蛋白质分离纯化主要方法课件

30.06.20201蛋白质分离纯化主要方法30.06.20201蛋白质分离纯化主要方法30.06.20202蛋白质分离纯化的一般步骤层析法电泳法超离心法超滤?盐析（硫酸铵盐析）?等电点沉淀?有机溶剂沉淀?透析前处理 粗分级 细分级?材料选择与处理?细胞破碎（机械破碎、溶涨和自溶、酶解、化学处理）生物组织无细胞提取液粗产品结晶30.06.20202蛋白质分离纯化的一般步骤层析法电泳法超30.06.20203盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热变性沉淀法离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析等电聚集层析分离纯化方法沉淀法层析法电学法电泳法等电聚焦膜分离技术透析超滤离心法30.06.20203盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法30.06.20204纯度鉴定分子量测定层析法：凝胶过滤层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等免疫化学法：专一的沉淀线SDS-PAGE电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一其它：如,结晶法30.06.20204纯度鉴定分子量测定层析法：凝胶过滤;30.06.20205定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。操作蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂（如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于袋中而得到分离。一 透析30.06.20205定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。30.06.20206透析工作透析工作图图半透膜原理半透膜原理30.06.20206透析工作图半透膜原理30.06.2020730.06.2020730.06.20208二 层析技术（chromatography）p148一、层析技术一般原理二、层析技术分类及应用30.06.20208二层析技术（chromatograph30.06.20209（一）、层析技术原理（一）、层析技术原理层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：样品原点到斑点中心的距离Rf=样品原点到溶剂前沿的距离30.06.20209（一）、层析技术原理层析技术是一种物理30.06.202010(二)层析相关概念1.固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。30.06.202010(二)层析相关概念1.固定相：固定30.06.2020112.流动相：流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。30.06.2020112.流动相：在层析过程中，推动固定相30.06.202012（三）、层析法分类（按分离原理分类）分配层析吸附层析凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析亲和层析聚焦层析30.06.202012（三）、层析法分类（按分离原理分类）30.06.202013层析法分类（按装置分类层析法分类（按装置分类）纸层析薄膜层析柱层析柱层析30.06.202013层析法分类（按装置分类）纸层析薄膜层30.06.202014填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱洗脱液洗脱液样品样品30.06.202014填充物分部收集玻璃柱洗脱液样品30.06.202015各类层析的原理和载体各类层析的原理和载体类别分离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose 、sephadex离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose 6 B）30.06.202015各类层析的原理和载体类别分离原理基质30.06.202016原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。吸附层析（absorption chromatography）30.06.202016原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的30.06.20201730.06.20201730.06.202018原理：分配层析是利用混合物(样品)在二种或二种以上的不同溶剂中的 分配系数不同而使物质分离的方法分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。分配层析(p148)30.06.202018原理：分配层析是利用混合物(样品)在30.06.202019物质在纸上移动的速度可以用Rf表示：色斑中心至原点中心的距离Rf =溶剂前缘至原点中心的距离载体：纤维素 硅藻土 硅胶应用：各种生化物质的分离鉴定30.06.202019物质在纸上移动的速度可以用Rf表示：30.06.202020凝胶层析凝胶层析（gel filtration）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。30.06.202020凝胶层析（gel filtrati30.06.202021原理p303凝胶层析是依据凝胶层析是依据分子大小分子大小这一物理性质这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。30.06.202021原理p303凝胶层析是依据分子大小这30.06.202022载体葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（sepharose）应用应用:测定分子量脱盐和浓缩分离提纯生物大分子除去热原物质30.06.202022载体葡聚糖凝胶（sephadex）琼30.06.202023离子交换层析离子交换层析（ion-change chromatography）原理原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。30.06.202023离子交换层析（ion-change 30.06.202024分类：分类：根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，阳离子交换剂;阴离子交换剂；按其解离度的大小，分为强、中强、弱三种：30.06.202024分类：根据交换剂上吸附的离子交换基团30.06.202025磷酸基团（PO3H2）和亚磷酸基团（PO2H）结合磺酸基团（SO3H）弱酸型强酸型中等酸型结合酚羟基（OH）或羧基（COOH）弱碱型强碱型中等碱型季胺基团（N(CH3)3），叔胺（N(CH3)2）、仲胺（NHCH3）、伯胺（-N二乙基氨基乙基（DEAE）离子交换层析分类阴离子交换剂阳离子交换剂30.06.202025磷酸基团（PO3H2）和亚磷酸基团（30.06.20202630.06.20202630.06.202027交换过程交换过程2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合30.06.202027交换过程2.吸附阶段：样品与反离子进30.06.20202830.06.20202830.06.202029应用应用制备、纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分30.06.202029应用制备、纯化生物物质定量、定性测定30.06.202030原理欲分离的大分产物质 S和相对应的专一物质 L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物 LS。其中的L又能与活化的基质 M以共价键首先结合，而形成MLS复合物。根据LS之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层桥方法称为亲和层析法。亲和层析亲和层析（affiuity chromatography）30.06.202030原理欲分离的大分产物质S和相对应的专30.06.202031+待纯化分子配体a.待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子配体L基质M待分离物质SL-S复合物30.06.202031+待纯化分子配体a.待纯化分子和配30.06.20203230.06.20203230.06.202033应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex30.06.202033应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核30.06.202034聚焦层析（聚焦层析（Chromatofocusing）该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在 pH梯度环境中进行排列的过程叫做程叫做聚焦效应。原理原理30.06.202034聚焦层析（Chromatofocus30.06.202035pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的 pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点 pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。30.06.202035pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交30.06.2020361、pH梯度的形成2、蛋白质行为3、聚焦效应30.06.2020361、pH梯度的形成2、蛋白质行为3、30.06.202037层析时的聚焦效应示意图pH梯度溶液的形成示意图蛋白质 1（pI=7）蛋白质 2（pI=8）流速流速移动速率移动速率30.06.202037层析时的聚焦效应示意图pH梯度溶液的30.06.202038几种主要层析方法比较几种主要层析方法比较30.06.202038几种主要层析方法比较30.06.202039二、电泳技术电泳的一般原理电泳技术的分类电泳的影响因素常用电泳技术30.06.202039二、电泳技术电泳的一般原理电泳技术的30.06.202040电泳的一般原理电泳的一般原理电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。30.06.202040电泳的一般原理电泳是带电颗粒在电场作30.06.202041电泳分类?（一）按原理分四种?1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。：是当前应用最为广泛的电泳技术。2.自由界面电泳：这是瑞典这是瑞典Uppsala 大学的著名科学家Tiselius 最早建立的电泳技术，是在形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。30.06.202041电泳分类?（一）按原理分四种?1.区30.06.202042（二）按支持介质的不同可分为：1.纸电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.琼脂凝胶电泳4.聚丙烯酰胺凝胶电泳5.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。30.06.202042（二）按支持介质的不同可分为：1.纸30.06.202043（三）按支持介质形状不同1.薄层电泳；2.板电泳；3.柱电泳。（四）按用途不同可分为：1.分析电泳；2.制备电泳；3.定量免疫电泳；30.06.202043（三）按支持介质形状不同1.薄层电泳30.06.202044（五）按所用电压不同可分为：1.低压电泳：100V500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。2.高压电泳：1000V5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。（六）按pH的连续性不同可分为：1.连续pH电泳：如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳；2.非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳；30.06.202044（五）按所用电压不同可分为：1.低压30.06.202045电泳技术分类（按实验装置分类）纸电泳薄膜电泳凝胶电泳毛细管电泳30.06.202045电泳技术分类（按实验装置分类）纸电泳30.06.202046毛细管电泳毛细管电泳30.06.202046毛细管电泳30.06.202047三、影响电泳的因素三、影响电泳的因素（一）带电颗粒的物理性状（二）支持物介质：（三）缓冲溶液(pH 离子强度)（四）电场强度：（五）电渗现象：（六）焦耳热对电泳的影响30.06.202047三、影响电泳的因素（一）带电颗粒的物30.06.202048四、常用电泳技术1、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）3、SDS-PAGE4、PAGE等电点聚焦3、琼脂糖电泳4、毛细管电泳30.06.202048四、常用电泳技术1、醋酸纤维薄膜电泳30.06.202049聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）?凝胶聚合反应及催化系统?不连续PAGE?可产生的三种效应：电荷效应、分子筛 效应、浓缩效应30.06.202049聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）?凝胶30.06.202050?聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresisPAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。30.06.202050?聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacr30.06.202051光聚合催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。聚合方式化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基30.06.202051光聚合催化剂是核黄素，核黄素在光照下30.06.202052不连续表现：缓冲液及凝胶pH 不连续凝胶孔径不连续电位梯度不连续30.06.202052不连续表现：缓冲液及凝胶pH 不连续30.06.202053电极缓冲液pH8.3Tris-GlyTris-Gly分离胶pH：8.9 Tris-HCl电极缓冲液pH8.3Tris-GlyTris-Gly浓缩胶pH：6.7Tris-HClTris-HCl样品样品30.06.202053电极缓冲液pH8.3Tris-G30.06.20205430.06.20205430.06.20205530.06.20205530.06.202056SDS-PAGE原理：当SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质亚基数30.06.202056SDS-PAGE原理：当SDS（So30.06.202057SDS-PAGE separates proteins by MW30.06.202057SDS-PAGE separates30.06.20205830.06.20205830.06.202059等电点聚焦（isoelectric focusing）原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其 pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极 pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：高效率分离纯化蛋白质测定蛋白质分子量30.06.202059等电点聚焦（isoelectric 30.06.202060等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。+5.06.07.05.06.07.0通电+30.06.202060等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，30.06.20206130.06.20206130.06.202062等电聚焦电泳法测定蛋白质pI30.06.202062等电聚焦电泳法测定蛋白质pI30.06.202063双向电泳30.06.202063双向电泳30.06.20206430.06.20206430.06.20206530.06.20206530.06.202066毛细管电泳毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（?2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。30.06.202066毛细管电泳毛细管电泳又称毛细管区带电30.06.202067毛细管电泳装置示意图毛细管电泳装置示意图高压电源光源光电倍增管数据采集数据采集毛细管缓冲液-样品缓冲液30.06.202067毛细管电泳装置示意图高压电源光源光电30.06.202068三、离心技术离心原理离心机分类离心基本方法30.06.202068三、离心技术离心原理离心机分类离心基30.06.202069原理：离心法是利用离心机产生的强大离心力来分离具有不同沉降系数的物质。沉降系数（S）概念30.06.202069原理：离心法是利用离心机产生的强大离30.06.202070常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000 r/min 以内，相对离心力（RCF）在1104g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。1 1、常速离心分离、常速离心分离30.06.202070常速离心机又称为低速离心机,其最大30.06.202071高速离心机的最大转速为（0.82.5）104 r/min，相对离心力达到11041105 g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。2 2、高速离心分离、高速离心分离30.06.202071高速离心机的最大转速为（0.82.30.06.202072超速离心机的最大转速达(2.512)104r/min，相对离心力可以高达 5105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。3 3、超速离心分离、超速离心分离30.06.202072超速离心机的最大转速达(2.51230.06.202073超速离心机工作原理图解光光源源转转轴轴转转头样样品品池光学系统液液面面沉降界面沉降物质平平衡衡池沉降界面峰浓度对距离的图谱30.06.202073超速离心机工作原理图解光源转轴转头样30.06.202074经染料-氯化铯密度梯度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布超螺旋DNA闭环质粒DNA开环质及线型DNA蛋白质石蜡油滴加样品离心管蔗糖密度梯度蔗糖浓度30.06.202074经染料-氯化铯密度梯度超离心后，质粒30.06.202075作业：?1 名词解释：凝胶电泳（gel electrophoresis）?层析（chromatography）?2 写出五种常见的分离纯化蛋白质的方法及其原理？30.06.202075作业：?1 名词解释：凝胶电泳（ge