药品微生物限度检查方法介绍

1 （北京市药品检验所 戴红） 2 l 无 菌 室 的 质 量 管 理l 药 品 的 微 生 物 限 度 检 查l 药 品 的 无 菌 检 查 3 l 位 置 选 择l 面 积 大 小l 洁 净 度l 采 光l 紫 外 杀 菌l 门l 人 流 物 流l 地 面 墙 面 4 l 陈 设 尽 量 简 单 ， 仅 放 置 必 需 用 的 仪 器 设 备l 无 菌 室 应 每 周 和 每 次 操 作 前 用 0.1%新 洁 尔 灭 擦 拭 操 作 台 及 可 能 污染 的 死 角 ， 室 内 无 菌 空 气 过 滤 器 及 紫 外 灯 杀 菌 1小 时 。l 人 员 ： 肥 皂 洗 手 ， 0.1%新 洁 尔 灭 洗 手 ， 换 无 菌 服 、 鞋 ， 进 入 。l 操 作 必 须 符 合 无 菌 要 求 ， 穿 好 无 菌 服 后 ， 不 能 反 复 出 入 无 菌 间 ，手 不 能 来 回 出 入 操 作 台 。l 在 每 次 操 作 完 毕 ， 同 样 用 上 述 消 毒 溶 液 擦 拭 工 作 台 面 ， 除 去 空 气湿 气 ， 用 紫 外 灯 杀 菌 半 小 时 。 l 非 无 菌 室 工 作 人 员 不 得 进 入 ， 对 外 来 维 修 人 员 要 进 行 监 督 。l 缓 冲 间 不 得 放 杂 物 、 培 养 箱 等 。l 定 期 对 门 、 窗 、 墙 面 等 消 毒 。l 定 期 检 查 洁 净 度 情 况 。 5 应 在 环 境 洁 净 度 10000级 局 部 洁 净 度 100级 的 单 向 流 空 气 区 域 内 进 行 。 检 验 全 过 程 必须 无 菌 。 工 作 台 面 及 环 境 应 定 期 按 医 药 工 业 洁净 室 （ 区 ） 悬 浮 粒 子 、 浮 游 菌 和 沉 降 菌 的测 试 方 法 的 现 行 国 家 标 准 进 行 洁 净 度 验 证 。 6 l 尘 埃 粒 子l 洁 净 级 别 尘 粒 数 /m3 活 微 生 数 （ 个 ） /m3l 0.5um 5uml 100级 3,500 0 5l 1000级 350,000 20,00 100l 100000级 3,500,000 20,000 500l GB/T16294-1996l 沉 降 菌l 洁 净 级 别 个 /（ 90mm.0.5h） l 100级 1 l 10000级 3l 100000级 10 7 l保存原则 l保存方法l复壮l管理 8 l 挑 选 特 征 典 型 的 纯 菌 菌 落l 确 定 保 存 的 合 适 菌 体 形 态 ， 凡 能 产 生 孢 子 或 芽 孢 的 微生 物 都 用 孢 子 或 芽 孢 保 存l 选 择 最 适 宜 的 保 存 方 法 进 行 保 存l 定 期 对 保 存 的 菌 种 进 行 检 查 9 l 琼 脂 斜 面 低 温 保 存 法l 甘 油 冷 冻 管 保 藏 法l 半 固 体 琼 脂 斜 面 低 温 保 存 法l 液 体 石 蜡 保 存 法l 超 低 温 保 存 法 （ 菌 种 ）l 砂 土 10 l 分 离 纯 化 ： 琼 脂 平 板 分 离 、 单 细 胞 （ 菌 体 或 孢 子 ） 的分 离l 通 过 宿 主 复 壮l 淘 汰 退 化l 理 化 因 素 诱 变 11 l 专 人 管 理 ， 加 锁 保 存 在 冰 箱 内 ， 保 存 菌 种 的 冰 箱 不 得放 置 食 品 及 易 挥 发 性 试 剂 及 有 机 溶 媒 等l 定 期 有 专 人 按 操 作 规 程 进 行 传 代 接 种l 菌 种 定 期 检 查 ， 发 现 染 菌 及 变 异 现 象 应 及 时 报 告 ， 研究 处 理 。l 实 验 菌 种 不 得 任 意 带 出l 使 用 致 病 菌 时 应 及 时 通 知 保 管 人 员 ， 用 后 必 须 及 时 处理 12 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003铜 绿 假 单 胞 菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104生 孢 梭 菌 (Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941白 色 念 珠 菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98001黑 曲 霉 (Aspergillus niger) CMCC(F) 98003大 肠 埃 希 菌 (Escherichia coli) CMCC(B) 44102枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis) CMCC(B) 63501 13 l 接 种 大 肠 埃 希 菌 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、 铜绿 假 单 胞 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 营 养 肉 汤 中 ， 30 35 培 养 1824小 时 ， 取 此 培 养 液1ml加 0.9 无 菌 氯 化 钠 溶 液 9ml， 采 用 10倍 递 增 稀 释 法 ， 稀 释 至 10-5 10-7， 使 细菌 数 约 为 10100cfu/ml。 14 l接 种 白 色 念 珠 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 改良 马 丁 培 养 基 中 ， 23 28 培 养1824小 时 ， 取 此 培 养 物 1ml加 0.9无 菌 氯 化 钠 溶 液 9ml， 采 用 10倍 递 增稀 释 法 ， 稀 释 至 10-5 10-7， 使 细 菌数 约 为 50100cfu/ml。 15 l 接 种 黑 曲 霉 的 新 鲜 培 养 物 至 改 良 马丁 琼 脂 斜 面 培 养 基 上 ， 23 28 培养 5 7天 ， 加 35ml0.9 无 菌 氯 化 钠溶 液 洗 下 霉 菌 孢 子 ， 吸 取 出 菌 液 ，取 1 ml加 0.9 无 菌 氯 化 钠 溶 液 9ml，采 用 10倍 递 增 稀 释 法 ， 稀 释 至 10-410-6， 使 细 菌 数 约 为 50100cfu/ml。 16 药品微生物限度检查方法介绍 17 2005年 版 微 生 物 限 度 标 准 的 应 用 微 生 物 限 度 检 查 法 ： 检 查 非 规 定 灭 菌 制 剂 及 其 原 料 、辅 料 受 微 生 物 污 染 程 度 的 方 法 。 是 判 定 药 品 受 到 微 生物 污 染 程 度 的 重 要 指 标 ， 也 是 对 生 产 企 业 的 设 备 器 具 、工 艺 流 程 、 生 产 环 境 和 操 作 者 的 卫 生 状 况 进 行 卫 生 学评 价 的 综 合 依 据 之 一 。 药 品 的 生 产 、 贮 存 、 销 售 过 程 中 的 检 验 ， 原 料 及 辅 料的 检 验 ， 新 药 标 准 制 订 ， 进 口 药 品 标 准 复 核 ， 考 察 药品 质 量 及 仲 裁 等 ， 除 另 有 规 定 外 ， 其 微 生 物 限 度 检 查均 以 本 标 准 为 依 据 。 检 查 项 目 ： 细 菌 数 、 霉 菌 数 、 酵 母 菌 数 及 控 制 菌 的 检查 。 18 l 1、 制 剂 通 则 、 品 种 项 下 要 求 无 菌 的 制 剂 及 标 示 无 菌 的制 剂 应 符 合 无 菌 检 查 法 的 规 定 。l 2、 口 服 给 药 制 剂l 3、 局 部 给 药 制 剂 3.1. 用 于 手 术 、 烧 伤 及 严 重 损 伤 的 局 部 给 药 制 剂 无 菌 3.2. 眼 部 给 药 制 剂 ： 3.3、 耳 、 鼻 及 呼 吸 道 吸 入 给 药 制 剂 3.4、 阴 道 、 尿 道 给 药 制 剂 3.5、 直 肠 给 药 制 剂 3.6、 其 它 局 部 给 药 19 l 4、 含 动 物 组 织 （ 包 括 提 取 物 ） 的 口 服 给 药 制剂l 5、 有 兼 用 途 径 的 制 剂 应 符 合 各 给 药 途 径 的 标 准l 6、 霉 变 、 长 螨 者 以 不 合 格 论l 7、 原 料 及 辅 料 参 照 相 应 制 剂 的 微 生 物 限 度 标 准 执 行 20 l 一 般 采 用 随 机 抽 样 方 法 ， 抽 样 量 应 为 检 验 用 量 的 3倍 量（ 以 备 复 试 ） 。 贵 重 药 品 检 验 量 可 以 酌 减 （ 至 少 要 够各 种 菌 检 查 用 的 溶 液 ） 。l 所 有 剂 型 的 检 验 量 均 需 取 2个 以 上 包 装 单 位 （ 中 药 密 丸 、膜 剂 ， 需 取 自 4丸 、 4片 以 上 ） 。l 固 体 及 半 固 体 （ 粘 稠 性 供 试 品 ） 制 剂 检 验 量 为 10g。l 液 体 制 剂 检 验 量 为 10ml。l 膜 剂 除 另 有 规 定 外 ， 中 药 膜 剂 检 验 量 为 50m2,化 学 药 及生 化 药 膜 剂 检 查 量 为 10cm2。l 抽 样 时 ， 凡 发 现 有 异 常 或 可 疑 的 样 品 ， 应 选 取 有 疑 问的 样 品 ， 但 明 显 破 裂 的 包 装 不 得 作 为 样 品 。l 凡 能 从 药 品 、 瓶 口 （ 外 盖 内 侧 及 瓶 口 周 围 ） 外 观 看 出长 螨 、 发 霉 、 虫 蛀 及 变 质 的 药 品 ， 可 直 接 判 为 不 合 格品 ， 无 需 再 抽 样 检 验 。 21 l 供 试 品 在 检 验 之 前 ， 应 保 存 在 阴 凉 干 燥 处 ， 勿冷 藏 或 冷 冻 ， 以 防 供 试 品 内 污 染 菌 因 保 存 条 件不 妥 引 起 致 死 或 繁 殖 。l 供 试 品 在 检 验 之 前 ， 应 保 持 原 包 装 状 态 ， 严 禁开 启 。 包 装 已 开 启 的 样 品 不 得 作 为 供 试 品 。 22 细菌、霉菌、酵母菌计数 23 l 将 供 试 品 及 所 有 已 灭 菌 的 平 皿 、 锥 形 瓶 、 匀 浆 杯 、 试管 、 吸 管 （ 1ml、 10ml） 量 筒 等 移 到 无 菌 室 内 ， 每 次 试验 所 用 物 品 必 须 事 先 计 划 ， 准 备 足 够 用 量 ， 避 免 操 作中 出 入 ， 操 作 编 号 后 将 全 部 外 包 装 （ 牛 皮 纸 ） 去 掉 。l 开 启 无 菌 室 紫 外 杀 菌 灯 和 空 气 过 滤 装 置 ， 并 使 其 工 作不 低 于 30min。l 操 作 人 员 用 肥 皂 洗 手 ， 关 闭 紫 外 灯 ， 进 入 缓 冲 间 ， 换工 作 鞋 。 再 用 0.1%新 洁 尔 灭 或 其 他 消 毒 液 洗 手 或 用 乙醇 棉 球 擦 手 ， 穿 戴 无 菌 衣 、 帽 、 口 罩 、 手 套 。l 操 作 前 先 用 乙 醇 棉 球 擦 手 ， 再 用 碘 伏 棉 球 （ 也 可 用 乙醇 棉 球 ） 擦 拭 供 试 品 瓶 、 盒 、 袋 的 开 口 处 周 围 ， 待 干后 用 灭 菌 的 手 术 镊 或 剪 将 供 试 品 启 封 。 24 l供试液制备 （10倍递增稀释）l注平皿l倒培养基摇合 （45营养琼脂 玫瑰红钠琼脂 YPD琼脂培养基）l倒置培养 （ 3035 48小时；2528 72小时） l菌落点数 （30300个 30100个）l菌数报告 （10条原则） 25 l 乳 化 剂 、 分 散 剂 、 中 和 剂 及 其 用 量 应 证 明 是 有 效 的 ，并 对 微 生 物 无 毒 性 。l 水 浴 加 温 时 ， 温 度 不 超 过 45 ， 时 间 不 超 过 30分 钟 。l 供 试 液 从 制 备 到 加 入 培 养 基 ， 不 超 过 1小 时 。l 供 试 液 的 体 积 ： 最 终 体 积 为 100ml。 26 l 稀 释 剂 ： pH7.0氯 化 钠 蛋 白 胨 缓 冲 液l 肠 溶 制 剂 pH7.6磷 酸 盐 缓 冲 液 、 pH6.8磷 酸 盐 缓 冲 液l 非 水 溶 性 供 试 品 乳 化 剂 ： 5g司 盘 80、 3g单 硬 脂 酸 甘 油 酯 、 10g聚山 梨 酯 80的 无 菌 混 合 物 （ 事 先 配 制 好 、 灭 菌 消毒 ） 。 十 四 烷 酸 异 丙 酯 萃 取 或 过 滤 27 液 体 供 试 品 取 供 试 品 10ml， 置 灭 菌 锥 形 瓶 中 ， 加 入 稀 释 剂 至100ml ， 摇 匀 ， 作 为 1:10供 试 液 。 含 王 浆 或 蜂 蜜 的 液 体 制 剂 和 滴 眼 剂 直 接 用 供 试 品 作 为 供 试 液 。l 固 体 、 半 固 体 或 粘 稠 供 试 品 ， 称 取 供 试 品 10g， 置 于 匀 浆 杯 或 适 当灭 菌 容 器 中 ， 加 入 稀 释 剂 至 100ml ， 用 匀 浆 仪 （ 3000-5000r/，24min） 、 振 荡 器 或 乳 钵 研 磨 等 方 法 混 匀 。 胃 溶 胶 囊 加 稀 释 剂 后置 45 1 水 浴 振 摇 ， 肠 溶 胶 囊 加 无 菌 磷 酸 盐 缓 冲 液 后45 1 水 浴 振 摇 。 28 l 非 水 溶 液 性 供 试 品 软 膏 剂 、 乳 膏 剂 、 称 供 试 品 5g（ 5ml） ， 加 到含 已 灭 菌 溶 化 并 45 保 温 的 乳 化 剂 的 烧 杯 中 ， 用 无 菌 玻 棒 搅 拌 混匀 后 ， 慢 慢 加 入 45 左 右 的 稀 释 剂 85ml， 边 加 边 搅 拌 ， 使 供 试 品充 分 乳 化 ， 作 供 试 液 （ 1:20） 。l 油 剂 取 供 试 品 10ml， 加 入 无 菌 聚 山 梨 酯 80 5 8ml， 摇 匀 ， 再加 入 稀 释 剂 至 100ml。l 栓 剂 ， 称 取 供 试 品 10g， 置 灭 菌 锥 形 瓶 中 ， 加 适 量 稀 释 剂 ， 置 45 水 浴 保温 10min， 使 溶 ， 加 入 灭 菌 聚 山 梨 酯 80 58ml， 振 摇 使 之 乳 化 ， 再 加 稀释 剂 （ 稀 释 剂 和 聚 山 梨 酯 80总 量 为 100ml） ， 摇 匀 。 29 供 试 液 的 制 备l 气 雾 剂 ， 将 供 试 品 置 冰 箱 （ 4-8 ） 1h， 取 出 ， 用 碘 伏 棉 球 （ 也可 用 乙 醇 棉 球 ） 擦 拭 试 品 开 启 部 位 周 围 ， 然 后 以 无 菌 钢 锥 钻 孔 并插 入 容 器 中 ， 勿 移 出 钢 锥 ， 以 转 动 方 式 使 容 器 抛 射 剂 全 部 抛 出 。以 无 菌 注 射 器 吸 出 全 部 溶 液 ， 按 标 示 量 补 加 稀 释 剂 至 足 量 （ 若 含非 水 溶 性 成 分 ， 加 适 量 无 菌 聚 山 梨 酯 80液 ） 此 液 即 为 供 试 品 原液 。l 膜 剂 将 药 膜 剪 成 碎 片 ， 置 灭 菌 锥 形 瓶 中 ， 加 入 稀 释 剂 至 100ml，于 45 1 水 浴 中 保 温 ， 振 摇 使 溶 。l 茶 剂 ， 取 供 试 品 10g， 置 灭 菌 锥 形 瓶 中 ， 加 入 稀 释 剂 至 100ml， 振摇 30s,以 灭 菌 纱 布 过 滤 ， （ 如 为 袋 泡 茶 ， 可 直 接 取 2袋 ， 以 称 样 结果 按 1： 10加 稀 释 剂 ， 浸 泡 30min） 。 l 以 上 供 试 品 如 吸 水 膨 胀 ， 或 粘 度 过 高 ， 可 增 加 稀 释 剂 ， 制 成1:201:100供 试 液 。 30 稀 释 法 ： 10ml供 试 液 种 入 较 大 体 积 的 培 养 基 中 ， 一 般 不 超 过 1000ml 离 心 沉 淀 法 ： 3000rpm， 30min， 底 部 2ml稀 释 至 10ml。 500rpm,5min， 上 清液 再 离 心 集 菌 薄 膜 过 滤 法 ： 0.45um的 滤 膜 ， 冲 洗 3次 ， 每 次 至 少 100ml 中 和 法 ： 磺 胺 类 100ml增 菌 液 中 含 1%的 对 氨 基 苯 甲 酸 1ml 砷 、 汞 类 100ml硫 乙 醇 酸 盐 培 养 基 洗 必 泰 类 100ml增 菌 液 中 加 适 量 的 聚 山 梨 酸 80等 表 面 活 性 剂 沉 降 法 ： 自 然 沉 降 5min， 取 上 层 液 置 100ml增 菌 液 中 31 l 10g 100ml 1:10 1ml 10ml 1:100 1ml 10ml 1:1000l 至 少 3个 稀 释 级 ， 每 递 增 1个 稀 释 级 ， 必 须 更 换 吸 管 。l 管 内 混 合 吹 打 不 少 于 10次 ， 吸 液 在 液 面 下 2.5cm处 ， 放液 在 液 面 上 1cm处 ， 延 内 壁 缓 缓 吹 出 全 部 溶 液 ， 然 后 将吸 管 放 入 消 毒 液 缸 内 。 32 l 在 进 行 10倍 递 增 稀 释 的 同 时 ， 以 该 稀 释 级 吸 管 ， 吸 取各 种 稀 释 液 各 1ml至 每 个 灭 菌 平 皿 中 （ 从 高 稀 释 级 至 低稀 释 级 吸 液 时 可 用 1支 吸 管 ） ， 每 一 稀 释 级 注 2-3个 平皿 （ 此 时 一 般 为 左 手 执 平 皿 ， 将 盖 半 开 ， 右 手 执 吸管 ） ， 注 平 皿 时 ， 将 1ml供 试 液 慢 慢 全 部 注 入 平 皿 中 ，管 内 无 残 留 液 体 ， 防 止 反 流 到 吸 管 尖 端 部 。 同 时 作 阴性 对 照 （ 待 各 级 稀 释 液 注 皿 完 毕 后 ， 用 1支 1ml吸 管 取稀 释 剂 各 1ml， 分 别 注 入 4个 平 皿 中 。 其 中 2个 作 细 菌 数阴 性 对 照 ； 另 2个 作 霉 菌 、 酵 母 菌 数 阴 性 对 照 ， 如 另 用YPD琼 脂 测 定 酵 母 菌 数 时 ， 则 再 增 加 2个 平 皿 作 酵 母 菌数 阴 性 对 照 。 33 l 将 预 先 配 制 好 的 培 养 基 （ 细 菌 计 数 用 营 养 琼 脂 、霉 菌 、 酵 母 菌 计 数 一 般 用 玫 瑰 红 钠 琼 脂 ， 含 蜂蜜 、 王 浆 液 体 制 剂 另 用 YPD琼 脂 ） 熔 化 、 冷 至约 45 时 ， 倾 注 上 述 各 个 平 皿 约 15ml， 以 顺 时针 或 反 时 针 方 向 快 速 旋 转 平 皿 混 匀 ， 注 意 ， 混匀 时 切 勿 将 培 养 基 ， 溅 到 皿 边 及 皿 盖 上 ， 置 操作 台 上 待 凝 。 34 l 培 养 细 菌 计 数 平 板 倒 置 于 30-35 培 养 箱中 培 养 48h。l 霉 菌 、 酵 母 菌 计 数 平 板 倒 置 于 23-28 培养 箱 中 培 养 72h。 35 l 细 菌 数 选 取 平 均 菌 落 数 在 30300之 间 的稀 释 级 。l 霉 菌 、 酵 母 菌 数 先 取 平 均 菌 落 数 在 30100之 间 的 稀 释 级 。 因 为 超 过 300有 凝 聚 作 用 ， 易 计 数 偏 低 ， 且 不 易 点 计 ， 低 于 30细菌 分 布 不 是 正 态 分 布 ， 不 能 代 表 其 正 常 计 数 ， 且 数 量 减 少 ， 误 差增 大 。 36 l 如 只 有 1个 稀 释 级 平 均 菌 落 数 在 30300（ 30-100） 之 间 ， 则 将 该稀 释 级 的 菌 落 乘 以 稀 释 倍 数 报 告 。稀 释 菌 落 数 平 均 值 报 告10 1 280 260 270 270 10 270010 2 29 28 10 3 3 2 37 l 如 有 2个 相 邻 稀 释 级 平 均 菌 落 数 在 30300（ 30-100） 时 ， 则 按 比值 计 算 。 当 比 值 2时 ， 则 以 2个 稀 释 级 的 平 均 菌 落 数 均 值 报 告 。l 高 稀 释 级 平 均 菌 落 数 稀 释 倍 数l 比 值 = l 低 稀 释 级 平 均 菌 落 数 稀 释 倍 数l 稀 释 菌 落 数 平 均 值10 1 大 于 300（ 无 法 计 数 ） 10 2 280 260 27010 3 38 40 39比 值 39000/27000 1.4 小 于 2 报 告 (27000+39000)/2 33000 38 l 如 有 2个 相 邻 稀 释 级 平 均 菌 落 数 在 30300（ 30-100） 时 ， 则 按 比值 计 算 。 当 比 值 大 于 2， 小 于 5时 ， 则 以 低 稀 释 级 的 平 均 菌 落 数 乘以 稀 释 倍 数 报 告 。l 高 稀 释 级 平 均 菌 落 数 稀 释 倍 数l 比 值 = l 低 稀 释 级 平 均 菌 落 数 稀 释 倍 数l 稀 释 菌 落 数 平 均 值10 1 大 于 300（ 无 法 计 数 ） 10 2 280 260 27010 3 80 100 90比 值 90000/27000 3.3 大 于 2 报 告 270 100 27000 39 l 若 比 值 大 于 5， 或 高 稀 释 级 的 菌 落 数 大 于或 等 于 低 稀 释 级 的 菌 落 数 时 ， 应 查 明 原因 ， 若 操 作 没 有 问 题 ， 说 明 有 抑 菌 情 况 ，应 重 新 进 行 方 法 学 验 证 。 40 如 各 稀 释 级 平 均 菌 落 数 均 在 30以 下 ， 则 按 最 低 稀 释 级 平 均 菌 落 数乘 以 稀 释 倍 数 报 告 。稀 释 菌 落 数 平 均 值 报 告10 1 10 12 11 11 10 11010 2 2 3 10 3 1 3如 各 稀 释 级 的 平 均 菌 落 数 均 无 菌 落 生 长 或 最 低 稀 释 级 平 均 落 数 小于 1小 时 ， 应 报 告 菌 数 为 1 稀 释 倍 数 个 /g或 ml。 41 l（a）培养基及其制备方法 （6条）l（b）操作技术 （12条）l（c）结果判断 （3条）l（d）异常情况处理 （3条） 42 l 采 用 干 燥 培 养 基 ， 按 说 明 配 制 ， 灭 菌 后 对 培 养 基 pH值 进 行 校 验 。l 配 制 的 培 养 基 不 应 有 沉 淀 ， 如 有 沉 淀 ， 应 于 溶 化 后 趁 热 过 滤 ， 灭 菌 后 使用 。l 培 养 基 的 分 装 量 一 般 不 超 过 容 器 的 1/3， 以 免 灭 菌 时 溢 出 。 包 装 时 ， 塞 子必 须 塞 紧 ， 以 免 松 动 或 脱 落 造 成 染 菌 。l 培 养 基 配 制 后 在 2h内 灭 菌 ， 避 免 细 菌 繁 殖 ， 影 响 灭 菌 效 果 。l 灭 菌 后 的 培 养 基 在 冷 暗 处 保 存 备 用 ， 放 置 时 间 不 能 过 长 ， 一 般 不 超 过 1个月 ， 倒 好 的 碟 子 不 过 3 5天 ， 以 免 水 分 散 失 及 染 菌 。 已 熔 化 的 培 养 基 应一 次 用 完 ， 不 能 反 复 使 用 。 l 不 用 电 炉 直 接 熔 化 ， 以 免 局 部 过 热 营 养 成 份 被 破 坏 。 应 用 水 浴 或 微 波 炉加 热 。 43 l 将 物 品 一 次 准 备 完 全 ， 避 免 来 回 出 入 操 作 台 、 无 菌 室 ， 全 过 程 必 须 符 合无 菌 技 术 要 求 。l 不 溶 于 水 的 样 品 ， 必 须 加 乳 化 剂 、 助 溶 剂 等 溶 解 后 操 作 。l 勿 在 乙 醇 灯 焰 正 上 方 操 作 ， 以 免 灯 焰 将 供 试 液 中 菌 细 胞 杀 灭 。 加 完 稀 释剂 后 ， 试 管 塞 就 立 即 塞 上 。l 快 速 吸 管 、 吹 打 ， 不 能 用 嘴 吹 吸 ， 吸 管 内 放 棉 花l 管 尖 不 许 接 触 可 能 污 染 的 任 何 容 器 或 用 具 l 稀 释 时 每 一 级 换 管 （ 原 吸 管 不 要 吹 洗 ） ， 上 一 级 吸 管 不 能 接 触 下 一 级 稀释 液 44 l 取 均 匀 供 试 液 稀 释 、 注 平 皿 （ 特 别 注 意 研 细 ） 上 清 液 和 沉 淀 物 影响 测 定 结 果l 注 平 皿 时 ， 要 求 管 内 不 残 留 溶 液l 3.3制 最 准 确 ， 即 3级 稀 释 ， 3个 平 皿 ， 但 厂 方 也 可 根 据 自 己 品 种 选择l 培 养 基 严 格 控 制 在 45 1 ， 水 浴 。l 培 养 基 摇 合 快 速 、 均 匀 ， 不 要 溅 到 皿 边 和 皿 盖 上 。 l 从 稀 释 到 倾 注 培 养 基 全 部 操 作 在 1小 时 内 全 部 完 成 。 45 l 不 要 漏 计 细 小 的 （ 可 适 当 延 长 培 养 时 间 ） 、 琼 脂 内 和平 皿 边 缘 生 长 的 菌 落l 注 意 细 菌 、 酵 母 菌 及 霉 菌 的 区 别 ， 以 及 菌 落 与 药 渣 、培 养 基 沉 淀 、 药 物 结 晶 的 区 别l 平 均 菌 落 在 15个 以 下 时 ， 二 个 平 皿 的 菌 落 数 不 在 0 4，1 7， 2 9， 3 10， 4 12， 5 14， 6 15范 围 内 ；平 均 菌 落 在 15个 以 上 时 ， 二 个 平 皿 菌 落 数 超 过 1倍 ； 三级 菌 落 数 不 能 显 示 差 别 。 不 能 计 数 需 重 新 实 验 。 46 l 菌 落 蔓 延l 1.加 TTC（ 1000ml营 养 琼 脂 加 1 的 TTC 1ml）l 2.开 盖 干 燥 （ 倒 置 斜 放 1 2h）l 3.换 陶 瓦 盖 （ 干 热 灭 菌 的 ）l 异 常 菌 落 数 报 告 法 细 菌 平 皿 上 长 霉 菌 、 霉 菌 平 皿 上 长 细 菌 ， 哪 个 多 ， 以哪 个 计 数 ， 不 能 相 加 计 数 。 47 48 l方法 MUGIndole法l原理 大肠埃希菌具有D葡萄糖醛酸苷酶，能将底物4-甲基伞形酮D葡萄糖醛酸苷水解成为4-甲基伞形酮，在365nm波长处显蓝紫色荧光。 49 l 增 菌 培 养l 分 离 培 养l 纯 培 养l 革 兰 氏 染 色l 生 化 实 验 50 l 增 菌 培 养 取 胆 盐 乳 糖 （ BL） 培 养 基 3瓶 ， 每 瓶 各 100ml。 2瓶 分 别 加 入 规 定量 的 供 试 液 ， 其 中 1瓶 加 入 对 照 菌 50100个 作 阳 性 对 照 ， 第 3瓶 加入 与 供 试 液 等 量 的 稀 释 剂 作 阴 性 对 照 ， 37 培 养 18 24小 时 。 取 0.2ml滴 于 MUG管 内 （ 5ml)， 37 培 养 ， 4、 24hr后 366nm下 观察 荧 光 ， 然 后 加 靛 基 质 试 液 4 5滴 ， 观 察 液 面 颜 色 。 分 离 培 养 将 BL增 菌 培 养 液 轻 轻 摇 动 ， 以 接 种 环 沾 取 12环 培 养 液 划 线 于EMB或 Macc平 板 上 ， 培 养 1824h， 观 察 平 板 上 有 无 可 疑 大 肠 埃希 菌 菌 落 生 长 。 51 EMB： 紫 黑 色 ， 圆 形 ， 稍 凸 起 ， 边 缘 整 齐 ， 表 面 光 滑 ， 湿 润 ， 有 金属 光 泽 。 非 典 型 菌 落 呈 浅 紫 色 、 粉 红 色 ， 或 菌 落 中 心 紫 色 或 无明 显 暗 色 中 心 ， 无 金 属 光 泽 Macc ： 鲜 桃 红 色 ， 圆 形 ， 扁 平 ， 边 缘 整 齐 ， 表 面 光 滑 ， 湿 润 。 非典 型 菌 落 呈 微 红 色 ， 或 菌 落 中 心 呈 红 色 。 52 纯 培 养 如 生 长 菌 落 与 大 肠 埃 希 菌 特 征 相 符 或 疑 似 者 ， 以 接 种 针 轻 轻 接 触 单个 疑 菌 培 养 物 少 许 ， 或 重 新 取 增 菌 培 养 液 划 线 接 种 EMB琼 脂 平 板 ，培 养 1824h， 再 挑 选 单 个 疑 似 菌 落 ， 纯 培 养 ， 作 以 下 检 查 。生 化 试 验 （ IMVIC)靛 基 质 试 验 （ I） 。甲 基 红 试 验 （ M）乙 酰 甲 基 甲 醇 生 成 试 验 （ V-P）枸 橼 酸 盐 利 用 试 验 （ C）乳 糖 发 酵 试 验革 兰 氏 染 色 、 镜 检 革 兰 阳 性 菌 呈 蓝 紫 色 ， 革 兰 阴 性 菌 呈 红 色 。 大 肠 埃 希 菌 为 革 兰 阴 性短 杆 菌 ， 或 球 杆 菌 状 ， 亦 有 杆 菌 状 。 53 MUG-I EMB IMVic 结 果 无 菌无 菌有 菌有 菌 检 出未 检 出未 检 出未 检 出检 出检 出 54 l MUG法 不 必 从 混 合 菌 中 分 离 单 个 菌 落 。l 配 制 MUG培 养 基 时 ， 务 必 校 正 pH值 ， 灭 菌 后 pH不 得 超 过 7.4l 培 养 时 间 ： 一 般 在 4h、 24h观 察 ， 如 荧 光 很 微 弱 ， 可 延 长 至 48hl 结 果 观 察 ： 取 供 试 品 、 阳 性 、 阴 性 管 同 时 在 366mm紫 外 灯 下 观 察l 务 必 挑 选 23个 以 上 菌 落 纯 培 养 ， 分 别 做 IMViC试 验 鉴 别 。l 在 IMViC试 验 中 ， 切 勿 将 培 养 基 带 入 枸 橼 酸 盐 琼 脂 斜 面 上 ， 以 免产 生 假 阳 性 结 果 。l 枸 橼 酸 盐 利 用 试 验 培 养 时 间 为 2-4天 。l 阳 性 对 照 必 须 在 单 独 的 隔 离 间 或 净 化 台 操 作 ， 以 免 污 染 供 试 品 及操 作 环 境 。l 大 肠 埃 希 菌 及 其 他 控 制 菌 ， 按 一 次 检 出 结 果 为 准 ， 不 再 抽 样 复 验 。 55 l 沙 门 菌 属 是 肠 杆 菌 科 的 重 要 致 病 菌 ， 沙 门 菌 分 5个 亚 属 ，药 品 中 沙 门 菌 ， 是 以 鉴 定 沙 门 菌 属 为 准 ， 即 对 每 g（ 或ml） 药 品 中 是 否 检 出 沙 门 菌 作 出 检 验 报 告 。 56 l 增 菌 培 养 预 增 菌 ： 取 营 养 肉 汤 培 养 基 3瓶 ， 100ml。 2瓶 分 别 加 入 10ml的 供试 液 ， 其 中 1瓶 加 入 对 照 菌 50100个 作 阳 性 对 照 ， 第 3瓶 加 入 与 供试 液 等 量 的 稀 释 剂 作 阴 性 对 照 ， 37 培 养 18 24小 时 。 增 菌 ： 1ml预 增 菌 接 种 至 四 硫 磺 酸 钠 亮 绿 培 养 基 （ TTB） 10ml， 37 培 养 18 24小 时 。 分 离 培 养 将 TTB增 菌 培 养 液 轻 轻 摇 动 ， 以 接 种 环 沾 取 12环 培 养 液 划 线 于DHL或 S.S平 板 上 及 EMB或 Macc平 板 上 ， 培 养 1824h， 观 察 平 板上 有 无 可 疑 菌 落 生 长 。 疑 似 菌 落 为 透 明 半 透 明 无 色 或 微 显 培 养 基 色 在 含 H 2S指 示 系 统 培 养 基 上 菌 落 中 心 呈 黑 色 57 l 初 步 鉴 别 三 糖 铁 琼 脂 培 养 基 （ TSI） 红 /黄 H2S ， 红 /黄 H2S ， 黄 /黄 H2Sl 血 清 凝 集 试 验 直 接 凝 集 (0多 价 1血 清 ） 煮 沸 30分 钟 后 凝 集 试 验 l 革 兰 氏 染 色 革 兰 氏 阴 性 杆 菌l 生 化 试 验 靛 基 质 试 验 ， 脲 酶 试 验 ， 氰 化 钾 试 验 ， 赖 氨 酸 脱 羧 酶试 验 ， 动 力 试 验 58 凝 集 反 应 煮 沸 凝 集 0.9 NaCl对 照 生 化 试 验 结 果 + + 符 合符 合不 符 合 检 出检 出未 检 出 59 l 分 离 平 板 在 使 用 前 应 置 36 温 箱 内 倒 置 孵 育 1-2h， 使 其 表 面 温 暖 湿 润 ，利 于 分 离 。l 在 对 供 试 品 进 行 测 试 的 同 时 ， 需 做 阳 性 菌 对 照 及 阴 性 对 照 。 阴 性 对 照 应无 菌 生 长 ， 阳 性 对 照 应 显 示 阳 性 结 果 ， 否 则 检 验 结 果 无 效 。l 对 分 离 平 板 上 的 疑 似 菌 落 ， 应 多 选 取 几 个 菌 落 同 时 进 行 试 验 。 挑 取 菌 落时 ， 在 菌 落 分 布 稀 疏 部 位 挑 选 。l 生 化 试 验 及 血 清 学 试 验 的 被 鉴 定 的 培 养 物 必 须 是 纯 培 养 物 ， 否 则 ， 不 可能 得 到 正 确 结 果 。l 三 糖 铁 琼 脂 斜 面 反 应 的 时 间 ， 应 在 24 2h， 时 间 过 短 过 长 ， 都 可 能 出 现错 误 的 结 果 判 断 。 氰 化 钾 试 验 ， 试 管 口 应 密 塞 ， 否 则 氰 化 钾 浓 度 降 低 ，致 使 抑 菌 作 用 下 降 。l 血 清 凝 集 试 验 的 影 响 因 素 多 ， 除 与 电 解 质 、 pH、 温 度 有 关 外 ， 须 特 别 注意 抗 原 与 抗 体 用 量 的 比 例 恰 当 ， 本 法 试 验 用 多 价 血 清 ， 其 凝 集 力 相 对 较弱 ， 试 验 用 菌 液 量 切 不 能 过 大 。 测 试 前 ， 可 用 已 知 阳 性 菌 测 试 以 掌 握 适宜 菌 液 浓 度 。 l 沙 门 菌 为 肠 道 重 要 致 病 菌 ， 操 作 时 应 特 别 注 意 防 止 分 离 待 检 菌 及 阳 性 对照 菌 对 操 作 环 境 及 试 验 的 污 染 。 所 有 用 过 的 增 菌 、 分 离 、 生 化 试 验 培 养基 、 血 清 学 凝 集 试 验 及 染 色 镜 检 后 的 玻 片 等 ， 均 需 经 灭 菌 后 方 能 洗 涤 。 60 l 铜 绿 假 单 胞 菌 （ Pseudomonas aeruginosa） ， 习 称 绿 脓杆 菌 ， 为 假 单 胞 菌 属 菌 种 ， 广 泛 分 布 在 土 壤 ， 水 及 空气 ， 人 和 动 物 的 皮 肤 、 肠 道 、 呼 吸 道 均 有 存 在 ， 故 可通 过 环 境 和 生 产 的 各 个 环 节 污 染 药 品 。l 本 菌 是 常 见 的 化 脓 性 感 染 菌 、 在 烧 伤 、 烫 伤 ， 眼 科 及其 他 外 科 疾 患 中 常 引 起 继 发 感 染 ， 由 于 本 菌 对 许 多 抗菌 药 物 具 有 天 然 耐 药 性 ， 增 加 了 治 疗 的 难 度 、 国 内 外药 典 均 将 铜 绿 假 单 胞 菌 检 查 列 为 外 用 药 物 检 查 项 目 之一 。 61 l 增 菌 ： BL 100ml 3份l 分 离 培 养 ： 溴 代 十 六 烷 基 三 甲 胺 琼 脂 平 板 ， 于 37 培 养 18 24h。 典 型 菌 落 ： 灰 白 色 扁 平 、 圆 形 或 无 定 形 、 边 缘 不 齐 ， 光 滑 湿 润 ，周 边 略 呈 扩 散 现 象 ， 菌 落 周 围 呈 蓝 绿 色 ， 但 也 有 不 产 色 素 的 菌 株 。菌 落 还 有 粗 糙 型 和 粘 液 型 等 ， 应 注 意 挑 选 。 l 纯 培 养 ： 营 养 琼 脂 斜 面l 革 兰 氏 染 色 ： 阴 性 ， 无 芽 孢 杆 菌 ， 单 个 ， 成 对 或 成 短 链 排 列 l 生 化 试 验 ： 氧 化 酶 试 验 ， 绿 脓 菌 素 试 验 ， 硝 酸 盐 还 原 产 气 试 验 ，41 生 长 试 验 ， 明 胶 液 化 试 验 62 l G 生 化 1、 2阳 性 阳 性 报 告l G 生 化 1阳 性 、 2阴 性 且 3、 4、 5均 为 阳 性 阳 性 报 告 63 l 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ Staphylococcus aureus） 为 葡 萄 球 菌属 中 的 一 种 ， 广 泛 分 布 于 自 然 界 ， 空 气 、 土 壤 、 水 及物 品 上 ， 人 和 动 物 皮 肤 及 外 界 相 通 的 腔 道 中 ， 也 经 常有 本 菌 存 在 。 本 菌 可 产 生 多 种 毒 素 及 酶 ， 这 些 毒 性 物质 能 引 起 局 部 及 全 身 化 脓 性 炎 症 ， 严 重 时 可 发 展 成 为败 血 症 和 脓 毒 血 症 ， 是 人 类 化 脓 性 感 染 中 的 重 要 病 原菌 。 64 l 增 菌 ： 营 养 肉 汤 （ 亚 碲 酸 钠 肉 汤 ） 100ml 3份l 分 离 培 养 ： 卵 黄 氯 化 钠 平 板 ， 甘 露 醇 氯 化 钠 平 板 ， 血 平 板l 典 型 菌 落 ： 金 黄 色 、 圆 形 凸 起 、 边 缘 整 齐 ， 光 滑 湿 润 ， 有 乳 浊 圈（ 卵 黄 氯 化 钠 平 板 ） ， 黄 色 环 （ 甘 露 醇 氯 化 钠 平 板 ） ， 透 明 溶 血环 （ 血 平 板 ）l 纯 培 养 ： 营 养 琼 脂 斜 面l 革 兰 氏 染 色 ： 革 兰 阳 性 球 菌 ， 无 芽 孢 ， 一 般 不 产 生 荚 膜 。 排 列 呈不 规 则 的 葡 萄 状 ， 亦 可 呈 单 个 、 成 双 或 短 链 状 排 列 l 生 化 试 验 ： 血 浆 凝 固 酶 试 验 65 l G 球 菌 、 血 浆 凝 固 酶 试 验 阳 性 ， 报 告 阳 性 66 67 表 1 批 产 品 出 厂 最 少 检 验 数 量供 试 品 批 产 量 N（ 个 ） 每 种 培 养 基 最 少 检 验 数 量注 射 剂 100 10%或 4个 （ 取 较 多 者 ） 100 N 500 10个 500 2%或 20个 （ 取 较 少 者 ）大 体 积 注 射 剂 （ 100 ml） 2%或 10个 （ 取 较 少 者 ）眼 用 及 其 他 非 注 射 产 品 200 5%或 2个 （ 取 较 多 者 ） 200 10个 桶 装 固 体 原 料 4 每 个 容 器 4 N 50 20%或 4个 容 器 （ 取 较 大 者 ） 50 2%或 10个 容 器 （ 取 较 大 者 ） 68 抗 生 素 固 体 原 料 药（ 5克 ） 6瓶 (支 )医 疗 器 具 100 20%或 4件 （ 取 较 大 者 ） 100 N 500 10件 500 2%或 20件 （ 取 较 少 者 ） 注 ： 1.每 种 培 养 基 各 接 种 10支 供 试 品 。 2.抗 生 素 粉 针 剂 （ 5克 ） 及 抗 生 素 原 料 药 （ 5克 ） 的 最 少 检 验 数 量 为6瓶 （ 或 支 ） ， 桶 装 固 体 原 料 的 最 少 检 验 数 量 为 4个 包 装 。 3.如 果 医 用 器 械 体 积 过 大 ， 培 养 基 用 量 可 在 2000ml以 上 ， 将 其 完 全 浸 没。 69 表 2. 上 市 抽 验 样 品 （ 液 体 制 剂 ） 的 最 少 检 验 量供 试 品 装 量 V(ml) 每 支 样 品 接 入 每 管 培养 基 的 最 少 量 （ ml） 最 少 检 验 数 量 （ 瓶 或支 ） 1 全 量 2011 V 5 半 量 105 V 20 2 1020 V 50 5 1050 V 100 10 1050 V 100(静 脉 给 药 ) 半 量 10 100 V 500 半 量 6V 500 500 61.每 种 培 养 基 各 接 种 10支 供 试 品 。 70 表 3 上 市 抽 验 样 品 （ 固 体 制 剂 ） 的 最 少 检 验 量供 试 品 装 量 M（ mg/支或 瓶 ） 每 支 样 品 接 入 每 管 培养 基 的 最 小 量 （ mg） 最 少 检 验 数 量 （ 瓶 或支 ）M 50 全 量 20（ 1）50 M300 半 量 10300 M5g 150 10M 5g 500 102外 科 用 敷 料 棉 花 及 纱布 取 100 mg 或1cm 3cm 10缝 合 线 、 一 次 性 医 用 材 料 整 个 材 料 3 10带 导 管 的 一 次 性 医 疗器 具 （ 如 输 液 袋 ） 10其 它 医 疗 器 具 整 个 器 具 3（ 切 碎 或 拆散 开 ） 10 71 注 ： 1.每 种 培 养 基 各 接 种 10支 供 试 品 。 2.抗 生 素 粉 针 剂 （ 5克 ） 及 抗 生 素 原料 药 （ 5克 ） 的 最 少 检 验 数 量 为 6瓶 （ 或 支） ， 桶 装 固 体 原 料 的 最 少 检 验 数 量 为 4个 包 装。 3.如 果 医 用 器 械 体 积 过 大 ， 培 养 基 用 量可 在 2000ml以 上 ， 将 其 完 全 浸 没 。 72 大 容 量 （ 50-100ml注 射 剂 ） ， 取 半 量 检 查 。 表 1， 2， 3中 最 少 检 验 量 不 包 括 阳 性 对 照 试验 的 用 量 。薄 膜 过 滤 法 增 加 1/2的 最 小 检 验 数 量 作 阳 性 对照 用 ；直 接 接 种 法 增 加 供 试 品 1支 作 阳 性 对 照 。 采 用 直 接 接 种 法 ， 若 每 支 （ 瓶 ） 供 试 品 的 装量 按 规 定 足 够 接 种 两 份 培 养 基 时 ， 则 应 接 种硫 乙 和 马 丁 培 养 基 。 采 用 薄 膜 过 滤 法 ， 其 检 验 量 不 少 于 直 接 接种 法 的 总 量 ， 只 要 供 试 品 特 性 允 许 ， 可 将 容器 内 容 物 全 部 过 滤 。 73 l 应 根 据 供 试 品 的 特 性 选 择 相 应 的 阳 性 对 照 菌 ： 1、 无 抑 菌 作 用 及 抗 革 兰 阳 性 菌 为 主 的 供 试 品 ， 以 金 黄色 葡 萄 球 菌 为 对 照 菌 ； 2、 抗 革 兰 阴 性 菌 为 主 的 供 试 品 以 大 肠 埃 希 菌 为 对 照 菌 ； 3、 抗 厌 氧 菌 的 供 试 品 ， 以 生 孢 梭 菌 为 对 照 菌 ； 4、 抗 真 菌 的 供 试 品 ， 以 白 色 念 珠 菌 为 对 照 菌 。l 加 菌 量 为 小 于 100cful 供 试 品 用 量 同 供 试 品 无 菌 检 查 每 份 培 养 基 接 种 的 样 品量 （ 见 表 2、 表 3） 。l 阳 性 对 照 管 培 养 4872小 时 应 生 长 良 好 。 74 每 次 无 菌 检 查 所 用 的 溶 剂 、 稀 释 剂 和 冲洗 剂 同 法 操 作 ， 作 为 阴 性 对 照 。 阴 性 对 照 不 得 有 菌 生 长 。 75 检 查 法 有 直 接 接 种 法 和 薄 膜 过 滤 法 。只 要 供 试 品 允 许 ， 可 优 先 采 用 薄 膜 过 滤 法 。 如 果 容 器 内 有 一 定 的 真 空 度 ， 可 用 带有 除 菌 过 滤 器 的 针 头 ， 向 检 品 容 器 内 导入 无 菌 空 气 。 各 供 试 品 检 查 时 ， 所 用 培 养 基 的 装 量必 须 以 “ 验 证 试 验 ” 的 结 果 而 定 。 76 l 无 菌 检 查 用 的 滤 膜 孔 径 为 0.45m与 直 径 为 50mm。l 封 闭 式 滤 器 和 开 放 式 滤 器 。l 根 据 供 试 品 及 溶 剂 的 特 性 选 择 滤 膜 的 材 质 。 如 抑 菌 性供 试 品 采 用 具 有 疏 水 性 边 缘 及 低 吸 附 性 的 滤 膜 。l 滤 器 及 滤 膜 采 用 适 宜 的 方 法 灭 菌 ； 使 用 时 ， 要 保 证 滤膜 的 完 整 性 ；l 水 溶 性 供 试 品 ， 先 用 少 量 冲 洗 液 湿 润 滤 膜 。 油 类 供 试品 ， 滤 膜 和 滤 器 ， 在 使 用 前 应 充 分 干 燥 ， 备 用 。l 过 滤 时 ， 保 持 供 试 液 及 冲 洗 液 覆 盖 整 个 滤 膜 表 面 ；l 冲 洗 滤 膜 时 ， 每 张 滤 膜 每 次 冲 洗 量 为 100ml， 冲 洗 液 、冲 洗 量 及 冲 洗 方 法 与 方 法 验 证 相 同 。 77 直 接 接 种 法 即 每 支 （ 或 瓶 ） 供 试 品 按 规 定量 分 别 接 入 含 培 养 细 菌 及 真 菌 培 养 基 的 容 器 中 。 除 另 有 规 定 外 ， 每 个 容 器 中 培 养 基 的 用 量应 符 合 接 种 的 供 试 品 体 积 不 得 大 于 培 养 基 体 积的 10%(表 2)， 用 量 和 培 养 基 的 高 度 同 方 法 验 证试 验 ； 每 种 培 养 基 接 种 的 管 数 同 供 试 品 的 检 验 数量 。 78 上 述 含 培 养 基 的 容 器 按 规 定 的 温 度 培 养 14天 。 培 养 期 间 应 逐 日 观 察 并 记 录 是 否 有 菌 生 长 。如 在 加 入 供 试 品 后 、 或 在 培 养 过 程 中 ， 培 养 基出 现 浑 浊 ， 培 养 14天 后 ， 不 能 从 外 观 上 判 断 有无 微 生 物 生 长 ， 可 取 该 培 养 液 适 量 转 种 至 同 种新 鲜 培 养 基 中 或 划 线 接 种 于 斜 面 培 养 基 上 ， 细菌 培 养 2日 、 真 菌 培 养 3日 ， 观 察 是 否 再 出 现 浑浊 或 斜 面 有 无 菌 生 长 ； 或 取 培 养 液 涂 片 ， 染 色 ，镜 检 ， 判 断 是 否 有 菌 。 79 若 供 试 品 管 均 澄 清 ， 或 虽 显 浑 浊 但 经 确 证无 菌 生 长 ， 判 供 试 品 符 合 规 定 ； 若 供 试 品 管 中 任 何 1管 显 浑 浊 并 确 证 有 菌 生长 ， 判 供 试 品 不 符 合 规 定 ， 除 非 能 充 分 证 明 试验 结 果 无 效 即 生 长 的 微 生 物 非 供 试 品 所 含 。 80 谢 谢