致突变作用食品毒理学

第 八 章 致 突 变 作 用 一 、 基 本 概 念 二 、 突 变 类 型 三 、 突 变 的 发 生 与 修 复 机 制 四 、 致 突 变 试 验 与 致 突 变 作 用 评 定 一 、 基 本 概 念 二 、 化 学 毒 物 致 突 变 的 类 型 二 、 化 学 毒 物 致 突 变 的 类 型 （ 二 ） 染 色 体 畸 变 (chromosome aberration) 1、 指 染 色 体 的 结 构 改 变 染 色 单 体 型 畸 变 (chromatid-type aberration) 染 色 体 型 畸 变 (chromosome aberration) 染 色 体 畸 变裂隙( gap) 断裂(break) 断片(fragment) 和缺失(deletion) 微小体(minute body) 无着丝点环 环状染色体 双着丝点染色体 倒位(inversion) 易位(translocation) 插入(insertion) 和重复(duplication) 辐射体 2、 染 色 体 数 目 异 常 体 细 胞 二 倍 体 （ 2n） ； 生 殖 细 胞单 倍 体 。 正 常 体 细 胞 染 色 体 数 目2n为 标 准 ， 分 整 倍 性 畸 变 和 非 整倍 性 畸 变 。 整 倍 性 畸 变 指 染 色 体数 目 的 异 常 是 以 染 色 体 组 为 单 位的 增 减 ， 非 整 倍 性 畸 变 系 指 比 二倍 体 多 或 少 一 条 或 多 条 染 色 体 。 (1) 非 整 倍 体 非 整 倍 体 (aneuploid)指 细 胞 丢 失 或 增加 一 条 或 几 条 染 色 体 。 缺 失 一 条 染 色 体 时 称 为 单 体(monosome)， 增 加 一 条 染 色 体 时 称 为 三 体 (trisome)。染 色 体 数 目 的 改 变 会 导 致 基 因 平 衡 的 失 调 ， 可 能 影 响细 胞 的 生 存 或 造 成 形 态 及 功 能 上 的 异 常 。 如 21三 体 导致 先 天 愚 型 (Down氏 综 合 征 )。 （ 2） 整 倍 体 整 倍 体 (euploid)指 染 色 体 数 目 的 异 常是 以 染 色 体 组 为 单 位 的 增 减 ， 如 形 成 三 倍 体(triploid)、 四 倍 体 (tetroploid)等 。 在 人 体 ， 3n为69条 染 色 体 ， 4n为 92条 染 色 体 。 在 肿 瘤 细 胞 及 人 类 自然 流 产 的 胎 儿 细 胞 中 可 有 三 倍 体 细 胞 的 存 在 。 发 生 于生 殖 细 胞 的 整 倍 体 改 变 ， 几 乎 都 是 致 死 性 的 。 三 、 化 学 毒 物 致 突 变 作 用 机 制 及 后 果 （ 一 ） 化 学 毒 物 致 突 变 作 用 机 制 1、 直 接 以 DNA为 靶 的 诱 变 DNA加 合 物 形 成 碱 基 类 似 物 取 代 ： 如 5 溴 脱 氧 尿 嘧 啶 核 苷 能 取 代 胸腺 嘧 啶 ， 2 氨 基 嘌 呤 (2-AP） 能 取 代 鸟 嘌 呤 烷 化 剂 的 影 响 ： 甲 基 化 乙 基 化 高 碳 烷 基 化 致 突 变 物 改 变 或 破 坏 碱 基 的 化 学 结 构 化 学 物 破 坏或 改 变 碱 基 的 结 构 ， 有 时 还 引 起 链 断 裂 。 平 面 大 分 子 嵌 入 DNA链 DNA 蛋 白 质 交 联 物 二 聚 体 的 形 成 (二 )、 不 以 DNA 为 靶 的 间 接 诱 变 （ 纺 锤 体抑 制 、 对 酶 促 过 程 的 作 用 ） 化 学 物 的 间 接 诱 变 可 能 是 通 过 对 纺 锤 体 作用 或 干 扰 与 DNA合 成 和 修 复 有 关 的 酶 系 统。 1、 纺 锤 体 抑 制 ： 一 些 化 学 物 能 作 用 于纺 锤 体 ， 中 心 粒 或 其 他 核 内 细 胞 器 ， 从 而干 扰 有 丝 分 裂 过 程 。 诱 发 这 种 作 用 的 物 质称 为 有 丝 分 裂 毒 物 ， 又 称 干 扰 剂 。 2、 对酶 促 过 程 的 作 用 ： 对 DNA合 成 和 复 制 有 关的 酶 系 统 作 用 也 可 间 接 影 响 遗 传 物 质 。 (二 )突 变 后 果 1、 体 细 胞 突 变 的 后 果 、 最 受 注 意 的 是 致 癌问 题 ； 、 胚 胎 体 细 胞 突 变 可 能 导 致 畸 胎 ； 、 致 突 变 物 透 过 胎 盘 作 用 于 胚 胎 体 细 胞 导 致 流产 。 2、 生 殖 细 胞 突 变 的 后 果 、 致 死 性 影 响 ： 可 能是 显 性 致 死 或 隐 性 致 死 。 、 非 致 死 性 影 响 ： 出现 显 性 或 隐 性 遗 传 性 疾 病 （ 含 先 天 性 畸 形 ） 。 、 将 使 基 因 库 的 遗 传 负 荷 增 加 。（ 三 ） 突 变 的 修 复 机 制 修 复 (repairing) ： 是 对 已 发 生 分 子 改 变 的 补 偿措 施 ， 使 其 回 复 为 原 有 的 天 然 状 态 。 修 复 的 主 要 类 型 ： 1 光 修 复 2 切 除 修 复 3重 组 修 复 4 SOS修 复 四 、 致 突 变 试 验 方 法（ 一 ） 回 复 突 变 试 验 1 细 菌 回 复 突 变 试 验 (1) 细 菌 回 复 突 变 假 如 有 致 突 变 物 存 在 ， 则 营 养 缺 陷 型 的 细 菌 回 复突 变 成 原 养 型 ， 因 而 能 在 营 养 缺 乏 的 培 养 基 上 生长 形 成 菌 落 ， 根 据 此 判 断 受 试 物 是 否 致 突 变 物 。如 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 组 氨 酸 营 养 缺 陷 型 菌 株 。（ 2） 真 核 微 生 物 回 复 突 变 试 验 真 核 微 生 物 可 以 检 测 基 因 突 变 和 染 色 体 损 伤 。 常用 的 酿 造 酵 母 菌 株 有 ： D3,D4,D7等 。 2、 哺 乳 动 物 细 胞 细 胞 基 因 突 变 试 验 试 验 原 理 在 加 入 和 不 加 入 代 谢 活 化 系 统 的 条 件 下， 使 细 胞 暴 露 于 受 试 物 一 定 时 间 ， 然 后将 细 胞 再 传 代 培 养 ， 突 变 细 胞 在 含 有 6-硫代 鸟 嘌 呤 （ 6-thioguanine， 6-TG） 或 三 氟胸 苷 （ trifluorothymidine， TFT） 的 选 择性 培 养 液 中 能 继 续 分 裂 并 形 成 集 落 。 基于 突 变 集 落 数 ， 计 算 突 变 频 率 以 评 价 受试 物 的 致 突 变 性 。 3、 果 蝇 伴 性 隐 性 致 死 试 验 果 蝇 伴 性 隐 性 致 死 试 验 ： 是 利 用 隐 性 基 因 在 伴性 遗 传 中 的 交 叉 特 征 检 出 各 类 点 突 变 的 试 验 。 试 验 原 理 ： 隐 性 基 因 在 伴 性 遗 传 中 的 交 叉 遗 传特 征 ， 即 雄 蝇 的 X染 色 体 传 给 F1代 雌 蝇 ， 又 通过 F1代 传 给 F2代 雄 蝇 。 X染 色 的 隐 性 突 变 基 因在 F1代 雌 蝇 为 杂 合 体 ， 不 能 表 达 ， 而 在 F2代 雄蝇 为 半 合 体 ， 能 表 达 出 来 。 如 果 雄 蝇 接 着 受 试物 后 X染 色 体 出 现 隐 性 致 死 性 突 变 ， 结 果 其 F2代 雄 蝇 数 目 较 少 雌 蝇 少 一 半 。 据 此 推 断 致 死 突变 的 存 在 。 4、 染 色 体 分 析 （ 1） 染 色 体 畸 变 分 析 （ chromosome assy) 主 要 观 察 染 色 体 的 结 构 畸 变 和 数 目 畸 变 （ 2) 微 核 试 验 (micronucleus test, MNT) 能 检 察 出 断 裂 剂 和 有 丝 分 裂 毒 物 （ 3） 姐 妹 染 色 体 交 换 试 验 （ sister chromatid exchange assay, SCE) 现 在 以 广 泛 用 于 筛 选 食 品 中 化 学 物 致 突变 。 5、 显 性 致 死 试 验 显 性 致 死 试 验 ： 使 雄 性 大 鼠 或 小 鼠 接 着 受 试 物， 然 后 使 之 与 未 接 着 该 物 质 的 雌 性 大 鼠 或 小 鼠交 配 ， 观 察 胚 胎 死 亡 情 况 。 6、 小 鼠 可 遗 传 易 位 试 验 用 于 检 测 受 试 物 引 起 雄 性 小 鼠 生 殖 细 胞 染 色 体相 互 易 位 的 作 用 。 7、 细 菌 DNA修 复 试 验 本 试 验 对 检 测 能 与 DNA形 成 加 合 物 或 嵌 入 作 用的 化 学 物 较 为 敏 感 ； 对 于 阻 滞 DNA促 旋 酶 （gyrase);诱 发 DNA与 蛋 白 质 交 联 、 碱 基 置 换 和 移码 的 化 学 物 也 可 出 。 8、 非 程 序 性 DNA合 成 试 验 （ USD试 验 ） 原 理 正 常 情 况 下 ， 于 细 胞 有 丝 分 裂 周 期 中 ， 仅S期 是 DNA合 成 期 。 当 DNA受 损 伤 时 ， 损 伤 修复 的 DNA合 成 主 要 在 其 他 细 胞 周 期 ， 称 程 序 外DNA合 成 ， 即 UDS， 因 此 发 现 UDS增 高 ， 即 表明 DNA发 生 过 损 伤 。 9、 精 子 畸 形 试 验原 理 ： 已 知 精 子 畸 形 是 决 定 精 子 形 成 的 基 因 发 生突 变 的 结 果 。 常 染 色 体 和 Y-性 连 锁 基 因 突 变 及某 些 染 色 体 重 排 ， 如 性 -常 染 色 体 易 位 ， 也 可 使精 子 发 生 畸 形 。 小 鼠 精 子 畸 形 试 验 能 评 价 受 试物 对 精 子 生 成 、 发 育 的 影 响 ， 可 检 测 受 试 物 在体 内 对 生 殖 细 胞 的 遗 传 毒 性 作 用 。 10、 小 鼠 特 异 基 因 座 试 验 特 异 基 因 座 试 验 (SLT)是 利 用 两 种 品 系 的小 鼠 ， 一 种 为 T型 ， 其 有 几 个 与 毛 色 、 眼色 和 耳 型 有 关 的 隐 性 突 变 基 因 的 纯 合 子； 另 一 种 为 3H1或 C57BL系 ， 不 具 有 这 些基 因 的 野 生 型 ， 使 后 一 种 小 鼠 接 触 受 试物 ， 使 之 与 T系 交 配 。 如 果 受 试 物 未 能 使相 应 位 点 发 生 突 变 ， 则 杂 交 一 代 为 杂 合子 ， T系 的 隐 性 基 因 不 能 表 达 ， 如 果 发 生了 突 变 ， 则 相 应 的 隐 性 基 因 可 于 出 生 时或 断 乳 时 表 达 。 五 、 致 突 变 作 用 评 价 美 国 EPA毒 物 处 (1936)提 出 了 一 个 三 阶 段 的 试 验 方 案 ， 把 遗 传 毒 性 检 测 和 生 殖 细 胞 致突 变 性 验 证 分 阶 段 进 行 。 第 一 阶 段 测 试 化 学 物 的 遗 传 毒 性 ， 包 括 Ames试 验 、 体 外 哺 乳 动 物 细 胞 基 因 突 变 试 验 、 体 内骨 髓 染 色 体 损 伤 试 验 (微 核 试 验 或 染 色 体 畸 变 试 验 )； 第 二 阶 段 测 试 对 生 殖 细 胞 的 致 突 变 作 用 ； 第 三 阶 段 为 哺 乳 动 物 生 殖 细 胞 致 突 变 性 标 准 试 验 。 在 遗 传 危 害 性 评 价 时 ， 在 体 外 基 因 突 变 试 验 中 呈 阳 性 的 化 学 物 应 进 行 与 哺 乳 类 性 腺 DNA相互 作 用 的 试 验 ， 包 括 睾 丸 细 胞 的 SCE、 UDS、 染 色 体 畸 变 及 碱 性 洗 脱 试 验 等 ， 也 可 进 行 显性 致 死 试 验 ， 在 第 二 阶 段 中 出 现 阳 性 反 应 ， 需 进 行 小 鼠 特 异 座 位 试 验 ， 可 观 察 形 态 改 变 或生 化 改 变 ； 在 体 内 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 或 微 核 试 验 中 呈 阳 性 的 化 学 物 需 进 行 显 性 致 死试 验 ， 在 第 二 阶 段 中 出 现 阳 性 反 应 ， 再 进 行 小 鼠 可 遗 传 易 位 试 验 。 五 、 致 突 变 作 用 评 价 国 际 协 调 组 织 (1CH)(1997)对 于 药 品 的 遗 传 毒 性 评 价 建 议 的 检 测 试验 组 合 为 细 菌 基 因 突 变 试 验 ； 体 外 哺 乳 动 物 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 或 体 外 小 鼠 淋 巴 瘤 细 胞 比 试 验； 体 内 啮 齿 类 造 血 细 胞 染 色 体 损 伤 试 验 (骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 或骨 髓 或 外 周 血 多 染 红 细 胞 微 核 试 验 )。 在 对 经 标 准 试 验 组 合 得 到 的 致 突 变 作 用 结 果 进 行 进 一 步 研 究 时 ， 其他 试 验 如 DNA加 合 物 测 定 、 DNA链 断 裂 检 测 、 DNA修 复 和 重 组 试 验等 都 可 作 为 供 选 择 的 试 验 。 对 于 在 三 项 标 准 试 验 中 为 阴 性 的 化 学 物， 通 常 可 认 为 其 无 遗 传 毒 性 作 用 。 但 对 于 构 效 关 系 显 示 有 可 能 具 致癌 性 或 致 突 变 性 ， 但 在 三 项 标 准 试 验 中 为 阴 性 的 化 学 物 ， 还 需 要 改进 试 验 方 法 或 再 增 加 试 验 项 目 。 对 于 在 三 项 标 准 试 验 中 为 阴 性 ， 但 致 癌 试 验 显 示 有 致 癌 效 应 ， 又 无 明 确 的 证 据 说 明 该 化 学 物 是 通 过 非遗 传 毒 性 机 制 发 挥 作 用 时 ， 为 了 了 解 其 作 用 方 式 ， 可 再 进 行 改 变 代谢 活 化 系 统 的 体 外 试 验 或 应 用 肿 瘤 发 生 的 靶 器 官 进 行 遗 传 损 伤 试 验 (如 肝 脏 UDS试 验 、 DNA加 合 物 检 测 、 转 基 因 突 变 检 测 、 肿 瘤 相 关 基因 的 遗 传 改 变 检 测 )。 五 、 致 突 变 作 用 评 价 我 国 卫 生 部 在 食 品 安 全 性 毒 理 学 评 价 程 序 (1994)中 对 遗 传 毒 理 学 试 验 的 要 求 是 ： 根 据 受 试 物 的 化 学 结 构 、 理 化 性 质 以 及 对 遗 传 物 质 作 用 终 点的 不 同 ， 并 兼 顾 体 外 和 体 内 试 验 以 及 体 细 胞 和 生 殖 细 胞 的 原则 ， 在 Ames路 试 验 、 小 鼠 骨 髓 微 核 试 验 或 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸变 试 验 、 小 鼠 精 子 畸 形 试 验 和 睾 丸 染 色 体 畸 变 试 验 中 选 择 四项 ， 如 其 中 一 项 试 验 为 阳 性 ， 还 应 在 其 他 备 选 试 验 (V79细 胞HGPRT基 因 突 变 试 验 ， 显 性 致 死 试 验 ， 果 蝇 伴 性 隐 性 致 死 试验 ， UDS试 验 )中 再 选 择 两 项 试 验 进 行 。 我 国 农 药 安 全 性 毒理 学 评 价 程 序 (1991)中 对 遗 传 毒 理 学 试 验 的 要 求 则 为 ：Ames试 验 和 大 肠 杆 菌 回 复 突 变 试 验 ， 骨 髓 细 胞 微 核 试 验 或 骨髓 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 ， 睾 丸 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 或 显 性 致死 试 验 为 必 做 项 目 ， 若 有 一 项 出 现 阳 性 ， 还 需 从 精 子 畸 形 试 验 、 体 外 培 养 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 、 UDS、 果 蝇 伴 性 隐 性 致死 试 验 等 试 验 中 再 选 择 两 项 进 行 。