电泳分离概述课件

1 1 2 2主要内容主要内容1概述2电泳的分类3聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳5等电聚焦电泳等电聚焦电泳3 3l1809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。l1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。l1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白。一、一、概述概述1、电泳的发展史、电泳的发展史4 4l1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。l从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。5 5l l电泳电泳：带电荷的物质（如蛋白质、核酸等）处于惰性支持：带电荷的物质（如蛋白质、核酸等）处于惰性支持介质（固态或液态）中，在电场的作用下，向其介质（固态或液态）中，在电场的作用下，向其相反的电相反的电极方向泳动极方向泳动的现象。的现象。l l电泳分离电泳分离：带电物质在电场的作用下，因其所带：带电物质在电场的作用下，因其所带电荷性质电荷性质、电荷数量电荷数量以及以及分子量大小分子量大小的不同而产生的的不同而产生的泳动方向泳动方向、泳动泳动速度速度的不同，最终使得混合组分得以分离的操作单元。的不同，最终使得混合组分得以分离的操作单元。2、电泳的概念、电泳的概念6 6 电泳分离的基础建立在蛋白质是带电颗粒这一事实上的。蛋白质的电荷来源于氨基酸的离子化侧链基团，包括酸性残基，、碱性残基、络氨酸残基以及荷电的非蛋白质组分如脂类或者碳水化合物。大多数这些酸和碱都很弱，使得蛋白质的整体电荷具有很大的pH依赖性。而在一特定的pH下，不同蛋白质分子由于氨基酸组成不同，所带电荷的电性和电量也不同，由此可进行蛋白质的分离和分析。3、电泳分离的基本原理、电泳分离的基本原理7 7l带电粒子在单位电场强度下的泳动速度称为带电粒子在单位电场强度下的泳动速度称为电泳迁移率电泳迁移率。m=v/E=(d/t)/(V/L)式中，m为迁移率；v为迁移速度；E为电场强度；d为迁移距离；t为电泳时间；V为电压；L为凝胶长度；l由于球形分子在电场中收到的动力和阻力，即lEQ=6rv Q为别分离物质所带静电荷；为介质黏度；r为分子半径；于是有 m=Q/6r 即迁移率和球形分子的半径、介质黏度、颗粒多带电荷有关。8 89 9l内在特性内在特性：颗粒性质（静电荷量、颗粒大小、形状）：颗粒性质（静电荷量、颗粒大小、形状）l外在特性外在特性：电场强度、溶液的离子强度、：电场强度、溶液的离子强度、pH值、电渗作用、值、电渗作用、电泳介质的性能。电泳介质的性能。l 1）颗粒性质）颗粒性质 Q越大、越大、r 越小、形状越接近球形，越小、形状越接近球形，v 越快。越快。4、影响迁移率的因素、影响迁移率的因素10102）电场强度）电场强度l单位长度的电位降称为单位长度的电位降称为电场强度电场强度，也叫，也叫电势梯度电势梯度（V/m）。如）。如电泳槽长电泳槽长20cm，电压，电压200V，则电场强度，则电场强度20020=10V/cm。l电场强度越大，电泳速度越快，但是会产生大量热量电场强度越大，电泳速度越快，但是会产生大量热量，需要，需要配备冷却设备。配备冷却设备。l 常压电泳常压电泳 E：210V/cm 电压：电压：100500V，大分子物大分子物质分离。质分离。l 高压电泳高压电泳 E：20200V/cm 电压电压 500V，小分子物质分小分子物质分离。离。1111 3 3）溶液离子强度）溶液离子强度 离子浓度离子浓度过高过高 引起带点质点吸引相反粒子聚集其周围，形成一个引起带点质点吸引相反粒子聚集其周围，形成一个与带点质点电荷相反的离子氛，通过降低带电粒子量与带点质点电荷相反的离子氛，通过降低带电粒子量和增加阻力使运动质点和增加阻力使运动质点迁移速率降低迁移速率降低；则电流过大、产热过多，使则电流过大、产热过多，使区带变宽区带变宽、蛋白质变性蛋白质变性。1212 溶液离子强度溶液离子强度过低过低 降低缓冲液的总浓度和缓冲剂量，不宜维持溶液的降低缓冲液的总浓度和缓冲剂量，不宜维持溶液的pHpH值，进而影响值，进而影响溶质的带电量溶质的带电量；其次蛋白质之间有时候会发生相互静电作用，形成更其次蛋白质之间有时候会发生相互静电作用，形成更大的分子团，影响大的分子团，影响迁移速率迁移速率；而且电泳过程中由于电子流动产生热量，所以解决而且电泳过程中由于电子流动产生热量，所以解决设设备温度控制问题备温度控制问题成为电泳和电色谱设备放大的难题。成为电泳和电色谱设备放大的难题。1313 4 4）溶液）溶液pHpH值值 溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。因此，当分离某一种混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值，以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液1414 5 5）电渗作用）电渗作用 电场作用下，溶液对固体支撑物的相对运动称为电场作用下，溶液对固体支撑物的相对运动称为电渗电渗。固体支撑物多孔且带有固体支撑物多孔且带有可解离的带电基团可解离的带电基团，解离后，解离后常吸附溶常吸附溶液中带正电或负电的反离子液中带正电或负电的反离子，这些反离子不是固定的，随着电，这些反离子不是固定的，随着电压梯度运转到正极或负极，直至被下一带电基团所捕获。压梯度运转到正极或负极，直至被下一带电基团所捕获。总体总体效果就是溶液在电场作用下向正极或负极移动。效果就是溶液在电场作用下向正极或负极移动。电渗影响带电质点的迁移速度。但在电渗影响带电质点的迁移速度。但在保持一定的电渗流是有保持一定的电渗流是有益的益的，比如免疫电流。，比如免疫电流。1515 6 6）电泳介质的性能）电泳介质的性能 样品的样品的扩散扩散或或对流对流会干扰样品的分离，为此可以使会干扰样品的分离，为此可以使用支持介质以防止电泳过程中的对流和扩散。支持介用支持介质以防止电泳过程中的对流和扩散。支持介质必须是质必须是化学惰性的，且均匀，化学稳定性好，且具化学惰性的，且均匀，化学稳定性好，且具有合适的渗流。有合适的渗流。16165、检测方法、检测方法 电泳结束后，被分离的蛋白质区带仍然保持在胶内，这时可以通过染色而显示出分离图谱，从而检测样品的分离情况。常用的全蛋白质染色方法有：考马斯亮蓝法、银染色法，荧光染色法。考马斯亮蓝法 通过范德瓦尔斯键结合到蛋白质的碱性集团上，适用于对蛋白质和肽进行染色。通常先用三氯乙酸和/或甲醛等试剂固定凝胶上的蛋白质，然后将凝胶浸泡在染色液中染色，最后将凝胶浸与乙酸/乙醇脱色液中脱色目的为了除去多余的燃料，直至背景清晰。染色后，考马斯亮蓝凝胶可以湿保存（浸泡在10%乙酸溶液中密封）或者干保存。1717 银染色法 银染色法是更灵敏的蛋白质染色方法，银染时蛋白带上的AgNO3被还原成金属Ag而沉积在蛋白带上。现在常使用即用型银染试剂盒进行银染。银染过程中蛋白质先固定、在显色。常用的固定剂有戊二醛，乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸，固定能阻滞蛋白质在凝胶中的扩散。银染的显色方法主要有化学显示和光显示两种。1818 荧光染料法 荧光染料可以时染料本身发荧光，或者是染料与蛋白质的反应产物发荧光。荧光染料法分为电泳前预标记和电泳后再标记两种方法。电泳前预标记蛋白质主要采用丹磺酰氯、荧光胺、领苯二甲己二醛等，特别是荧光胺近年来采用较多。电泳后蛋白带的迅速定位可以用邻苯二甲基二醛、荧光胺、1-苯胺-8-萘磺酸盐进行荧光标记。19195、电泳的实验一般方法步骤、电泳的实验一般方法步骤 1）制胶 2）加样 3）电泳 4）检测 5）电泳结果的保存2020（1）电泳仪）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置为电泳提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（常压电泳仪（600V600V）高压电泳仪（高压电泳仪（3000V3000V）超高压电泳仪（超高压电泳仪（30000V30000V50000V50000V）6、电泳常用设备、电泳常用设备2121（2 2）电泳槽：）电泳槽：电泳系统的核心部分。电泳系统的核心部分。自由界面电泳槽自由界面电泳槽 管状电泳槽管状电泳槽 板状电泳槽板状电泳槽2222（3 3）附属设备：）附属设备：外循环恒温系统外循环恒温系统:高电压会产生高热，高电压会产生高热，需冷却。需冷却。灌胶模具：制胶，灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。玻璃板和梳子。2323 1 1、按是否产生区带、按是否产生区带l自由界面电泳自由界面电泳：移动界面电泳，指在没有支持介质移动界面电泳，指在没有支持介质的溶液中进行的电泳，分离后不产生区带。的溶液中进行的电泳，分离后不产生区带。l区带电泳区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物质在支持指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。介质上分离成若干区带。6、二二、电泳的分类电泳的分类2424 2、按按支持介质种类的不同支持介质种类的不同，区带电泳可分为：，区带电泳可分为：纸电泳纸电泳。色谱电泳色谱电泳 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 凝胶电泳：以淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶为电凝胶电泳：以淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶为电泳载体。泳载体。聚焦电泳：如等电聚焦电泳、密度梯度电泳、亲和聚焦电泳：如等电聚焦电泳、密度梯度电泳、亲和电泳等。电泳等。聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺和和琼脂糖琼脂糖是目前实验室最常用的两种支持是目前实验室最常用的两种支持介质。介质。25253、按、按电泳次数、方向电泳次数、方向 一维电泳：仅一个方向电泳一次。二维电泳：平面X轴、Y轴方向各电泳一次。4、按、按操作方式操作方式分分 连续电泳：连续进样。间歇电泳：分批进样。5、按、按电泳介质是否均匀分电泳介质是否均匀分 连续介质电泳：电泳介质密度均匀一致。不连续介质电泳：电泳介质上 层密度低为浓缩层，下层密度高为分离层。26266、按电泳设备分、按电泳设备分 1 1）平板电泳：平板电泳：水平平板电泳：有分置于两侧的缓冲液糟和中间的水平冷板的凝胶组成，缓冲液与凝胶通过滤纸桥或者凝胶条搭连。水平平板电泳的特别优势在于电极缓冲液用量很少，缓冲液凝胶条使用很方便，特别是当分析标记蛋白质时可大量减少放射性污染；另外就是良好的冷却系统，从而可以采用高点压，既提高了分辨率，又缩短了电泳时间。垂直平板电泳：上下两个电泳槽，中间经垂直平板相连，凝胶加在两块垂直平行玻璃或塑料板之间。2727 一般平板电泳：凝胶载体为惰性材料，只起支撑作用，无分离作用，如淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。特殊平板电泳：载体除支持作用外，主要起分离作用，如等电聚焦电泳、pH梯度电泳、密度梯度电泳、亲和电泳等 2 2）管管状状电电泳泳：又叫圆盘电泳，有上下两个电泳槽，上电泳槽有若干小孔，用于插电泳管，现在电泳管越来越细，以提高分辨率和微量化。各电泳管分别制胶，因此不够简单、均一、准确，目前很少使用了。取而代之的是平板电泳，而自身逐渐演变成更细更长的毛细管电泳。另外由于凝胶管与电泳液直接接触，容易导致液体泄漏、短路、断路等。28282929l聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。l聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶。lPAGE具有电泳和分子筛的双重作用。lPAGE是目前最常用的电泳方法。三、三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳3030 1、原理、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳一方面根据蛋白质电荷密度，也就是在缓冲液中不同蛋白质间同性静电荷的差异，另一方面基于分子筛效应，即与分子大小和形状有关，因此用聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅能分离各种蛋白质分子的混合物，还可以研究其特性，如电荷、分子量、等电点乃至构想，并且可以用于蛋白质纯度的鉴定。另外不连续的PAGE，对蛋白质的分离不仅基于上面的分子筛效应，还基于对样品的浓缩效应。31312、分离效应分离效应 PAGEPAGE根据其有无浓缩效应，分为：根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳连续电泳（continuous electrophoresis）：采用相同孔径的）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统；凝胶和相同的缓冲系统；不连续电泳不连续电泳（discontinuous electrophoresis）：）：采用不同孔采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系；径的凝胶和不同缓冲体系；电荷效应电荷效应 不连续不连续PAGE PAGE 分子筛效应分子筛效应 浓缩效应浓缩效应 连续连续PAGEPAGE32321）电荷效应电荷效应:分离胶中，蛋白质表面分离胶中，蛋白质表面净电荷不同净电荷不同，迁移率不同迁移率不同。2）分分子子筛筛效效应应：大大小小和和形形状状不不同同的的样样品品分分子子通通过过一一定定孔孔径径的的分分离离胶胶时时，受受阻滞的程度不同阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。而表现出不同的迁移率。在直流电场作用下电泳情况示在直流电场作用下电泳情况示意图意图图中图中A，B，C均为阴离子均为阴离子分子量大小依次为分子量大小依次为MA=MBMC，所带电荷量相同所带电荷量相同QA=QB=QC。33333 3）浓浓缩缩效效应应：使使样样品品在在浓浓缩缩胶胶中中被被浓浓缩缩成成一一条条窄窄带带，然然后后再再进进入分离胶进行分离。入分离胶进行分离。34348.38.38.96.7 1.1.凝凝胶胶由由上上、下下两两层层凝凝胶胶组组成成，两两层层凝凝胶胶的的孔孔径径不不同同，上上层层为为大大孔孔径径的的浓浓缩缩胶胶，下下层层为为小小孔孔径的分离胶径的分离胶。2.2.缓缓冲冲液液离离子子组组成成及及各各层层凝凝胶胶的的pHpH不不同同。电电极极缓缓冲冲液液为为pH8.3pH8.3的的TrisTris-甘甘氨氨酸酸缓缓冲冲液液，浓浓缩缩胶胶为为pH6.7pH6.7的的Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液，而而分分离离胶胶为为pH8.9pH8.9的的Tris-HClTris-HCl缓冲液。缓冲液。3.3.在电场中形成在电场中形成不连续的电位梯度不连续的电位梯度。因因此此，在在这这样样一一个个不不连连续续的的系系统统里里，存存在在三三种种物物理理效效应应，即即样样品品的的浓浓缩缩效效应应，凝凝胶胶的的分分子子筛筛效应效应和和电荷效应电荷效应，提高了分辨率。，提高了分辨率。3、系统的不连续性表现在以下几个方面系统的不连续性表现在以下几个方面3535 4、聚丙、聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：胺凝胶聚合的催化体系有两种：1 1）化学催化系统：）化学催化系统：AP-TEMEDAP-TEMED 催化剂：催化剂：过硫酸铵过硫酸铵（ammonium ammonium persulfatepersulfate，APAP）加速剂：加速剂：TEMEDTEMED（N N，N N，N N，N N-四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）2 2）光催化系统：核黄素光）光催化系统：核黄素光 催化剂催化剂:核黄素（维生素核黄素（维生素B B2 2）引发剂引发剂:光光 TEMEDTEMED的存在，可加速聚合。的存在，可加速聚合。.CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CHCH2 2=CH=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NHNH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺37373838（1）催化）催化剂和加速和加速剂的的浓度：度：浓度小易度小易导致聚合速度慢；致聚合速度慢；浓度度过大大则易易导致致电泳泳时的的烧胶以及胶以及电泳泳带的畸的畸变；一般控制使聚合；一般控制使聚合过程在程在4060分分钟内完成。内完成。（2）系）系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以，以获得最佳的聚合得最佳的聚合结果。果。（3）温度：）温度：低温下聚合低温下聚合导致凝胶致凝胶变脆和混脆和混浊，适当提高温度可以使，适当提高温度可以使凝胶透明而有凝胶透明而有弹性。性。（4）分子氧：）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。（5）系）系统纯度：度：金属离子会影响凝胶的聚合。金属离子会影响凝胶的聚合。5、影响丙烯酰胺聚合的主要因素影响丙烯酰胺聚合的主要因素3939聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N亚甲基双丙烯酰胺聚合而成亚甲基双丙烯酰胺聚合而成4040 凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取决于凝凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取决于凝胶总浓度（胶总浓度（T T）和交联度（和交联度（C C）。）。T=C=T=C=凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒量较小（大）的颗粒。6、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%4141l l 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加而降低。4242 有效孔径决定蛋白质的分离434344447、特别注意、特别注意l丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用.l丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存.l混合的溶液保存不宜超过一个月.4545聚丙烯酰胺凝胶的应用聚丙烯酰胺凝胶的应用4646聚丙烯酰胺凝胶的应用聚丙烯酰胺凝胶的应用4747聚丙烯酰胺凝胶的应用聚丙烯酰胺凝胶的应用4848四、四、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）简称）简称SDS PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relative relative molecular mass,molecular mass,MrMr）的一种最好的办法）的一种最好的办法。49491 1、分离原理：、分离原理：SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响50502、蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变5151 3 3、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素 在SDS-PAGE中，蛋白质间不存在电荷密度的差别，分离主要依据蛋白质的亚基分子量，因此凝胶浓度和电泳缓冲液是影响SDS-PAGE分离效果的主要因素，另外SDS的质量也会影响分离效果。1 1）凝胶浓度）凝胶浓度 凝胶浓度决定凝胶孔径大小，进而影响凝胶的分子筛效应。5252 2 2）缓冲系统）缓冲系统 对于SDS-PAGE，由于SDS对蛋白质的助溶作用以及负电荷的包裹作用，蛋白质的分离仅仅依据亚基的分子大小，因此缓冲系统的选择只要满足有利于分离并且保持蛋白质的稳定以及不与SDS发生相互作用即可。3 3）SDS的质量SDS的质量，尤其是烷基类似物的存在，会严重影响分离，SDS的质量也会干扰蛋白质的复性。为了获得可重复的结果，只能采用高质量的SDS。5353 3 3、未知蛋白质分子量的测定、未知蛋白质分子量的测定蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMlogMWW=C-=C-bmbm M MWW：分子量；分子量；mm：迁移率；：迁移率；C C、b b均为常数均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。5454 4、SDS PAGE的的优缺点优缺点l l 优点优点l l严格依照一个分子参数，即分子大小来分离蛋白质，因此严格依照一个分子参数，即分子大小来分离蛋白质，因此可以广泛用于分子定性；可以广泛用于分子定性；l l能使大多数蛋白质溶解，因此可以用于许多分离过程；能使大多数蛋白质溶解，因此可以用于许多分离过程；l l分辨率高，分离快速，重复性高；分辨率高，分离快速，重复性高；l l操作简单，仪器试剂便宜；操作简单，仪器试剂便宜；l l 缺点缺点l lSDS使蛋白质变性，从而丧失其生物活性，因此难以用特使蛋白质变性，从而丧失其生物活性，因此难以用特意检测方法获取信息。意检测方法获取信息。5555聚丙烯酰胺凝胶的应用聚丙烯酰胺凝胶的应用5656聚丙烯酰胺凝胶的应用聚丙烯酰胺凝胶的应用5757五、等电聚焦五、等电聚焦，（，（IEF）l利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。5858 1、原理、原理 在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。5959 同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。6060等电聚焦电泳等电聚焦电泳6161l分辨率高；l电泳时间延长，区带越来越窄；l样品可以加在电泳系统的任何部位；l浓度很低的样品也可以进行分离；l可用于准确测定蛋白质或其他两性电解质的等电点。2、优点、优点6262l电泳过程要求使用无盐溶液，可能会使某些在无电泳过程要求使用无盐溶液，可能会使某些在无盐溶液中溶解度较低的蛋白质产生沉淀；盐溶液中溶解度较低的蛋白质产生沉淀；l电泳后样品中各组分都聚焦到各自的等电点，对电泳后样品中各组分都聚焦到各自的等电点，对某些在等电点时溶解度较低或可能变性的组分不某些在等电点时溶解度较低或可能变性的组分不适用。适用。3、缺点、缺点63634 4、两性电解质载体、两性电解质载体(carrier(carrier ampholytesampholytes)1)易溶于水，有足够的缓冲能力以便保 持稳定的pH梯度。2)导电性能好以保持电场强度的均匀性。3)分子量小电泳后易分离除去。4)化学组成不同于蛋白质不干扰测定。5)与样品中各组分不发生化学反应。6464 两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面溶液的溶液的pHpH决决定它带电荷的性质定它带电荷的性质。如溶液是。如溶液是pH7pH7，对，对pIpI=9=9的两性电解质来说，是处的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对于酸性环境，故带正电荷；但对pIpI=3=3的两性电解质来说，却是处于的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同碱性环境，故而带负电荷。所以，不同pIpI的两性电解质，在同一环的两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；境中带有不同性质和数量的电荷；另一方面，溶液中的另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡两性电解质又破坏了水的解离平衡，使溶使溶液液pHpH有所改变有所改变。当某一两性电解质。当某一两性电解质pIpI较低，即释放质子较低，即释放质子(H+)(H+)能力较能力较强，使溶液强，使溶液pHpH值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，pIpI高的可使溶液高的可使溶液pHpH值上升，称为碱性两性电解质。值上升，称为碱性两性电解质。所以，在溶液中的两性电解质一方面所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液受溶液pHpH值的影响，决定值的影响，决定其带电的性质其带电的性质；另一方面，它又；另一方面，它又影响周围环境影响周围环境(水溶液水溶液)，使其，使其pHpH值值有所改变有所改变。5、pH梯度的形成梯度的形成6565等电聚焦电泳的应用等电聚焦电泳的应用6666等电聚焦电泳的应用等电聚焦电泳的应用