,考,考,：,：,如,何,何,从,从,基,基,因,因,文,文,库,库,中,中,得,得,到,到,所,所,需,需,要,要,的,的,基,基,因,因,？,？,依,据,据,：,：,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,有,有,关,关,信,信,息,息,。,。,如,：,：,根,根,据,据,基,基,因,因,的,的,核,核,苷,苷,酸,酸,序,序,列,列,；,；,基,因,因,的,的,功,功,能,能,；,；,基,因,因,在,在,染,染,色,色,体,体,上,上,的,的,位,位,置,置,；,；,基,因,因,的,的,转,转,录,录,产,产,物,物mRNA,；,；,基,因,因,翻,翻,译,译,产,产,物,物,蛋,蛋,白,白,质,质,等,等,特,特,性,性,。,。,注,意,意,：,：,基,因,因,文,文,库,库中,不,不,是,是,直,直,接,接,保,保,管,管,相,相,应,应,基,基,因,因,，,，,而,而,是,是保,存,存,受,受,体,体,菌,菌，,菌,菌,中,中,含,含,基,基,因,因,。,。,（,二,二,）,）,利,利,用,用,PCR,技,术,术,扩,扩,增,增,目,目,的,的,基,基,因,因,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR,反,应,应,PCR,反,应,应,条,条,件,件,PCR,过,过,程,程,PCR,的,的,特,特,点,点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重,复,复13,步,步,2530,轮,轮,目,的,的DNA,片,片,段,段,扩,增,增100,万,万,倍,倍,以,以,上,上,DNA,双,螺,螺,旋,旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,模板DNA,95,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR过程,PCR的特点,50,引物1,引物2,DNA,引物,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR过程,PCR的特点,引物1,引物2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第1轮结束,第2轮开始,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR过程,PCR的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第2轮结束, 概念：PCR全称为_，是,一,一项,在生物_,复,复制_的,核,核酸合成技术。,前提条件：_；,原料：_,、,、_ 、_、_。,原理：_,方式：以_方式扩增,，,，即_（n为扩增循,环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA,复制,已知基因的核苷,酸,酸序列,四种脱氧核苷酸,DNA,引物,热稳定DNA聚,合,合酶,指数,2,n,使目的基因的片,段,段在短时间内成,百,百万倍地扩增,模板DNA,过程：,变性、退火、延,伸,伸三步曲,变性：,加热至,90,95,双链DNA解链,成,成为单链DNA,退火：,冷却至,55,60,部分引物与模板,的,的单链DNA的,特,特定互补部位相,配,配对和结合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因为模,板,板，合成互补的,新,新DNA链,变性,退火,延伸,过程：,a,、DNA变性（90-95,）,）：双链DNA,模,模板,在热作用下，_断裂，,形,形成_,b,、退火（,复性,55-65,）：系统温度降,低,低，引 物与DNA模板结合,，,，形成局部_。,c,、延伸（70-75）：在Taq酶的作用,下,下，从,引物的5端3端延伸，合,成,成与模板互补,的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA,链,思考？,1,个DNA分子进,行,行PCR扩增,循,循环4次，,理论上至少需要,几,几个引物？,2,（2,n,-1,）,(n,为循环次数),（2,4,-1,）,2=30,模板DNA,特异性引物,耐热DNA聚合,酶,酶,dNTPs,Mg,2+,PCR,体系基本组成成,分,分,一对寡核苷酸序,列,列：与目的基因,的,的起始段互补,PCR,总结：,PCR,的基本反应步骤,变性,90-95,C,延伸,70-75,C,退火,55-60,C,PCR,总结：,TaqDNA,聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度,(),40 50607080 90100,100,80,60,40,20,PCR,技术扩增与DNA复制的比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA,在高温下变性解,旋,旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA,聚,聚合酶,细胞内的DNA,聚,聚合酶,大量的DNA片,段,段,形成整个DNA,分,分子,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR过程,PCR的特点,重复30轮后,2,30,=1,073,741,824,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2,n,n,循环次数,实际拷贝数=(1+x),n,X,平均效率,约为0.85,n 循环次数,根据已知蛋白质,的,的氨基酸序列，,推,推测出相应的mRNA序列，然,后,后按照碱基互补,配,配对原则，推测,出,出它的结构基因,的,的核苷酸序列，,再,再通过化学方法,，,，以单,核,核苷,酸,酸为,原,原料,合,合成,目,目的,基,基因。,蛋白,质,质的,氨,氨基,酸,酸序,列,列,mRNA,的核,苷,苷酸,序,序列,结构,基,基因,的,的核,苷,苷酸,序,序列,推测,推测,目的,基,基因,化学,合,合成,（三,）,）化,学,学方,法,法人,工,工合,成,成目,的,的基,因,因,人工,合,合成,(,基因,比,比较,小,小,),DNA,合成,仪,仪,从基,因,因文,库,库中,获,获取,利用PCR技,术,术扩,增,增,利用,化,化学,方,方法,人,人工,合,合成,归纳,：,：获,取,取目,的,的基,因,因的,方,方法,用一,定,定的_切,割,割,质粒,，,，使,其,其出,现,现一,个,个切,口，,露,露出_,。,。,用_,切,切断,目,目,的基,因,因，,使,使其,产,产生_,_,。,。,将切,下,下的,目,目的,基,基因,片,片段,插,插入,质,质粒,的,的_处,，,，,再加,入,入适,量,量_,，,，形,成,成了,一,一个,重,重组,DNA分,子,子（,重,重组,质,质粒,）,）,限制,酶,酶,黏性,末,末端,同一,种,种限,制,制酶,相同,的,的黏,性,性末,端,端,切口,DNA,连接,酶,酶,1.,过程:,二、,构,构建表达载体,核心,质粒,DNA,分子,限制,酶,酶处,理,理,一个,切,切口,两个,黏,黏性,末,末端,两个,切,切口,获得,目,目的,基,基因,DNA,连接,酶,酶,重组DNA分,子,子（,重,重组,质,质粒,）,）,同一,种,种,过程:,2.,基因,表,表达,载,载体,的,的目,的,的,（1,）,）使,目,目的,基,基因,在,在受,体,体细,胞,胞中,稳,稳定,存,存在,并,并可,以,以遗,传,传给,下,下一,代,代；,（2,）,）使,目,目的,基,基因,能,能够,表,表达,和,和发,挥,挥作,用,用。,科学,家,家在,培,培育,抗,抗虫,棉,棉时,，,，经,历,历了,多,多次,失,失败,，,，才,获,获得,成,成功,。,。,起初,把,把苏,云,云金,芽,芽孢,杆,杆菌,的,的抗虫,基,基因插入,载,载体,质,质粒,中,中，,然,然后,导,导入,棉,棉花,的,的受,精,精卵,中,中，,结,结果,抗,抗虫,基,基因,在,在棉,花,花体,内,内没,有,有表,达,达。,然后,在,在插,入,入抗,虫,虫基,因,因的,质,质粒,中,中插,入,入启动,子,子,(,抗虫,基,基因,首,首端)，,导,导入,棉,棉花,受,受精,卵,卵，,长,长成,的,的棉,花,花植,株,株还,是,是没,有,有抗,虫,虫能,力,力。,科,科学,家,家又,在,在有,启,启动,子,子、,抗,抗虫,基,基因,的,的质,粒,粒中,插,插入终止,子,子,(,抗虫,基,基因,末,末端)，,导,导入,棉,棉花,受,受精,卵,卵，,结,结果,成,成长,的,的植,株,株，,有,有了,抗,抗虫,能,能力,。,。,资,料,料:,思考,：,：,作为,基,基因,工,工程,表,表达,载,载体,，,，只,需,需含,有,有目,的,的基,因,因就,可,可以,完,完成,任,任务,吗,吗？,为,为什,么,么？,（,（P,15,）,不可,以,以。,因为,目,目的,基,基因,在,在表,达,达载,体,体中,得,得到,表,表达,并,并发,挥,挥作,用,用，还需,要,要有,其,其他,控,控制,元,元件，如,启,启动,子,子、,终,终止,子,子和,标,标记,基,基因,等,等。,必须,构,构建,上,上述,元,元件,的,的,主要理由,是：,（,1,） 生物,之,之间进行,基,基因交流,，,，只有使,用,用受体生物,自,自身基因的启动子,才,才能比较,有,有利于基,因,因的表达,；,；,（,2,） 通过,cDNA,文库获得,的,的目的基,因,因没有启,动,动子，只,将,将编码序,列,列导入受,体,体生物中,无,无法转录,；,；,（,3,） 目的,基,基因是否,导,导入受体,生,生物中需,要,要有筛选,标,标记；,（,4,） 为了,增,增强目的,基,基因的表,达,达水平，,往,往往还要,增,增加一些,其,其他调控,元,元件，如,增,增强子（增强基因,启,启动子工,作,作效率的,顺,顺式作用,序,序列，能,够,够在相对,于,于启动子,的,的任何方,向,向和任何,位,位置,(,上游或下,游,游,),上都发挥,作,作用。）等；,（,5,） 有时,需,需要确定,目,目的基因,表,表达的产,物,物存在于,细,细胞的什,么,么部位，,往,往往要加,上,上可以标识,存,存在部位,的,的基因（或做成,目,目的基因,与,与标识基,因,因的融合,基,基因），,如,如绿色荧光,蛋,蛋白基因等。,3.,基因表达,载,载体的组,成,成：,它们有什,么,么作用？,a,、目的基,因,因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基,因,因,调节基,因,因,操纵基,因,因,结构基因,RNA,聚合酶,半乳糖苷,酶,酶,酶,酶,RNA,聚合酶,启动子,RNA,聚合酶,启动子,：位于基因,首,首端的一,段,段特殊的DNA片,断,断，它是RNA聚,合,合酶识别,和,和结合的,部,部位，有,了,了它才能,驱,驱动基因,转,转录出mRNA，,最,最终获得,蛋,蛋白质。,思考,1,：表达载体,为,为什么一,定,定要有启,动,动子？,（,1,）生物之,间,间进行基,因,因交流，,只,只有使用,受,受体生物,自,自身基因,的,的启动子,才,才能有利,于,于基因的,表,表达；,（,2,）通过,cDNA,文库获得,的,的目的基,因,因没有启,动,动子，只,将,将编码序,列,列导入受,体,体细胞无,法,法转录。,思考,2,：终止子的,作,作用是什,么,么？,终止子是,位,位于基因,尾,尾端的一,段,段特殊的,DNA,片断，能,终,终止,mRNA,的转录。,是为了鉴,别,别受体细,胞,胞中是否,含,含有目的,基,基因，从,而,而将有目,的,的基因的,细,细胞筛选,出,出来。,思考3：,标记基因,有,有什么作,用,用？,载体与表达载体的区别：,二,二者都有,标,标记基因,和,和复制原,点,点两部分DNA片,段,段。表达,载,载体在载,体,体基础上,增,增加了目,的,的基因、,启,启动子、,终,终止子三,部,部分结构,。,。,注意,用到的工,具,具酶：既用到限制酶切割载体,，,，又用到,DNA,连接酶将目的基,因,因和载体,拼,拼接，两,种,种酶作用,的,的化学键,都,都是磷酸二酯,键,键。,启动子、,终,终止子对于目的,基,基因表达,必,必不可少,。,。,目的基因,不,不能单独,进,进入受体,细,细胞，必需以表,达,达载体的,方,方式携带,进,进去。,基因工程,技,技术路线,三、将目,的,的基因导,入,入受体细,胞,胞,常用的受,体,体细胞：,有大肠杆,菌,菌、枯草,杆,杆菌、土,壤,壤农杆菌,、,、酵母菌,和,和动植物,细,细胞等。,将目的基,因,因导入受,体,体细胞的,原,原理：,借鉴细菌或病,毒,毒侵染细,胞,胞的途径。,（一）转,化,化：,目的基因,进,进入_内,，,，并且在,受,受体,细,细胞内维,持,持_和_,的,的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方,法,法,将目的基,因,因导入,植物细胞,将目的基,因,因导入,动物细胞,将目的基,因,因导入,微生物细,胞,胞,农杆菌转,化,化法,基因枪法,花粉管通,道,道法,显微注射,法,法,感受态细,胞,胞,1.,将目的基,因,因导入植,物,物细胞,农杆菌转,化,化法,基因枪法,花粉管通,道,道法,（1）农,杆,杆菌转化,法,法,特点：,易感染双,子,子叶植物,和,和裸子植,物,物，对大,多,多数单子,叶,叶植物没,有,有感染能,力,力,原理：,Ti,质粒上的T-DNA可以转,移,移到受体,细,细胞，并,整,整合到受,体,体细胞染,色,色体的DNA上。,转化过,程,程:,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞,染,染色体DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,基因枪法,又,又称微弹,轰,轰击法，,是,是利用压缩,气,气体产生,的,的动力，将包裹,在,在金属颗,粒,粒表面的,表,表达载体DNA打入受体,细,细胞中，使目的,基,基因与其,整,整合并表,达,达的方法,。,。,（2）基,因,因枪法,适用于单子叶植,物,物,（3）花,粉,粉通道法,植物花粉,在,在柱头上,萌,萌发后，,花,花粉管要,穿,穿过花柱,直,直通胚囊,。,。花粉管,通,通道法就,是,是在植物,受,受粉后，,花,花粉形成,的,的花粉管,还,还未愈合,前,前，剪去,柱,柱头，然,后,后，滴加DNA（,含,含目的基,因,因），使,目,目的基因,借,借助花粉,管,管通道进,入,入受体细,胞,胞。,适用于被子植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,2.,将目的基因导,入,入动物细胞,（1）方法：,显,显微注射法,（将基因表达,载,载体提纯，用,显,显微仪注射到受精卵中）,思考：为什么,要,要用受精卵而,不,不用体细胞？,（2）操作程,序,序,:,提纯含目的基,因,因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,常用法：Ca,2+,处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体,细,细胞原因：,繁殖快、多为,单,单细胞、遗传,物,物质相对少,过程：,Ca,2+,处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感,受,受态细胞混合,感受态细胞吸,收,收DNA,3.,将目的基因导,入,入微生物细胞,思考：为什么,要,要用Ca,2+,处理受体细胞,？,？,用Ca,2,处理，增加细,菌,菌细胞壁的通,透,透性,受体生物,植物,动物,微生物,受体细胞,导入方法,受精卵,体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注,射技术,用Ca,2+,处理成感受态,细,细胞,采用基因工程,的,的方法培育抗,虫,虫棉，下列导,入,入目的基因的,作,作法正确的是,（,（）A.将毒素蛋白,注,注射到受精卵,中,中B.将编,码,码毒素蛋白的DNA序列，,与,与质粒重组，,导,导入细菌，用,该,该细菌感染棉,的,的体细胞，再,进,进行组织培养C.将编码,毒,毒素蛋白的DNA序列，与,质,质粒重组，注,射,射到棉的子房,并,并进入受精卵D.将编码,毒,毒素蛋白的DNA序列，注,射,射到棉受精卵,中,中,BC,四、目的基因,的,的检测与鉴定,检测:,是否插入目的,基,基因,是否转录,是否翻译,鉴定:,分子水平鉴定,个体生物学水,平,平鉴定,1,、检测转基因,生,生物染色体的,DNA,上是否插入了,目,目的基因, 首先取出,转,转基因生物的,基,基因组,DNA,；,（,1,）方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:, 将含目的,基,基因的,DNA,片段用放射性,同,同位素等作标,记,记,以此做探针；, 使探针和,转,转基因生物的,基,基因组杂交,若显示出杂交,带,带,表明目的基因,已,已插入染色体,DNA,中。,（一）检测,基因探针,：,是一段带有检,测,测标记，且序,列,列已知的，与,目,目的基因互补,的,的核酸序列。,基因探针通过,分,分子杂交与目,的,的基因结合，,产,产生杂交信号,，,，能从浩翰的,基,基因组中把目,的,的基因显示出,来,来。,DNA,分子杂交示意,图,图,采用一定的技,术,术手段，将两,种,种生物的DNA分子的单链,放,放在一起，如,果,果这两个单链,具,具有互补的碱,基,基序列，那么,，,，互补的碱基,序,序列就会结合,在,在一起，形成,杂,杂合双链区；,在,在没有互补碱,基,基序列的部位,，,，仍然是两条,游,游离的单链。,（二）鉴定（,个,个体生物学水,平,平）,2,、检测目的基,因,因是否转录出,了,了mRNA,3,、检测目的基,因,因是否翻译成,蛋,蛋白质,抗虫鉴定、抗,病,病鉴定、活性,鉴,鉴定等,方法:,分 子 杂,交,交,方法:,抗原-抗体杂,交,交,过程:,用上述探针和,转,转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交,带,带,表明目的,基,基因转录出了mRNA。,提取,（3）检测目,的,的基因是否翻,译,译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,苏云金杆菌,Bt,毒素蛋白,将Bt毒蛋白,注,注射小鼠体内,从小鼠血管抽,出,出血液分离出,抗,抗Bt毒素的,抗,抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,若不能表达，,要,要对抗虫基因,再,再进行修饰。,怎样检验抗虫,基,基因在棉细胞,内,内是否表达呢,？,？,没有抗虫基因,的棉植株,有抗虫基因的,棉,棉植株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,目的基因表达,类型,步骤,检测内容,方法,结果显示,分子检测,第一步,目的基因,是否进入受体细胞,DNA,分子杂交,（,DNA,和,DNA,之间）,是否成功显示出,杂交带,第二步,目的基因是否转录出,mRNA,分子杂交技术,（,DNA,和,mRNA,之间）,是否成功显示出,杂交带,第三步,目的基因是否翻译出,蛋白质,抗原,抗体杂交,是否成功显示出,杂交带,个体水平鉴定,包括抗虫、抗病的,接种实验,，以确定是否有抗性以及抗性的程度；,基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。,目的基因的表,达,达和检测,提示：,DNA,分子杂交技术,首,首先提取受体,细,细胞中的,DNA,，然后高温解,成,成单链，再与,同,同位素标记的,DNA,探针杂交；,抗原抗体,杂,杂交所用到的,抗,抗体是用表达,出,出的蛋白质注,射,射动物进行免,疫,疫，产生相应,的,的抗体，并提,取,取出来。,归纳:基因工程的基,本,本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用PCR,化学方法人工,合,合成,构建基因表达,载,载体,目的基因、启,动,动子、终止子,、,、标记基因,将目的基因导,入,入受体细胞,转化法（微生,物,物）、农杆菌,转,转化法（植物,）,）、显微注射,法,法（动物）,目的基因的检,测,测与鉴定,检测：是否插,入,入、转录、翻,译,译,为什么要构建,基,基因文库？直,接,接从含有目的,基,基因的生物体,内,内提取不行吗,？,？,构建基因文库,是,是获取目的基,因,因的方法之一,，,，并不是唯一,的,的方式。如果,所,所需要的目的,基,基因序列已知,，,，就可以通过PCR方式从,含,含有该基因的,生,生物的DNA,中,中，直接获得,，,，也可以通过,反,反转录，用PCR方式从mRNA中获得,，,，不一定要构,建,建基因文库。,但如果所需要,的,的目的基因的,序,序列完全不知,，,，或只知道目,的,的基因序列的,一,一段，或想从,一,一种生物体内,获,获得许多基因,，,，或者想知道,这,这种生物与另,一,一种生物之间,有,有多少基因不,同,同，或者想知,道,道一种生物在,个,个体发育的不,同,同阶段表达的,基,基因有什么不,同,同，或者想得,到,到一种生物的,全,全基因组序列,，,，往往就需要,构,构建基因文库,。,。,利用大肠杆菌,可,可以生产出人,的,的胰岛素，联,系,系前面有关细,胞,胞器功能的知,识,识，结合基因,工,工程操作程序,的,的基本思路，,思,思考一下，若,要,要生产人的糖,蛋,蛋白，可以用,大,大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽,链,链上有共价结,合,合的糖链，这,些,些糖链是在内,质,质网和高尔基,复,复合体上加工,完,完成的，内质,网,网和高尔基复,合,合体存在于真,核,核细胞中，大,肠,肠杆菌不存在,这,这两种细胞器,，,，因此，在大肠杆菌中,生,生产这种糖蛋,白,白是不可能的。,寻根问底：,根据农杆菌可,将,将目的基因导,入,入双子叶植物,的,的机理,你能分析出农,杆,杆菌不能将目,的,的基因导入单,子,子叶植物的原,因,因吗,?,若将一个抗病,基,基因导入小麦,中,中,理论上讲你,应,应该怎样做,?,要选择合,适,适的农杆菌,菌,菌株，因为,不,不是所有的,农,农杆菌菌株,都,都可以侵染,单,单子叶植物,；,；,要加趋化,和,和诱导的物,质,质，目的是,使,使农杆菌向,植,植物组织的,受,受伤部位靠,拢,拢（趋化性,）,）和激活农,杆,杆菌的诱导,的,的基因，使,T-DNA,转移并插入,到,到染色体,DNA,上。,酚类诱导物,主,主要在双子,叶,叶植物细胞,壁,壁中合成，,通,通常不存在,于,于单子叶植,物,物中,4.-,珠蛋白是动,物,物血红蛋白,的,的重要组成,成,成分。当它,的,的成分异常,时,时，动物有,可,可能患某种,疾,疾病，如镰,刀,刀形细胞贫,血,血症。假如,让,让你用基因,工,工程的方法,，,，使大肠杆,菌,菌生产出鼠,的,的-珠蛋,白,白，想一想,，,，应如何进,行,行设计？,（,1,）从小鼠中,克,克隆出,-,珠蛋白基因,的,的编码序列,（,（cDNA)。,（2）将cDNA前接,上,上在大肠杆,菌,菌中可以适,用,用的启动子,，,，另外加上,抗,抗四环素的,基,基因，构建,成,成一个表达,载,载体。,（3）将表,达,达载体导入,无,无四环素抗,性,性的大肠杆,菌,菌中，然后,在,在含有四环,素,素的培养基,上,上培养大肠,杆,杆菌。如果,表,表达载体未,进,进入大肠杆,菌,菌中，大肠,杆,杆菌会不含,有,有抗四环素,基,基因而死掉,；,；如果培养,基,基上长出大,肠,肠杆菌菌落,，,，则表明-珠蛋白基,因,因已进入其,中,中。,（4）培养,进,进入了-,珠,珠蛋白基因,的,的大肠杆菌,，,，收集菌体,，,，破碎后从,中,中提取-,珠,珠蛋白。,DNA,附着在膜上,硝酸纤维素,膜,膜,加探针,报告基因（,含,含荧光素分,子,子）,变性,DNA,分子杂交,（如检测,SARS,病毒等）,a,b,c,d,检测是否,插,插入目的基,因,因，利用,DNA,分子杂交技,术,术，目的基因,DNA,一条链（作,探,探针）与受,体,体细胞中提,取,取的,DNA,杂交，看是,否,否有杂交带,。,。,检测是否转,录,录出了,mRNA,，利用分子杂交技,术,术，目的基因,DNA,一条链（作,探,探针）与受,体,体细胞中提,取,取的,mRNA,杂交，看是,否,否有杂交带,。,。,检测目的基,因,因是否翻译,成,成蛋白质。抗体与蛋白,质,质进行抗原,抗体杂交,，,，看是否有,杂,杂交带。,还可以进行,个,个体水平的,鉴,鉴定，根据,其,其性状。,提示：,DNA,分子杂交技,术,术首先提取,受,受体细胞中,的,的,DNA,，然后高温,解,解成单链，,再,再与同位素,标,标记的,DNA,探针杂交；,抗原抗,体,体杂交所用,到,到的抗体是,用,用表达出的,蛋,蛋白质注射,动,动物进行免,疫,疫，产生相,应,应的抗体，,并,并提取而来,的,的。,三种印迹技术的,比,比较,分子杂交实验,放射自显影照片,DNA,链末端合成终止,法,法,演讲完毕，谢谢,观,观看！,