现代生物分析技术5概论课件

2024/7/5第五章第五章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法一、一、高效液相色谱高效液相色谱仪仪HPLC二、高效液相色谱法的特点二、高效液相色谱法的特点feature of HPLC三、流程及主要部件三、流程及主要部件general process and main assembly of HPLC第一节第一节高效液相色谱的高效液相色谱的特点与仪器特点与仪器high performance liquid chromatographfeature and instrument of HPLC2023/8/13第五章第五章高效液相色谱分析法一、高效液相色谱高效液相色谱分析法一、高效液相色谱2024/7/5一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph2023/8/13一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器 high perfor2024/7/5液相色谱仪（液相色谱仪（2）2023/8/13液相色谱仪（液相色谱仪（2）2024/7/5液相色谱仪（液相色谱仪（3）2023/8/13液相色谱仪（液相色谱仪（3）2024/7/5液相色谱仪（液相色谱仪（4）2023/8/13液相色谱仪（液相色谱仪（4）2024/7/5Types of Liquid ChromatographyGravity Chrom.Tsvett,1903Flash Chrom.1978Waters 1525UPLC 2004(TLC)PaperChrom.2023/8/13Types of Liquid Chrom2024/7/5二、二、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 特点：特点：高压高压（15-35MPa）、）、高效高效（大于（大于30000塔板塔板/米）、米）、高灵敏高灵敏（10-9紫外检测，紫外检测，10-11荧光检测）荧光检测）高沸点、热不稳定有机及生化试样高沸点、热不稳定有机及生化试样（80%）的高效分离分析方法。的高效分离分析方法。2023/8/13二、高效液相色谱法的特点二、高效液相色谱法的特点 feature2024/7/52023/8/132024/7/5气相色谱和高效液相色谱的比较气相色谱和高效液相色谱的比较 气相色谱气相色谱 高效液相色谱高效液相色谱1.只能分析挥发性的物质，只能分析20%的化合物几乎可以分析各种物质2.不能用于热不稳定物质的分析可用于热不稳定物质的分析3.用毛细管柱色谱可得到很高的柱效色谱柱不能很长柱效不会很高4.有很灵敏的ECD和较灵敏的FID和TCD没有很高灵敏度的检测器5.流动相无毒，易于处理流动相有毒，费用较高6.运动操作容易比GC难7.仪器制造难度较小制造难度较大8.温度梯度溶剂 梯度9.不参加分离。参加分离2023/8/13气相色谱和高效液相色谱的比较气相色谱和高效液相色谱的比较 现代生物分析技术现代生物分析技术5概论课件概论课件CHROMATOGRAPHYQuantity vs Resolution vs Speed CHROMATOGRAPHY2024/7/5三、流程及主要部件三、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.流程流程2023/8/13三、流程及主要部件三、流程及主要部件 process an2024/7/5色谱柱进样阀流动相检测器高压泵脱气装置 2.主要部件主要部件2023/8/13色谱柱进样阀流检测器高压泵脱气装置色谱柱进样阀流检测器高压泵脱气装置 2.主主2024/7/5（1）流动相贮罐）流动相贮罐 常使用1L的锥形瓶，在连接到泵入口处的管线上时要加一个吸滤头(2um过滤芯)，以防止溶剂中的固体颗粒进入泵。2.主要部件主要部件使用高纯度的流动相脱去流动相中的溶解气体高效液相色谱的流动相 选择流动相时，首先要考虑溶剂的物理性质，如沸点，粘度，紫外吸收的波长范围；其次要考虑的是溶剂对所要分离样品的容量因子。一般来说选择较低沸点和较低粘度的溶剂2023/8/13（1）流动相贮罐）流动相贮罐2.主要部件使用高纯度的流主要部件使用高纯度的流吸滤头2024/7/5吸滤头的清洗方法：吸滤头的清洗方法：用异丙醇（或510稀硝酸），超声波清洗5分钟，再用蒸馏水清洗。吸滤头吸滤头2023/8/13吸滤头的清洗方法：用异丙醇（或吸滤头的清洗方法：用异丙醇（或51保存于棕色玻璃瓶中的超纯水保存于棕色玻璃瓶中的超纯水 保存于棕色玻璃瓶中的超纯水保存于棕色玻璃瓶中的超纯水 2024/7/5(2)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（BC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系2023/8/13正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中2024/7/5三、三、离子交换色谱离子交换色谱ion-exchange chromatography 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流流动动相相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基基本本原原理理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3H +M+=RSO3 M +H+阴离子交换：RNR4OH +X-=RNR4 X+OH-应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2023/8/13三、三、离子交换色谱离子交换色谱ion-exchang2024/7/5四、四、离子色谱离子色谱ion chromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。有关内容将在第五节中讲授。2023/8/13四、四、离子色谱离子色谱ion chromatog2024/7/5五、五、离子对色谱离子对色谱ion pair chromatography 原原理理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴阴离离子子分分离离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳阳离离子子分分离离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反反相相离离子子对对色色谱谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。2023/8/13五、五、离子对色谱离子对色谱ion pair chr2024/7/5I-(m)+D+(m)n离子对模型固固定定相相（s）流动相（m）DI（m）DI（s）疏水作用反离子药物离子离子对2023/8/13I-(m)离子对模型固流动相（离子对模型固流动相（m）DI（2024/7/5六、六、排阻色谱色谱排阻色谱色谱size-exclusion chromatography 固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原原理理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 2023/8/13六、六、排阻色谱色谱排阻色谱色谱size-exclu2024/7/5七、七、亲和色谱亲和色谱(AC)Affinity chromatograph 原原理理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2023/8/13七、七、亲和色谱亲和色谱(AC)Affinity2024/7/5第五章第五章液相色谱分析法液相色谱分析法一、一、液相色谱固定相液相色谱固定相stationary phase of HPLC二、液相色谱流动相二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC第三节第三节液相色谱的固定相与液相色谱的固定相与流动相流动相high performance liquid chromatographstationary phase and mobile phase of HPLC2023/8/13第五章第五章液相色谱分析法一、液相色谱固定相第液相色谱分析法一、液相色谱固定相第2024/7/5一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相 stationary phases of LC 1.1.液液-液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2023/8/13一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相 stat2024/7/5（3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN2023/8/13（3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合化学键合2024/7/5化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；存存在在着着双双重重分分离离机机制制：疏疏溶溶剂剂理理论论和和双双保保留留机机制制（疏疏溶溶剂和亲硅醇基效应），剂和亲硅醇基效应），键合基团的覆盖率决定分离机理。高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；2023/8/13化学键合固定相的特点（化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深）传质快，表面无深C18柱2024/7/5C18柱柱2023/8/132024/7/52023/8/13反相与正相色谱固定相2024/7/5反相与正相色谱固定相反相与正相色谱固定相2023/8/132024/7/5 2.2.液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：510 m；2023/8/13 2.液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类种类2024/7/53.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：（1）阳阳离离子子交交换换树树脂脂（强强酸酸性、弱酸性）性、弱酸性）（2）阴阴离离子子交交换换树树脂脂（强强碱碱性、弱碱性）性、弱碱性）2023/8/133.离子交换色谱分离固定相离子交换色谱分离固定相 结构结构2024/7/5 4.4.空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2023/8/13 4.空间排阻分离固定相（空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶2024/7/52023/8/132024/7/5二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC 1.1.流动相特性流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2023/8/13二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相 mo2024/7/52.2.流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常常用用溶溶剂剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023/8/132.流动相类别流动相类别 按流动相按流动相2024/7/53.3.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2023/8/133.流动相选择流动相选择 在选择溶剂在选择溶剂2024/7/54.4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2023/8/134.选择流动相时应注意的几个问题（选择流动相时应注意的几个问题（1）尽）尽例：反相色谱流动相优化例：反相色谱流动相优化1、有机相强度选择 先用强溶剂（如100%乙腈）洗脱一定时间（约30min），以保证非极性强保留成分完全被洗脱，然后以20%的比例递减有机相比例，根据经验规律（称为3的规律）：有机相降低10%，k增加约3倍，可以较快找到较合适的有机相比例。或采用梯度洗脱（5%-100%有机相）进行首次实验。例：反相色谱流动相优化例：反相色谱流动相优化甲醇甲醇%乙腈乙腈%四氢呋喃四氢呋喃%相对容量因子相对容量因子n 0 0 0 100n 10 6 4 40n 20 14 10 16n 30 22 17 6n 40 32 23 2.5n 50 40 30 1n 60 50 37 0.4n 70 60 45 0.2n 80 73 53 0.06n 90 86 63 0.03n 100 100 72 0.01RH-HPLC等溶剂强度混合物等溶剂强度混合物甲醇甲醇%乙腈乙腈%四氢呋喃四氢呋喃甲醇-水四氢呋喃-水乙腈-水 2、有机相选择：、有机相选择：保持强度不变，保持强度不变，更换有机相种类。更换有机相种类。：-=1：1；：-=1：1：-=1：1；：-=1：1：1 甲醇甲醇-水水 四氢呋喃四氢呋喃-水水 乙腈乙腈-水水2、有机相选、有机相选2024/7/5第五章第五章液相色谱分析法液相色谱分析法一、一、影响分离的因素影响分离的因素factors influenced separation二、分离类型的选择二、分离类型的选择choice of separation types三、液相色谱的应用三、液相色谱的应用application of HPLC四、液相制备色谱四、液相制备色谱preparative liquid chromatography第四节第四节影响分离的因素与操影响分离的因素与操作条件的选择作条件的选择high performance liquid chromatograph factors influenced separation and choice of operation condition2023/8/13第五章第五章液相色谱分析法一、影响分离的因素第液相色谱分析法一、影响分离的因素第2024/7/5一、一、影响分离的因素影响分离的因素 factors influenced separation1.1.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。2023/8/13一、影响分离的因素一、影响分离的因素 factors in2024/7/5 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2023/8/13 液体的黏度比气体大一百倍液体的黏度比气体大一百倍2024/7/5 2.2.流速流速 流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。3.3.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2023/8/13 2.流速流速 流速大于流速大于0.5 cm粒径影响粒径影响2024/7/5粒径影响粒径影响2023/8/132024/7/5pH 影响保留时间影响保留时间1.Salicylic acid2.Phenobarbitone3.Phenacetin4.Nicotine5.Methylampohetamine30 x0.4 cm C-18,10 m mm,2 mL/min,UV 220 nmSnyder and Kirkland,Introduction to Modern Liquid Chromatography,Wiley,1979,p.288.2023/8/13pH 影响保留时间影响保留时间1.SalicylicRP-HPLC：等度洗脱：等度洗脱2024/7/5A:KH2PO4(aq)B:CH3CN(l)RP-HPLC：等度洗脱：等度洗脱2023/8/13A:KH2PORP-HPLC：梯度洗脱：梯度洗脱2024/7/5RP-HPLC：梯度洗脱：梯度洗脱2023/8/132024/7/5二、分离类型选择二、分离类型选择 choice of separation types2023/8/13二、分离类型选择二、分离类型选择 choice of s2024/7/5三、三、HPLC的的应用应用 application of HPLC 1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：示差折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2023/8/13三、三、HPLC的应用的应用 applicati2024/7/52.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器2023/8/132.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为稠环芳烃多为2024/7/5四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子柱效下降一半或容量因子k降降低低10%为宜。为宜。2023/8/13四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱 preparativ柱效：H=L/N2024/7/5柱效：柱效：H=L/N2023/8/132024/7/52.2.液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。2023/8/132.液相制备色谱的方法收集组分时，通常有液相制备色谱的方法收集组分时，通常有2024/7/53.3.制备型液相色谱制备型液相色谱 制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱制备柱：内径2050mm，柱长50cm。2023/8/133.制备型液相色谱制备型液相色谱 制制2024/7/5第五章第五章液相色谱分析法液相色谱分析法一、离子色谱法原理一、离子色谱法原理principle of IC二、离子色谱连续抑制装置二、离子色谱连续抑制装置suppressed apparatus of IC三、离子色谱的应用三、离子色谱的应用application of IC第五节第五节离子色谱法离子色谱法high performance liquid chromatographion chromatograph,IC2023/8/13第五章第五章液相色谱分析法一、离子色谱法原理第液相色谱分析法一、离子色谱法原理第2024/7/5离子色谱仪离子色谱仪2023/8/13离子色谱仪离子色谱仪2024/7/5一、离子色谱法原理一、离子色谱法原理 principle of IC(Ion Chromatography,简称IC)以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在七十年代出现、八十年代迅速发展。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。2023/8/13一、离子色谱法原理一、离子色谱法原理 2024/7/51.1.离子色谱法原理离子色谱法原理 离离子子交交换换原原理理，与与传传统统离离子子交交换的不同点：换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。2023/8/131.离子色谱法原理离子色谱法原理 离子交换原理，与离子交换原理，与2024/7/52.2.离子色谱具有以下优点离子色谱具有以下优点（1 1）分析速度快）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2 2）分离能力高）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2023/8/132.离子色谱具有以下优点（离子色谱具有以下优点（1）分析速度快）分析速度快 2024/7/5二、离子色谱装置类型二、离子色谱装置类型 suppressed apparatus of IC抑制型：抑制柱型、连续抑制型抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂。非抑制型非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。2023/8/13二、离子色谱装置类型二、离子色谱装置类型 suppre2024/7/5离子色谱连续抑制装置图离子色谱连续抑制装置图2023/8/13离子色谱连续抑制装置图离子色谱连续抑制装置图2024/7/5离子色谱连续抑制原理图离子色谱连续抑制原理图2023/8/13离子色谱连续抑制原理图离子色谱连续抑制原理图2024/7/5三、离子色谱的应用三、离子色谱的应用 application of IC 阴离子分析阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。2023/8/13三、离子色谱的应用三、离子色谱的应用 applicatio2024/7/5第五章 液相色谱分析法一、一、超临界流体色谱的特点超临界流体色谱的特点与原理与原理feature and principle of SFC二二、超临界流体色谱仪的结、超临界流体色谱仪的结构流程构流程structure and general process of SFC 三、超临界流体色谱的应用三、超临界流体色谱的应用application of SFC第六节 超临界色谱high performance liquid chromatographsupercritical fluid chromatograph,SFC2023/8/13第五章第五章 液相色谱分析法一、超临界流体色液相色谱分析法一、超临界流体色2024/7/5一、一、超临界流体色谱的特点与原理principle and character of supercritical fluid chromatography1.1.概述概述 超超临临界界流流体体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1 1）可可处处理理高高沸沸点点、不不挥挥发发试试样；样；（2 2）比比LCLC有有更更高高的的柱柱效效和和分分离离效率。效率。2023/8/13一、超临界流体色谱的特点与原理一、超临界流体色谱的特点与原理princ2024/7/52.超临界流体性质（1 1）性质介于液体和气体之间）性质介于液体和气体之间;具具有有气气体体的的低低黏黏度度、液液体体的的高高密密度度，扩扩散散系系数数位位于于两两者之间。者之间。（2 2）可可通通过过改改变变超超临临界界流流体体的的密密度度（程程序序改改变变）调调节节组组分分分分离离（类类似似于于气气相相色色谱谱的的程程序序升升温温，液液相相色色谱谱中中的的梯梯度度淋淋洗）。洗）。超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。2023/8/132.超临界流体性质（超临界流体性质（1）性质介于液体和气）性质介于液体和气2024/7/53.原理 SFC的流动相的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFCSFC的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC；分离机理：分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；2023/8/133.原理原理 SFC的流动相：超临界流体的流动相：超临界流体2024/7/5压力效应：SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小；压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。CO2流动相，当压力改变：7.09.0106 Pa，则：C16H34的保留时间 25min 5min。2023/8/13压力效应：压力效应：SFC的柱压降大（比毛细的柱压降大（比毛细2024/7/5程序升压2023/8/13程程序序升升压压2024/7/5HPLC与SFC比较2023/8/13HPLC与与SFC比较比较2024/7/5二、二、超临界流体色谱的结构与流程instrument structure and the general process of SFC1.1.结构流程结构流程 2023/8/13二、超临界流体色谱的结构与流程二、超临界流体色谱的结构与流程instru2024/7/52.主要部件（1 1）SFCSFC的高压泵的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；（2 2）SFCSFC的色谱柱和固定相的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；2023/8/132.主要部件（主要部件（1）SFC的高压泵的高压泵2024/7/5主要部件（3 3）流动相流动相 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；（4 4）检测器）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器2023/8/13主要部件（主要部件（3）流动相）流动相2024/7/5三、三、超临界流体色谱的应用 application of SFC1.1.聚苯醚低聚物的分析聚苯醚低聚物的分析色谱柱：10m 63m i.d.毛细管柱，固定相：键合二甲基聚硅氧烷；流动相：CO2；柱温：120 C；程序升压；2023/8/13三、超临界流体色谱的应用三、超临界流体色谱的应用 ap2024/7/52.甘油三酸酯的分析 四种组分仅双键数目和位置不同，难分离；色谱柱：DB-225 SFC毛细管柱；流动相：CO2；从15MPa程序升压到27MPa；2.5hr完全分离。2023/8/132.甘油三酸酯的分析甘油三酸酯的分析 四种组分仅双键四种组分仅双键思考题思考题2024/7/51、液相色谱仪的主要组成？、液相色谱仪的主要组成？2、UV、RI和和ELSD的基本原理及其应用范围？的基本原理及其应用范围？3、液液相相色色谱谱法法按按原原理理可可分分为为哪哪几几种种？它它们们的的基基本原理？本原理？4、液相色谱分离能从哪些方面进行优化？、液相色谱分离能从哪些方面进行优化？思考题思考题2023/8/131、液相色谱仪的主要组成？、液相色谱仪的主要组成？