细菌耐药-课件

细菌耐药机制及检测,细菌耐药机制及检测,一、细菌耐药的遗传机制,细菌耐药性的遗传学机制主要指细菌的耐药性通过基因突变(即染色体介导的耐药性)获得，或通过质粒或转座子水平传播获得外源耐药性基因，也可通过整合子捕获外源基因使之转变为功能性基因来传播耐药性。,1、染色体介导的耐药,2、质粒介导的耐药,3、整合子介导的耐药,二、细菌耐药的化学机制,（一）产生灭活抗生素的各种酶,(二 ) 膜通透性下降,（三）抗菌药物作用靶位改变,（四）细菌主动药物外排机制,（五）细菌生物被膜的形成,三、当前主要的耐药性问题,革兰阳性菌：耐青霉素肺炎链球菌（Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP）；耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin resistant Staphylococci,MRS）；耐万古霉素肠球菌（Vancomycin resistant enterococcus,VRE）及耐万古霉素金黄色葡萄球菌（Vancomycin resistant S.aureus,VRSA）。,革兰阴性菌：产超广谱-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌(ESBLs)；持续高产型-内酰胺酶的阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌等；多重耐药的铜绿假单胞菌、不动杆菌、嗜麦芽窄假单胞菌。,对异烟肼和利福平耐药的多重耐药结核分枝杆菌（Multidrug resistance Mycobacteria tuberculosis,MDR-Tb）。,四、主要的耐药性检测方法,（一）耐青霉素G的肺炎链球菌（PRSP）,筛选试验：1g/片苯唑青霉素，MH琼脂+5%羊血，35含5%CO2%环境中孵育20-24小时，抑菌环直径19mm耐药，20mm敏感；确证试验：稀释法测定青霉素MIC，MIC0.06g/ml敏感 2g/ml耐药。,（二）耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）,（1）纸片筛选法：含4%NaCl的MH琼脂，30g/片头孢西丁，33-35，24小时。对于金黄色葡萄球菌，抑菌环直径19mm，为MRSA，抑菌环直径20mm，为MSSA；对于凝固酶阴性葡萄球菌，抑菌环直径24mm，为MRCONS，抑菌环直径25mm，为MSCONS。,（2）琼脂筛选法：MH琼脂中加入6ug/ml苯唑西林、4%氯化钠，直接菌落悬液法，涂布接种，35，孵育至24小时。任何有生长的现象均为MRS。,（3）乳胶凝集或基因扩增法直接检测MecA基因。,（四）耐万古霉素的肠球菌,检测方法：30g/片万古霉素，抑菌环14mm为耐万古霉素肠球菌。,（五）超广谱-内酰胺酶（extended-spectrum-lactamases ESBLs）,（1）药敏推测法：根据ESBLs能水解三代头孢的原理进行检测。用标准琼脂扩散法测定头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢泊肟和头孢曲松的抑菌环直径，按NCCLS标准进行判断。凡头孢他啶抑菌环直径22mm、头孢泊肟抑菌环直径17mm、氨曲南或头孢噻肟抑菌环直径27mm、头孢曲松抑菌环直径25mm，任何一种药物抑菌环直径达到上述标准，或用稀释法检测上述药物的MIC大于等于2ug/ml,均疑为ESBLs菌株。应进一步作确证试验确诊。,（2）表型确证试验：根据ESBLs可被克拉维酸抑制的原理，按NCCLS推荐的指南进行操作，包括纸片法和稀释法。前者采用头孢他啶(30g)及头孢他啶/克拉维酸(30g/10g)组合，头孢噻肟(30g)及头孢噻肟/克拉维酸(30g/10g)组合，任一组药物的抑菌环的直径差5 mm时，判定为ESBLs阳性株。,（5）等电聚焦及克拉维酸抑制试验：将临床分离菌中粗提的未知ESBLs进行等电聚焦电泳，,测定其等电点(PI),与已知酶的ESBLs的PI进行比较,又根据克拉维酸可以抑制的ESBLs活性，而对其他-内酰胺酶的活性无明显抑制作用的特性。可先用克拉维酸对凝胶板上的酶进行抑制，再用头孢硝噻吩进行显色反应，可进行ESBLs的检测和分型。,（6）产酶基因的检测：提取待测菌的DNA作为扩增模板,采用已知标准酶基因的特异性引物,进行体外循环扩增,结果如为阳性说明有已知ESBLs的产酶基因。还可对扩增产物进行测序，确定ESBLs的类型。,（2）AmpC酶表型筛选试验：根据AmpC酶对大部分头孢菌素、尤其是三代头孢菌素耐药的特性，对产AmpC酶的菌株进行表型筛选。选用亚胺培南（IP）、头孢吡肟（FEP）、头孢他啶/克拉维酸（CAZ/Cla）、头孢噻肟（CTX）和头孢噻肟/克拉维酸（CTX/Cla）5种抗菌药物纸片，按NCCLS的K-B法进行操作。判断方法：（1）IP、FEP敏感，而CTX、CAZ/Cla和CTX/Cla耐药；（2）IP、FEP敏感，而在CTX、CAZ/Cla和CTX/Cla的抑菌环内存在散在的菌落；（3）IP敏感，而FEP、CAZ/Cla和CTX/Cla耐药。以上三种结果提示，待检菌株产AmpC酶。最后一种表型提示，待检菌株产AmpC酶的同时，产生其他-内酰胺酶，如产ESBLs。此方法操作简便、快速省时，较三维实验简单得多，可作为产AmpC酶菌株的筛选试验。,（3）氯唑西林（CLO）双抑制剂扩散协同实验：根据氟氯西林（CLO）可抑制AmpC酶的特性进行检测，按NCCLS的K-B法操作，在M-H平板上均匀涂布待检菌株，中央贴一空白纸片，并在其周围2025mm处贴上头孢他啶（CAZ）、头孢曲松（CRO）、头孢哌酮（CFP）、氨曲南（ATM）和头孢噻肟（CTX）纸片，再在空白纸片上滴加10mg/mlCLO20ul,35。C孵育1824h,观察纸片之间的抑菌环情况，CLO与任何一种头孢菌素协同为阳性，提示产AmpC酶。因CLO在琼脂中的扩散能力较差，故将FCC药液直接加在空白纸片上进行扩散，效果较好。此方法操作简便、快速省时。结果基本可靠，可以在各临床微生物实验室推广应用。,（5）等电聚焦及氟氯西林抑制试验：一般的AmpC酶的等电点（PI）偏碱，且大多大于等于9.0，故可用物理方法先将其从待检菌细胞中释放出来，制成酶粗提物，再用等电聚焦的方法在琼脂糖凝胶板上将其与其他 -内酰胺酶或其他蛋白成份分开。又根据氟氯西林可以抑制AmpC酶的活性，而对其他-内酰胺酶的活性无明显抑制作用的特性。若先用氟氯西林对凝胶板上的酶进行抑制，再用头孢硝噻吩进行显色反应，被抑制掉的条带即可能为AmpC酶条带。,具体操作方法：用超声粉碎法制备待检细菌中的-内酰胺酶粗提物，再对待测-内酰胺酶进行等电聚焦（用两份同种-内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板，电泳的条件完全相同）。在一块凝胶板（A）上覆盖浸有氟氯西林（1mmol/L）的滤纸条，另一块凝胶板（B）上仅覆盖用无菌蒸馏水浸润的滤纸条，30s后去除两块凝胶板上的滤纸，再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩（500ug/ml）的滤纸条，1min后揭去滤纸条，观察结果。如果A、B两块凝胶板上的条带颜色不同，即在B板上变色（有黄变红者）、而在A板上不变色（仍为黄色）的条带，即为AmpC酶阳性。与三维试验相同，该方法也是利用酶的粗提物而不是活菌做检测，不受抗菌药物的诱导影响，还可确定AmpC酶的型别。但缺点较三维试验更繁琐、费时，不宜在临床微生物实验室推广应用。,（6）AmpC酶的基因检测：AmpC酶的基因组是由一种结构基因ampC和四种调控基因ampR,ampD,ampE,ampG组成，AmpC酶基因存在于阴沟肠杆菌、福氏志贺菌、普通变形杆菌及肺炎克雷伯菌等产AmpC酶的细菌的染色体远端或质粒中。存在于不同细菌中的AmpC酶基因其特定的核苷酸序列都是相同的，即不论是结构基因ampC还是各种调控基因，都有其特定的核苷酸序列。故通过查找待检细菌中有无特定的AmpC酶的基因片段（通过特异性的基因引物，扩增待检细菌中特定的AmpC酶的基因片段，分析其特定的核苷酸序列），即可确定待检细菌能否产AmpC酶。如将PCR产物测序，并与标准序列相比较，还可检测AmpC酶的型别。AmpC酶的基因检测法可直接检测待检细菌中染色体或质粒上的ampC基因或ampD基因片段，不受表型和外界因素的影响，准确性高。但该方法的实验操作仍较繁琐，不适合于临床常规应用。,（七）金属-內酰胺酶,（1）协同法药物敏感性检测:以巯基丙酸或EDTA.K2为酶抑制剂，头孢他啶、头孢噻肟、亚胺培南为底物，在MH平板上用KB法进行检测。巯基丙酸或EDTA与CZA、CTX、IMP四纸片中任一纸片间出现抑菌环扩大现象则表示协同试验阳性（该细菌产金属-内酰胺酶）；如无此现象，则表示协同试验阴性。,（2）耐药基因PCR检测：质粒介导的blaIMP和染色体介导的blaIMPPCR检测，尤其使用于沉默型金属酶基因的检测。,