遗传学17基因治疗ppt课件

第十一章第十一章 基因治疗（基因治疗（Gene TherapyGene Therapy）遗传学17基因治疗1第十一章 基因治疗（Gene Therapy）遗传学17基因第十一章第十一章 基因治疗基因治疗 现在已经证明小英的疾病是由于现在已经证明小英的疾病是由于现在已经证明小英的疾病是由于现在已经证明小英的疾病是由于HERGHERGHERGHERG基因发生突变而引基因发生突变而引基因发生突变而引基因发生突变而引起的，普通药物已经很难完全控制其疾病的发展。那么，有起的，普通药物已经很难完全控制其疾病的发展。那么，有起的，普通药物已经很难完全控制其疾病的发展。那么，有起的，普通药物已经很难完全控制其疾病的发展。那么，有没有办法改善其病程？没有办法改善其病程？没有办法改善其病程？没有办法改善其病程？基因治疗（基因治疗（基因治疗（基因治疗（Gene therapyGene therapyGene therapyGene therapy）：指应用指应用指应用指应用DNADNADNADNA重组技术，将重组技术，将重组技术，将重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病起的疾病起的疾病起的疾病,以达到治疗的目的。以达到治疗的目的。以达到治疗的目的。以达到治疗的目的。遗传学17基因治疗2第十一章 基因治疗 现在已经证明小英的疾病是一、基因治疗策略一、基因治疗策略一、基因治疗策略一、基因治疗策略1 1 1 1、直接基因治疗：纠正突变基因、直接基因治疗：纠正突变基因、直接基因治疗：纠正突变基因、直接基因治疗：纠正突变基因 在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）之中。（未实现）之中。（未实现）之中。（未实现）2 2 2 2、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。导入外源正常基因，没有去除或修复有缺陷的基因。导入外源正常基因，没有去除或修复有缺陷的基因。导入外源正常基因，没有去除或修复有缺陷的基因。导入外源正常基因，没有去除或修复有缺陷的基因。用用用用DNADNADNADNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗3一、基因治疗策略第十一章 基因治疗遗传学17基因治疗3二、基因治疗的途径：二、基因治疗的途径：二、基因治疗的途径：二、基因治疗的途径：1 1 1 1、生殖细胞基因治疗：将正常基因转移到患者生殖细胞、生殖细胞基因治疗：将正常基因转移到患者生殖细胞、生殖细胞基因治疗：将正常基因转移到患者生殖细胞、生殖细胞基因治疗：将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。因不能在人群中散播。因不能在人群中散播。因不能在人群中散播。2 2 2 2、体细胞基因治疗：将正常基因转移到体细胞，使之表、体细胞基因治疗：将正常基因转移到体细胞，使之表、体细胞基因治疗：将正常基因转移到体细胞，使之表、体细胞基因治疗：将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。后代。后代。后代。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗4二、基因治疗的途径：第十一章 基因治疗遗传学17基因治疗4三、基因治疗的方法：三、基因治疗的方法：三、基因治疗的方法：三、基因治疗的方法：1.1.1.1.目的基因的获得目的基因的获得目的基因的获得目的基因的获得 人工合成人工合成人工合成人工合成 逆转录逆转录逆转录逆转录 基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA 第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗5三、基因治疗的方法：第十一章 基因治疗遗传学17基因治疗5 2.2.2.2.外源基因的转移外源基因的转移外源基因的转移外源基因的转移 物理方法：电穿孔法、显微注射法、微粒子轰击法物理方法：电穿孔法、显微注射法、微粒子轰击法物理方法：电穿孔法、显微注射法、微粒子轰击法物理方法：电穿孔法、显微注射法、微粒子轰击法 化化化化 学法学法学法学法 ：磷酸钙沉淀法、脂质体：磷酸钙沉淀法、脂质体：磷酸钙沉淀法、脂质体：磷酸钙沉淀法、脂质体(Liposome)(Liposome)(Liposome)(Liposome)融合法融合法融合法融合法 病毒介导基因内转移（病毒介导基因内转移（病毒介导基因内转移（病毒介导基因内转移（Viral mediated transferViral mediated transferViral mediated transferViral mediated transfer）感染细胞感染细胞感染细胞感染细胞重组病毒重组病毒第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗62.外源基因的转移感染细胞重组病毒第十一章 基因治疗遗传学 逆转录病毒逆转录病毒逆转录病毒逆转录病毒(RNA)(RNA)(RNA)(RNA)常用的病毒载体常用的病毒载体常用的病毒载体常用的病毒载体 DNA DNA DNA DNA病毒病毒病毒病毒 逆转录病毒（逆转录病毒（逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirusretrovirusretrovirusretrovirus）病毒感染细胞后，其基因组病毒感染细胞后，其基因组病毒感染细胞后，其基因组病毒感染细胞后，其基因组RNA RNA RNA RNA 经逆转录产生双链经逆转录产生双链经逆转录产生双链经逆转录产生双链DNADNADNADNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirusprovirusprovirusprovirus），前），前），前），前病毒转录产生的正链既是病毒病毒转录产生的正链既是病毒病毒转录产生的正链既是病毒病毒转录产生的正链既是病毒RNARNARNARNA，再与前病毒编码的外，再与前病毒编码的外，再与前病毒编码的外，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。壳蛋白包装成新的病毒颗粒。壳蛋白包装成新的病毒颗粒。壳蛋白包装成新的病毒颗粒。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗7 逆转录病毒(RNA)第 第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗8第十一章 基因治疗遗传学17基因治疗8 例如：小鼠白血病病毒（例如：小鼠白血病病毒（例如：小鼠白血病病毒（例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLVMo-MLVMo-MLVMo-MLV）基因组结构：）基因组结构：）基因组结构：）基因组结构：LTR LTR LTR LTR gag pol env gag pol envU3 R U5 U3 R U5U3 R U5 U3 R U5U3=U3=U3=U3=增强子，增强子，增强子，增强子，R=R=R=R=启动子，启动子，启动子，启动子，U5=U5=U5=U5=转录起始位点。转录起始位点。转录起始位点。转录起始位点。=病毒包装信号，病毒包装信号，病毒包装信号，病毒包装信号，gag=gag=gag=gag=核心抗原，核心抗原，核心抗原，核心抗原，pol=pol=pol=pol=逆转录酶，逆转录酶，逆转录酶，逆转录酶，env=env=env=env=外外外外壳蛋白。壳蛋白。壳蛋白。壳蛋白。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗9例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：逆转录病毒载体优点：逆转录病毒载体优点：逆转录病毒载体优点：逆转录病毒载体优点：高效感染宿主细胞，转染率可达高效感染宿主细胞，转染率可达高效感染宿主细胞，转染率可达高效感染宿主细胞，转染率可达100%100%100%100%病毒基因和所载的外源基因都可能表达病毒基因和所载的外源基因都可能表达病毒基因和所载的外源基因都可能表达病毒基因和所载的外源基因都可能表达宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留缺点缺点缺点缺点病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入7kb7kb7kb7kb左右片段；左右片段；左右片段；左右片段；随机插入靶细胞基因组中，使插入点附近的基因过度表随机插入靶细胞基因组中，使插入点附近的基因过度表随机插入靶细胞基因组中，使插入点附近的基因过度表随机插入靶细胞基因组中，使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；有致癌达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；有致癌达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；有致癌达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；有致癌作用，可能使受体细胞癌变。作用，可能使受体细胞癌变。作用，可能使受体细胞癌变。作用，可能使受体细胞癌变。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗10逆转录病毒载体优点：第十一章 基因治疗遗传学17基因治疗10第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗11第十一章 基因治疗遗传学17基因治疗11第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗12第十一章 基因治疗遗传学17基因治疗12 受体载体转移法：将含有目的基因的重组质粒和某些受体载体转移法：将含有目的基因的重组质粒和某些受体载体转移法：将含有目的基因的重组质粒和某些受体载体转移法：将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒配体配体配体配体细胞膜细胞膜复合物复合物复合物复合物第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗13 受体载体转移法：将含有目的基因的重组质粒和某些细 同源重组技术（同源重组技术（同源重组技术（同源重组技术（homologus recombinationhomologus recombinationhomologus recombinationhomologus recombination）:外源基外源基外源基外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗NEOMYCINXXNEOMYCIN遗传学17基因治疗14 同源重组技术（homologus recombi第十一章第十一章 基因治疗基因治疗Positive selection:Positive selection:-neomycin phosphotransferase(neo)-neomycin phosphotransferase(neo)-hygromycin phosphotransferase(hyg)-hygromycin phosphotransferase(hyg)-puromycine(pur)-puromycine(pur)-hypoxanthine phosphoribosyltransferase(hprt)-hypoxanthine phosphoribosyltransferase(hprt)Negative selectionNegative selection：-thymidine kinase(tk)-thymidine kinase(tk)-cytosine deaminase(cd)-cytosine deaminase(cd)-hypoxanthine phosphoribosyltransferase(hprt)-hypoxanthine phosphoribosyltransferase(hprt)同源重组成果细胞的筛选：同源重组成果细胞的筛选：同源重组成果细胞的筛选：同源重组成果细胞的筛选：遗传学17基因治疗15第十一章 基因治疗Positive selection:同源第十一章第十一章 基因治疗基因治疗启动子缺失筛选法启动子缺失筛选法启动子缺失筛选法启动子缺失筛选法Poly-APoly-A缺失筛选法缺失筛选法缺失筛选法缺失筛选法正负筛选策略（正负筛选策略（正负筛选策略（正负筛选策略（positive and negative electionpositive and negative election，PNSPNS）HR112HR23HR1b b-geoHR23HR1b b-geoHR23Genomic LocusTargetingVectorMutant LocusHSVtkSTOP CODONS遗传学17基因治疗16第十一章 基因治疗启动子缺失筛选法Poly-A缺失筛选法四、靶细胞的选择四、靶细胞的选择四、靶细胞的选择四、靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源靶细胞是指接受外源靶细胞是指接受外源靶细胞是指接受外源GeneGeneGeneGene的体细胞的体细胞的体细胞的体细胞 选择靶细胞的原则是：选择靶细胞的原则是：选择靶细胞的原则是：选择靶细胞的原则是：1 1 1 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；2 2 2 2）易于由人体分离又便于输回体内）易于由人体分离又便于输回体内）易于由人体分离又便于输回体内）易于由人体分离又便于输回体内3 3 3 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个生命周期）个生命周期）个生命周期）个生命周期）4 4 4 4）易于受外源遗传物质转化。）易于受外源遗传物质转化。）易于受外源遗传物质转化。）易于受外源遗传物质转化。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗17四、靶细胞的选择第十一章 基因治疗遗传学17基因治疗17 常见的靶细胞常见的靶细胞常见的靶细胞常见的靶细胞 外周血外周血外周血外周血T T T T淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞 上皮细胞上皮细胞上皮细胞上皮细胞 内皮内皮内皮内皮 皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞 造血干细胞造血干细胞造血干细胞造血干细胞地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等 肝肝肝肝CCCC家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗 肌细胞肌细胞肌细胞肌细胞第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗18 常见的靶细胞第十一章 基因治疗的原则基因治疗的原则基因治疗的原则基因治疗的原则 选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，GeneGeneGeneGene的结构和功能。的结构和功能。的结构和功能。的结构和功能。被纠正的基因已克隆，并清楚被纠正的基因已克隆，并清楚被纠正的基因已克隆，并清楚被纠正的基因已克隆，并清楚GeneGeneGeneGene表达与调控机制与条件。表达与调控机制与条件。表达与调控机制与条件。表达与调控机制与条件。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗19 基因治疗的原则第十一章 基因治疗 基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类GeneGeneGeneGene治疗成功例子）治疗成功例子）治疗成功例子）治疗成功例子）ADAADAADAADA缺乏症缺乏症缺乏症缺乏症致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADAADAADAADA）缺乏。）缺乏。）缺乏。）缺乏。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗20 基因治疗的应用第十一章 基因治疗 基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用 乙型血友病（乙型血友病（乙型血友病（乙型血友病（1991199119911991年我国基因治疗成功的例子，薛京伦）年我国基因治疗成功的例子，薛京伦）年我国基因治疗成功的例子，薛京伦）年我国基因治疗成功的例子，薛京伦）XR XR XR XR，患者凝血因子，患者凝血因子，患者凝血因子，患者凝血因子缺乏，缺乏，缺乏，缺乏，因子基因定位在因子基因定位在因子基因定位在因子基因定位在Xq26.3-Xq26.3-Xq26.3-Xq26.3-q27.2q27.2q27.2q27.2。逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体+F-cDNA+F-cDNA+F-cDNA+F-cDNA 重组体重组体重组体重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 35 LTR F neo SV PSO LTR 35 LTR F neo SV PSO LTR 35 LTR F neo SV PSO LTR 3患者皮肤成纤维细胞，治疗表达患者皮肤成纤维细胞，治疗表达患者皮肤成纤维细胞，治疗表达患者皮肤成纤维细胞，治疗表达5%5%5%5%第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗21 基因治疗的应用患者皮肤成纤维细胞 基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用 黑色素瘤的基因治疗黑色素瘤的基因治疗黑色素瘤的基因治疗黑色素瘤的基因治疗 肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤浸润淋巴细胞TILTILTILTIL，它积聚肿瘤部位，并在该处，它积聚肿瘤部位，并在该处，它积聚肿瘤部位，并在该处，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗22 基因治疗的应用第十一章 基因治疗 基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用自杀基因的基因治疗自杀基因的基因治疗自杀基因的基因治疗自杀基因的基因治疗 第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗23 基因治疗的应用第十一章 基因治疗 基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用基因治疗的应用 反义核酸基因治疗反义核酸基因治疗反义核酸基因治疗反义核酸基因治疗 第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗24 基因治疗的应用第十一章 基因治疗肿瘤特异性基因治疗肿瘤特异性基因治疗从单靶点打击到多靶点网络打击从单靶点打击到多靶点网络打击 黄黄黄黄 辰辰辰辰 西安交通大学医学院西安交通大学医学院西安交通大学医学院西安交通大学医学院 环境与疾病相关基因教育部重点实验室环境与疾病相关基因教育部重点实验室环境与疾病相关基因教育部重点实验室环境与疾病相关基因教育部重点实验室遗传学17基因治疗25肿瘤特异性基因治疗从单靶点打击到多靶点网络打击 基因治疗存在的问题与论理学基因治疗存在的问题与论理学基因治疗存在的问题与论理学基因治疗存在的问题与论理学1.1.1.1.导入基因的持续性和高效表达导入基因的持续性和高效表达导入基因的持续性和高效表达导入基因的持续性和高效表达2.Gene2.Gene2.Gene2.Gene治疗与社会伦理道德（生殖细胞基因治疗）治疗与社会伦理道德（生殖细胞基因治疗）治疗与社会伦理道德（生殖细胞基因治疗）治疗与社会伦理道德（生殖细胞基因治疗）第十一章第十一章 基因治疗基因治疗遗传学17基因治疗26基因治疗存在的问题与论理学第十一章 基因治疗遗传学17基因治肿瘤生长的特点肿瘤生长的特点 多基因参与的生长调节失控多基因参与的生长调节失控 多基因参与的死亡抵抗多基因参与的死亡抵抗 多基因参与的免疫逃逸多基因参与的免疫逃逸 多基因参与的免疫抑制多基因参与的免疫抑制遗传学17基因治疗27肿瘤生长的特点 多基因参与的生长调节失控遗传学17基因治疗2 肿瘤治疗药物的缺陷肿瘤治疗药物的缺陷 单通路、单靶点药物开发单通路、单靶点药物开发 肿瘤治疗的非特异性肿瘤治疗的非特异性副作用副作用现有基因治疗的手段现有基因治疗的手段 癌基因的抑制癌基因的抑制 抑癌基因的添加抑癌基因的添加 药物敏感基因的添加药物敏感基因的添加 免疫增强免疫增强 肿瘤疫苗肿瘤疫苗遗传学17基因治疗28 肿瘤治疗药物的缺陷 单通路、单靶点药物开发现有基因治疗的 肿瘤基因治疗的靶点筛选肿瘤基因治疗的靶点筛选遗传学17基因治疗29 肿瘤基因治疗的靶点筛选遗传学17基因治疗29 ERK1/2ERK1/2在肿瘤发生过程的作用在肿瘤发生过程的作用 ERK1/2及其通路成员在多数肿瘤中过表达或突变。及其通路成员在多数肿瘤中过表达或突变。ERK1/2参与细胞周期调控。参与细胞周期调控。ERK1/2参与细胞外基质参与细胞外基质MMP-9 的表达调控。的表达调控。ERK1/2参与肿瘤化疗耐药的作用。参与肿瘤化疗耐药的作用。遗传学17基因治疗30 ERK1/2在肿瘤发生过程的作用 ERK1/2及其通路成员 RNAi是实现定点打击的理想方法是实现定点打击的理想方法Andrew Z.Fire(Stanford University photo)Craig C.Mello(University of Massachusetts Medical School)遗传学17基因治疗31 RNAi是实现定点打击的理想方法Andrew Z.FirTree of RNA TypesTree of RNA Types遗传学17基因治疗32Tree of RNA Types遗传学17基因治疗32Discovery of RNAiDiscovery of RNAiDiscovery of RNAiDiscovery of RNAiDouble-stranded RNAinjectC.elegansNeg.control UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998 391:806-811Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization遗传学17基因治疗33Discovery of RNAiDouble-strandMechanism of RNAiMechanism of RNAiMechanism of RNAiMechanism of RNAidsRNAdsRNA22nt siRNAs22nt siRNAstargettargetmRNAmRNAsecondary secondary siRNAssiRNAsamplificationamplificationprocessingprocessingdegradationdegradationrecognitionrecognitioncopyingcopying+processingprocessingspreadingspreading遗传学17基因治疗34Mechanism of RNAidsRNA22nt siMechanism of RNAiMechanism of RNAiMechanism of RNAiMechanism of RNAiC.elegansDrosophilaArabidopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1遗传学17基因治疗35Mechanism of RNAiC.elegansDroInitiation StepATPATPADP+ppiADP+ppiDICERDICERKINASEKINASERdRPRdRP遗传学17基因治疗36Initiation StepATPATPADP+ppiDicer遗传学17基因治疗37Dicer遗传学17基因治疗37siRNA55335533RISC遗传学17基因治疗38siRNA5353RISC遗传学17基因治疗38Effector Step siRNA bindingsiRNA binding siRNA unwindingsiRNA unwinding RISC activationRISC activation遗传学17基因治疗39Effector StepsiRNA binding遗传学1Examples of RNAiExamples of RNAiExamples of RNAiExamples of RNAihairpin against pigmentGFP expressed in nucleiControl dsRNAGFP specific dsRNARed=silencing of GFP遗传学17基因治疗40Examples of RNAihairpin againsChemically synthesized SiRNAChemically synthesized SiRNAAdvantagesAdvantages No hands-on timeNo hands-on time Purity of siRNA:97%by PAGE or HPLCPurity of siRNA:97%by PAGE or HPLC Synthesis can be scaled upSynthesis can be scaled up Can be labeledCan be labeled Potential therapeutic usePotential therapeutic useDisadvantagesDisadvantages Duration:inappropriate for knock-out modelDuration:inappropriate for knock-out model Price:oligo synthesizer,starting materialPrice:oligo synthesizer,starting material遗传学17基因治疗41Chemically synthesized SiRNAAdIn Vitro Transcribed siRNAs遗传学17基因治疗42In Vitro Transcribed siRNAs遗传学In Vitro Transcribed siRNAsAdvantagesAdvantages PricePrice Shorter turn-around timeShorter turn-around timeDisadvantagesDisadvantages More hands-onMore hands-on ScalabilityScalability PurityPurity Lower specificityLower specificity If long transcripted RNA,cocktail SiRNA usedIf long transcripted RNA,cocktail SiRNA used遗传学17基因治疗43In Vitro Transcribed siRNAsAdvVector-based SiRNA遗传学17基因治疗44Vector-based SiRNA遗传学17基因治疗44Vectors expressing siRNAsU6H1siRNA遗传学17基因治疗45Vectors expressing siRNAsU6H1sVectors expressing siRNAsU6Sense sequenceAnti-sense sequenceHair-pin loopSense sequenceAnti-sense sequence遗传学17基因治疗46Vectors expressing siRNAsU6SenRNAi RNAi RNAi RNAi 体内合成用各种载体的比较体内合成用各种载体的比较体内合成用各种载体的比较体内合成用各种载体的比较载载 体体费用费用长长 处处短短 处处质质质质 粒粒粒粒低低低低可以比较简单可以比较简单可以比较简单可以比较简单地大量制备地大量制备地大量制备地大量制备RNAiRNAiRNAiRNAi效果持续时间效果持续时间效果持续时间效果持续时间短，导入效率低短，导入效率低短，导入效率低短，导入效率低腺腺腺腺 病病病病 毒毒毒毒高高高高导入效率高，导入效率高，导入效率高，导入效率高，可感染静止期可感染静止期可感染静止期可感染静止期的细胞的细胞的细胞的细胞RNAiRNAiRNAiRNAi效果持续时间效果持续时间效果持续时间效果持续时间短，制备病毒较费短，制备病毒较费短，制备病毒较费短，制备病毒较费时间时间时间时间逆逆逆逆 转转转转 录录录录 病病病病 毒毒毒毒中中中中RNAiRNAiRNAiRNAi效果持续效果持续效果持续效果持续时间长时间长时间长时间长不能感染静止期的不能感染静止期的不能感染静止期的不能感染静止期的细胞细胞细胞细胞遗传学17基因治疗47RNAi 体内合成用各种载体的比较载 体费用长 处短 处RNAi RNAi RNAi RNAi 合成的方法比较合成的方法比较合成的方法比较合成的方法比较合成方法合成方法合成方法合成方法特点特点特点特点适用适用适用适用不适用不适用不适用不适用化学合成化学合成化学合成化学合成价格高价格高价格高价格高已找到最有效已找到最有效已找到最有效已找到最有效siRNAsiRNAsiRNAsiRNA，大量，大量，大量，大量筛选筛选筛选筛选体外转录体外转录体外转录体外转录毒性小，稳定毒性小，稳定毒性小，稳定毒性小，稳定 性好，效率高性好，效率高性好，效率高性好，效率高筛选筛选筛选筛选大量，特定大量，特定大量，特定大量，特定用用用用RNAIIIRNAIIIRNAIIIRNAIII消化长消化长消化长消化长片段片段片段片段节省节省节省节省快速而经济的快速而经济的快速而经济的快速而经济的研究某基因缺研究某基因缺研究某基因缺研究某基因缺失表型失表型失表型失表型不宜特定的不宜特定的不宜特定的不宜特定的siRNAsiRNAsiRNAsiRNA研究，基研究，基研究，基研究，基因沉默因沉默因沉默因沉默体内表达体内表达体内表达体内表达价格较高，常价格较高，常价格较高，常价格较高，常用用用用特定特定特定特定siRNAsiRNAsiRNAsiRNA，稳，稳，稳，稳定定定定筛选筛选筛选筛选遗传学17基因治疗48RNAi 合成的方法比较合成方法特点适用不适用化学合成价格 RNAi是实现定点打击的理想方法是实现定点打击的理想方法Huang C,Liu LY,Li ZF,Wang P,Ni L,Song LP,Xu DH,Song TS.Effects of small interfering RNAs targeting MAPK1 on gene expression pro HeLa cells as revealed by microarray analysis.Cell Biol Int.2008,32:1081-1090 遗传学17基因治疗49 RNAi是实现定点打击的理想方法Huang C,Liu RNAi是实现定点打击的理想方法是实现定点打击的理想方法遗传学17基因治疗50 RNAi是实现定点打击的理想方法遗传学17基因治疗50 RNAi是实现定点打击的理想方法是实现定点打击的理想方法 本研究证明，本研究证明，siRNAsiRNA有效抑制了有效抑制了MAPK MAPK P42P42的表达，并的表达，并为肿瘤基因治疗的理想靶点。为肿瘤基因治疗的理想靶点。遗传学17基因治疗51 RNAi是实现定点打击的理想方法 本研究证明，siR 肿瘤特异性表达系统是实现定点打击的前提肿瘤特异性表达系统是实现定点打击的前提国家自然科学基金（嵌合式肿瘤特异性启动子调节的国家自然科学基金（嵌合式肿瘤特异性启动子调节的ERK1/2 shRNAERK1/2 shRNA在肝癌基因治疗中的实验研究，起止年月在肝癌基因治疗中的实验研究，起止年月2009.12009.120011.1220011.12，批准号：。黄辰，主持人。），批准号：。黄辰，主持人。）陕西省科技攻关项目（启动子调控的陕西省科技攻关项目（启动子调控的MAPK p42/44 shRNAMAPK p42/44 shRNA胰腺癌治疗中的实验研究，起止年月胰腺癌治疗中的实验研究，起止年月2007.12007.12009.122009.12，批准号：批准号：2006K09-G7-1 2006K09-G7-1。黄辰，主持人。）。黄辰，主持人。）申报发明专利两项（申报发明专利两项（siRNAsiRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，申请号：白融合靶基因表达载体，申请号：2.42.4；肿瘤特异性启动；肿瘤特异性启动子调控的串联子调控的串联miRNAmiRNA或或shRNAshRNA表达载体，申请号表达载体，申请号:2.9):2.9)遗传学17基因治疗52 肿瘤特异性表达系统是实现定点打击的前提国家自然科学基金（嵌miRNA DetailsmiRNA Details Originate from capped&polyadenylated full length Originate from capped&polyadenylated full length precursors(pri-miRNA)precursors(pri-miRNA)Hairpin precursor 70 nt(pre-miRNA)Hairpin precursor 70 nt(pre-miRNA)Mature miRNA 22 nt(miRNA)Mature miRNA 22 nt(miRNA)First discovered in 1993 by Victor Ambros at Harvard(First discovered in 1993 by Victor Ambros at Harvard(lin-lin-4 4)Let-7Let-7 discovered in 2000 by Frank Slack as a postdoc at discovered in 2000 by Frank Slack as a postdoc at Harvard(Ruvkun lab)Harvard(Ruvkun lab)遗传学17基因治疗53miRNA DetailsOriginate from caIllustration of miRNA processingIllustration of miRNA processing遗传学17基因治疗54Illustration of miRNA processiIllustration of miRNA processingIllustration of miRNA processing遗传学17基因治疗55Illustration of miRNA processiProcessing bodies are sites of storage and/or Processing bodies are sites of storage and/or degradation of mRNAdegradation of mRNA遗传学17基因治疗56Processing bodies are sites ofStudy Methods on MicroRNAs应用杂交方法的小应用杂交方法的小应用杂交方法的小应用杂交方法的小RNARNARNARNA表达检测表达检测表达检测表达检测 应用应用应用应用PCRPCRPCRPCR方法的小方法的小方法的小方法的小RNARNARNARNA表达检测表达检测表达检测表达检测 PAGE/Northern PAGE/Northern PAGE/Northern PAGE/Northern 杂交杂交杂交杂交基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片(microarray)(microarray)(microarray)(microarray)锁定的核苷酸原位杂交锁定的核苷酸原位杂交锁定的核苷酸原位杂交锁定的核苷酸原位杂交(LNA-ISH)(LNA-ISH)(LNA-ISH)(LNA-ISH)磁珠磁珠磁珠磁珠-流式细胞仪法流式细胞仪法流式细胞仪法流式细胞仪法 实时定量实时定量实时定量实时定量PCRPCRPCRPCR遗传学17基因治疗57Study Methods on MicroRNAs应用实时定量实时定量实时定量实时定量PCRPCRPCRPCR检测小检测小检测小检测小RNARNARNARNA表达表达表达表达遗传学17基因治疗58实时定量PCR检测小RNA表达遗传学17基因治疗58Study Methods on MicroRNAs遗传学17基因治疗59Study Methods on MicroRNAs遗传学1基因芯片为肿瘤相关基因芯片为肿瘤相关miRNAmiRNA提供了筛选手段提供了筛选手段Yu Yao,Zong-fang Li,Li-ying Liu,Lei Ni,Wang-gang Zhang,and Tusheng Song,Chen Huang.Micro-RNA profiling in human gastric cancer.Mol Med Rep 2009,2:963-970遗传学17基因治疗60基因芯片为肿瘤相关miRNA提供了筛选手段Yu Yao,Z