微生物的生长与控制

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三节 微生物独特合成途径举例,1,定义：,N,2,+6H 2NH,3,生物固氮,固氮生物,Mg,2+,+ATP,2,固氮生物的种类,(1),自生固氮菌：,能独立进行固氮的微生物,(2),共生固氮菌：,与它种生物共生时才能固氮的微生物,(3),联合固氮菌：,必须生活在植物跟际、叶面或动物肠道等处才能固氮的微生物,从固氮生物在分类上高度分散来推断，固氮作用应是原始生物的基本代谢之一,3,固氮生物的生化机制,(1),固氮的必要条件,ATP,供应,还原力及其载体,固氮酶,还原底物,N,2,镁离子,严格的厌氧微环境,(2),固氮酶,(3),固氮酶活力测定,定氮法 同位素法 乙炔法,(1965,年,),HC CH H,2,C CH,2,(4),固氮的生化机制,固氮酶,H,2,3,固氮菌中对固氮酶的保护,(1),自生固氮菌的保护,呼吸保护作用,构象保护作用,(2),蓝细菌固氮酶的保护,还原性异形胞,时空分隔、束状群体、微氧环境等等,(3),根瘤菌的抗氧保护,豆血红蛋白,微生物特有的结构大分子：,细菌：肽聚糖、磷壁酸、脂多糖、各种荚膜成分等,真菌：葡聚糖、甘露聚糖、纤维素、几丁质等,肽聚糖：绝大多数原核微生物细胞壁所含有的独特成分；在细菌的生命活动中有重要功能，尤其是许多重要抗生素如青霉素、头孢霉素、万古霉素、环丝氨酸（恶唑霉素）和杆菌肽等呈现其选择毒力（,selective toxicity,）的物质基础。是在抗生素治疗上有特别意义的物质。,三、肽聚糖的合成,合成特点,：合成机制复杂，步骤多，且合成部位几经转移；合成过程中须要有能够转运与控制肽聚糖结构元件的载体（,UDP,和细菌萜醇）参与。,合成过程,：依发生部位分成三个阶段：,细胞质阶段：合成派克（,Park,）核苷酸,细胞膜阶段：合成肽聚糖单体,细胞膜外阶段：交联作用形成肽聚糖,第一阶段：,在细胞质中合成,N-,乙酰胞壁酸五肽,（“,Park”,核苷酸）,。,这一阶段起始于,N-,乙酰葡萄糖胺,-1-,磷酸,，它是由葡萄糖经一系列反应生成的；,自,N-,乙酰葡萄糖胺,-1-,磷酸开始，以后的,N-,乙酰葡萄糖胺、,N-,乙酰胞壁酸，以及胞壁酸五肽，都是与糖载体,UDP,结合的；,葡萄糖葡萄糖,-6-,磷酸果糖,-6-,磷酸,ATPADP,Gln,Glu,葡糖胺,-6-,磷酸,N-,乙酰葡糖胺,-6-,磷酸,乙酰,CoA,CoA,N-,乙酰胞壁酸,-UDP,磷酸烯醇式丙酮酸,Pi,NADPH NADP,N-,乙酰葡糖胺,-1-,磷酸,N-,乙酰葡糖胺,-UDP,UTP,PPi,由葡萄糖合成,N-,乙酰葡糖胺和,N-,乙酰胞壁酸,“,Park,”,核苷酸的合成,在细胞膜上由,N-,乙酰胞壁酸五肽与,N-,乙酰葡萄糖胺合成肽聚糖单体,双糖肽亚单位。,这一阶段中有一种称为,细菌萜醇,(,bactoprenol,Bcp,),类脂载体参与，这是一种由,11,个类异戊烯单位组成的,C,55,类异戊烯醇，,它 通过两个磷酸基与,N-,乙酰胞壁酸相连，,载着在细胞质中形成的胞壁酸到细胞膜上,，在那里与,N-,乙酰葡萄糖胺结合，并在,L-,Lys,上接上五肽,(Gly),5,形成,双糖亚单位,。,这一阶段的详细步骤如图所示。其中的反应与分别为万古霉素和杆菌肽所阻断。,第二阶段：,肽聚糖单体的合成,G - M -,P - P,-,类脂,M -,P - P,-,类脂,UDP,UDP- G,UDP,UDP - M,P,-,类脂,Pi ,P - P,-,类脂,杆菌肽,万古霉素,5,甘氨酰,-,tRNA, 5,tRNA,插入至膜外肽,聚糖合成处,G - M -,P - P,-,类脂,肽聚糖单体的合成,细菌萜醇,细菌萜醇（,bactoprenol,）：又称类脂载体；,运载“,Park,”,核苷酸进入细胞膜，连接,N-,乙酰葡糖胺和甘氨酸五肽,“,桥,”,，最后将肽聚糖单体送入细胞膜外的细胞壁生长点处。,结构式：,CH,3,CH,3,CH,3,CH,3,C=CHCH,2,(CH,2,C=CHCH,2,),9,CH,2,C=CHCH,2,OH,功能：除肽聚糖合成外还参与微生物多种细胞外多糖和脂多糖的生物合成，,如：细菌的磷壁酸、脂多糖，,细菌和真菌的纤维素，,真菌的几丁质和甘露聚糖等。,已合成的双糖肽插在细胞膜外的细胞壁生长点中，并交联形成肽聚糖。,这一阶段分两步：,第一步：是多糖链的伸长,双糖肽先是插入细胞壁生长点上作为引物的肽聚糖骨架（至少含,68,个肽聚糖单体分子）中，通过转糖基作用（,transglycosylation,),使多糖链延伸一个双糖单位；,第二步：通过转肽酶的转肽作用（,transpeptitidation,),使相邻多糖链交联,转肽时先是,D-,丙氨酰,-D-,丙氨酸间的肽链断裂，释放出一个,D-,丙氨酰残基，然后倒数第二个,D-,丙氨酸的游离羧基与相邻甘氨酸五肽的游离氨基间形成肽键而实现交联。,第三阶段：,肽聚糖的生物合成与某些抗生素的作用机制,一些抗生素能抑制细菌细胞壁的合成，但是它们的作用位点和作用机制是不同的。,-,内酰胺类抗生素（青霉素、头孢霉素）：,是,D-,丙氨酰,-D-,丙氨酸的结构类似物，两者相互竞争转肽酶的活性中心。当转肽酶与青霉素结合后，双糖肽间的肽桥无法交联，这样的肽聚糖就缺乏应有的强度，结果形成细胞壁缺损的细胞，在不利的渗透压环境中极易破裂而死亡。,杆菌肽：,能与十一异戊烯焦磷酸络合，因此抑制焦磷酸酶的作用，这样也就阻止了十一异戊烯磷酸糖基载体的再生，从而使细胞壁（肽聚糖）的合成受阻。,微生物次生代谢物是指某些微生物生长到稳定期前后，以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢物作前体，通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂的化学物。,与初生代谢物不同的是，次生代谢物往往具有分子结构复杂、代谢途径独特、在生长后期合成、产量较低、生理功能不很明确,(,尤其是抗生素,),以及其合成一般受质粒控制等特点。一般地说，形态构造和生活史越复杂的微生物,(,如放线菌和丝状真菌,),，其次生代谢物的种类也就越多。,四、微生物次生代谢物的合成,微生物次生代谢物,合成途径主要有,4,条,：,糖代谢延伸途径，由糖类转化、聚合产生的多糖类、糖苷类和核酸类化合物进一步转化而形成核苷类、糖苷类和糖衍生物类抗生素；,莽草酸延伸途径，由莽草酸分支途径产生氯霉素等；,氨基酸延伸途径，由各种氨基酸衍生、聚合形成多种含氨基酸的抗生素，如多肽类抗生素、,-,内酰胺类抗生素、,D-,环丝氨酸和杀腺癌菌素等；,乙酸延伸途径，又可分,2,条支路，其一是乙酸经缩合后形成聚酮酐，进而合成大环内酯类、四环素类、灰黄霉素类抗生素和黄曲霉毒素；另一分支是经甲羟戊酸而合成异戊二烯类，进一步合成重要的植物生长刺激素,赤霉素或真菌毒素,隐杯伞素等。,作业,试述肽聚糖的生物合成过程,Chapter 6,Microbial Growth and Its Control,微生物的生长繁殖及其控制,第 一 节,生长的定义及测定方法,微生物生长,(Growth),：,是指细胞物质有规律地、不可逆增加的生物过程。,微生物繁殖,(Reproduction),：,是微生物生长到一定阶段由于细胞内各种细胞结构的复制和重建导致产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的整个生物学过程。微生物生长一般指,群体生长,一、,测生长量,（一）直接法：,测体积法；,称干重法,（二）间接法,1,、比浊法,2,、生理指标法,1.,比浊法,原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,1,、比浊法,菌液,浓度,吸光,值,（,OD,值）,2.,生理指标测定法,测含氮量法,蛋白质总量,=,含氮量,6.25,细胞总量,=,蛋白质总量,/,（,50%80%,（或,65%,）,=,蛋白总量,1.54,测含碳量以及测磷、,DNA,、,RNA,、,ATP,、,DAP,（,二氨基庚二酸）、几丁质等。,产酸、产气、耗氧、粘度和产热等。,二、计繁殖数,1,、,直接计数法,2,、,间接计数法,1,、直接计数法：指用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。,原理：将,1cm,2,0.1mm,的薄层空间划分为,400,小格，从中选取,80,或,100,小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。,适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（,1,）细菌细胞太小，不易沉降；（,2,）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。,特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,血球计数板法,2.,涂片染色法,应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。,方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取,0.1ml,菌液涂于,1cm,2,面积上，计数后代 入公式：,每,ml,原菌液含菌数,=,视野中平均菌数,涂布面积,/,视野面积,100 ,稀释倍数,2,、,间接计数法,（,1,）平板菌落计数法,（,2,）膜过滤法,（,1,）平板菌落计数法,平板菌落计数法：,浇注平板或,涂布平板,平板菌落计数法,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（,1520min,完成操作），严格无菌操作；,注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；,适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，,误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.,（,2,）,薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。,将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,膜过滤法,第二节、微生物的生长规律,一、纯培养技术,1,、纯培养的定义：,纯培养,(Pure culture),：,微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养,2,、获得纯培养的技术,1),稀释平皿分离法,2),平皿划线分离法,3),单细胞挑取法,1,）,pour plate method,（稀释倒平板法）,10,-1,10,-2,10,-3,10,-4,10,-5,10,-6,10,-7,10,-8,10,-9,2),spread plate method,（涂布,平板法）,3,）,streak plate method,（,平板划线分离法）,3.,单细胞挑取法,接种针,解剖镜,.,.,同步培养：,是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。,同步生长：,以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长方式称为同步生长。,同步细胞或同步培养物,：通过同步培养方法获得的细胞称,。,同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它一种理想的材料。,二、微生物的个体生长和同步生长,1,、机械筛选方法,（,1,）离心方法,（,2,）过滤分离法,（,3,）硝酸纤维素滤膜法,2,、环境条件控制技术,（,1,）温度,（,2,）培养基成分控制,（,3,）其他,（,1,）离心方法,（,2,）过滤分离法,（,3,）硝酸纤维素滤膜法,2,、环境条件控制技术,（,1,）温度：,通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。,（,2,）培养基成分控制：,将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后转移至营养丰富的培养基中培养，能获得同步细胞。,（,3,）其他：,光照与黑暗交替培养获得光合细菌的同步细菌；加热杀死芽孢杆菌获得芽孢杆菌的同步细胞。,环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致胞内某些物质合成，它合成和积累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。,三、单细胞微生物的典型生长曲线,回忆：,一,步,生长曲线,(one-step growth curve),这种用来测定噬菌体侵染和成熟病毒体释放的时间间隔，并用以估计每个被侵染的细胞释放出来的新的噬菌体粒子的数量的生长曲线，称为,一步生长曲线,。,潜伏期,隐晦期,胞内积累期,裂解期,平稳期,将少量单细胞纯培,养接种到一恒定容,积的新鲜液体培养,基中，在适宜的条,件下培养，定时取,样测定其细菌含量，,可以看到以下现象：,开始有一短暂时间，,细菌数量并不增加，,随之细菌数目增加,很快，既而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。,如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为繁殖曲线，通常又称为生长曲线。,（一）,延滞期,停滞期、调整期、适应期（,Lag phase,）,少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。这段时间被称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。,1,、延滞期,出现原因,2,、,延滞,的特点,3,、影响,延滞,期限长短的因素,4,、缩短,延滞,期的意义及方法,A,、,微生物接种到一个新的环境，暂缺乏足够的能量和必需的生长因子；,B,、“,种子”老化（即处于非对数生长期）或未充分活化。,C,、,接种时造成的损伤,1,、延滞期,出现原因,2,、,延滞期,的特点,特点：,1,）生长速率常数为零；细菌数量不增加或增加很少。,2,）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状。,3,）细胞内的,RNA,尤其是,rRNA,含量增高，原生质呈嗜碱性。,3,）合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和,ATP,的合成加速，易产生各种诱导酶。,4,） 对外界不良条件如,NaCl,溶液、温度和抗生素等理、理化因素反应敏感。,3,、影响延滞期时间长短的因素,B,、,接种龄,:,以对数期接种龄的种子接种，延滞期短,C,、,接种量,:,发酵工业上通常采用种子：发酵培养基,=1,：,10,D,、,培养基成分,:,一般要求发酵培养基的成分或种子培养基的成分尽量接近，且应适当丰富些。,A,、,菌种特性,4,、缩短延滞期的意义及方法,（,1,）,意义：,可以缩短生产周期，提高设备利用率,（,2,）缩短延滞期的方法,A,、,通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期,缩短,B,、,接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄,C,、,尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相,差太大,D,、,加大接种量,（二）,Exponential phase,（,指数期）,对数期又称指数期。这一阶段,突出特点,是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。,1,、特点,1,）生长速率常数,R,最大代时最短，生长速度最快；,2,）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例生长，菌体成分均匀；,3,）酶系活跃，代谢旺盛 。,（,2,）三个重要参数,：,繁殖代数，生长速率常数，代时,A,繁殖代数（,n,）,X,2,=X,1,2,n,取对数表示,2,2,生长速率常数：,单位时间内繁殖的代数,代时（,G,）：,细胞每分裂一次所需的 时间,(,三）,Stationary phase (,稳定期,),1,、出现原因,A,、,营养的消耗,C,、,引起,pH,值,EH,值的改变,D,、,有害代谢产物积累,对细菌生长不利导致本阶段出现,B,、,营养物的比例失调,2,、特点：,1,）生长常数为零，新生,=,死亡，达到动态平衡；活菌数的总量达到最大值；,2,） 胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）；,3,） 某些芽孢菌的芽孢开始形成；,4,） 某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗生素、维生素等。,（,四）,Death phase(,衰亡期,),特点：,1,）细菌代谢活性降低；,2,）细菌衰老并出现自溶；,3,）产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。,4,）菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应,四、连续培养,是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续下去的一种培养方法。,基本原则：,在微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。,连续发酵的优点：,1,、高效,2,、产品质量较稳定,3,、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、气、电的负荷均衡合理。,缺点：,1,、菌种易退化,2,、易污染杂菌,3,、营养物的利用率一般低于单批增大。,恒浊器：,根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。,恒化器：,与恒浊器相反，是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。,恒浊器与恒化器的,比较,装置,控制对象,培养基,培养基流速,生长速率,产物,应用范围,恒浊器,菌体,密度（内控制）,无限制生长因子,不,恒定,最高速率,大量菌体或与菌体相平行的代谢产物,生产为主,恒化器,培养基流速（外控制）,有,限制生长因子,恒定,低于最高速率,不同生长速率的菌体,实验室为主,