临床基因组学课件：第六章多重连接探针扩增技术及片段分析技术

第六章 多重连接探针扩增技术及片段分析技术临床基因组学检验第一节 多重连接探针扩增技术第二节 片段分析技术临床基因组学检验第六章 主要内容第六章第一节 多重连接探针扩增(MLPA)技术临床基因组学检验第一节 多重连接探针扩增(MLPA)技术 教学目的与要求【掌握】【掌握】1、多重连接探针扩增技术原理2、多重连接探针扩增技术实验步骤【熟悉】【熟悉】1、多重连接探针扩增技术特点2、多重连接探针扩增技术临床应用3、多重连接探针扩增技术结果分析、解读【了解】【了解】1、多重连接探针扩增技术概述2、多重连接探针扩增技术新发展一、MLPA技术概述二、MLPA技术原理/实验操作/结果分析三、MLPA技术临床应用四、MLPA技术特点第六章 第一节 MLPA技术 目录临床基因组学检验五、MLPA技术新发展一、MLPA技术概述-1多重连接探针扩增技术多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA）一、MLPA技术概述-2多重连接探针扩增技术（Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）由荷兰学者Schouten所带领的团队于2002年首先报道。Schouten JP，McElgunn CJ，Waaijer R，et alRelative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplificationJNucleic Acids Res，MLPA主页http:/ 是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测40-50个核苷酸序列拷贝数的改变。一、MLPA技术概述二、MLPA技术原理/实验操作/结果分析三、MLPA技术临床应用四、MLPA技术特点第六章 第一节 目录临床基因组学检验五、MLPA技术新发展2.1 MLPA技术原理 原理：对与样本DNA正确杂交并被连接酶连接的探针进行扩增和定量分析。MLPA的典型特点是，它不是扩增靶序列，而是扩增与靶序列结合的MLPA探针。MLPA探针设计及结构 短探针：长探针：2.2 MLPA反应步骤 包括 DNA变性 杂交 连接 扩增 电泳检测MLPA 反应所需要的仪器 测序仪 PCR仪2.3 MLPA的5个实验步骤2.4 MLPA技术结果分析 毛细管电泳完成后，电泳峰图使用Coffalyser.Net软件进行结果分析。正常样本，其比值约为1（范围0.751.25）缺失突变 杂合缺失突变，其比值约为0.5（范围0.250.75）纯合缺失突变，其比值约为0 重复突变 杂合重复突变，其比值约为1.5（范围1.251.75）纯合重复突变，其比值约为2（范围1.75）以上正常样本正常样本，其比值约为1(范围0.75-1.25)杂合缺失突变杂合缺失突变，其比值约为0.5(范围0.25-0.75)纯合缺失突变纯合缺失突变，其比值约为0杂合重复突变杂合重复突变，其比值约为1.5(范围1.25-1.75)纯合重复突变纯合重复突变，其比值约为2.0(范围1.75以上)一、MLPA技术概述二、MLPA技术原理/实验操作/结果分析三、MLPA技术临床应用四、MLPA技术特点第六章 第一节 目录临床基因组学检验五、MLPA技术新发展三、MLPA技术的临床应用 已广泛应用于：染色体数目异常 基因已知点突变 基因的外显子缺失/重复突变 基因甲基化研究 癌症研究 mRNA 表达研究。等领域3.1 检测人类基因组拷贝数 染色体数目异常3.2 遗传疾病基因缺失、重复突变检测3.3 单核苷酸多态性(SNP)和突变检测囊性纤维化，CFTR基因突变c.1521_1523delCTT 或 DF5083.4 肿瘤诊断与治疗方面的应用一、MLPA技术概述二、MLPA技术原理/实验操作/结果分析三、MLPA技术临床应用四、MLPA技术特点第六章 第一节 目录临床基因组学检验五、MLPA技术新发展MLPA compared to other techniquesMLPA优点 MLPA技术融合了DNA探针杂交和PCR技术的特点，且发扬了其连接依赖的特色，其优点：MLPA不足1）不能探测染色体结构异常；2）不能反映染色体的平衡易位和倒位现象；3）目前尚不能用于单个细胞标本的检测；4）进行染色体三体检查时，被污染的羊水样本不能用于检测；5）尚不能用于检测短串联重复序列多态性（STR）；6）尚不能检测未知的点突变；7）探针设计来源于M13-Holland，耗时且困难。一、MLPA技术概述二、MLPA技术原理/实验操作/结果分析三、MLPA技术临床应用四、MLPA技术特点第六章 第一节 目录临床基因组学检验五、MLPA技术新发展五、MLPA技术新发展（一）化学合成法制备探针 有如下特点：5端探针与3端探针长度基本相同；通过改变杂交序列的长度来区分各探针，或在5-、3-端探针中均设计长度不一的填充序列；相邻探针的长度相差3或4 nt；在一个反应体系中至多可检测20个不同的核苷酸序列，探针长度小于200 nt。（二）MLPA-微阵列技术(Array-MLPA)荷兰Pamgene公司开发建立。这种芯片使用的是一种多孔渗透微阵列技术，通过将大量检测探针固定于氧化铝基片微孔内壁上以定量检测样本扩增产物，通过调节基片上下的空气压力使样本在基片微孔中来回渗透反应。相对于平面介质而言，它的反应接触面积增加了500倍，极大地提高了反应效率。充分反应之后，用洗液来回渗透洗脱没有杂交的多余探针，降低背景噪声的干扰。最后，荧光被激发成像并转换成信号强度信息进行软件分析。建立在微阵列基础上的MLPA 检测通量大、简便快速、自动化程度高重点回顾1、MLPA的中文2、MLPA的原理3、MLPA的实验步骤4、MLPA的应用第六章第一节 多重连接探针扩增(MLPA)技术休息一下休息一下马上回来马上回来临床基因组学检验第六章第二节 片段分析(FA)技术第二节 片段分析技术 教学目的与要求【掌握】【掌握】1、片段分析技术原理2、片段分析技术实验操作【熟悉】【熟悉】1、片段分析技术特点2、片段分析技术临床应用3、片段分析技术结果分析、解读【了解】【了解】1、片段分析技术新发展2、片段分析技术常见问题一、片段分析技术原理二、片段分析技术特点三、片段分析技术实验操作、结果分析四、片段分析技术的临床应用第六章 第二节 片段分析 目录临床基因组学检验五、片段分析技术常见问题一、片段分析技术原理 片段分析技术（fragment analysis，FA）片段指以DNA或cDNA为模板，由PCR过程所产生的、数目不等的核苷酸构成的大小不等的DNA片段。对这些片段，利用其大小或标记荧光的差异进行分析的方法即为FA。一、片段分析技术原理 Std-PCR(Standard PCR)，标准PCR 是最传统的检测方法 通过在重复区的两侧设计引物进行扩增，检测扩增片断的长度来间接计算目标长度。理论上，扩增片断的长度减去非重复区的长度，即为重复片断的长度，除以3即重复的次数。Std-PCR(Standard PCR)，标准PCR例如：检测强直性肌营养不良 扩增(CTG)n重复片断，检测其片断长度，根据片断长度计算CTG重复数目。而重复数目超过一定长度时，Std-PCR技术无法扩增。Std-PCR(Standard PCR)，标准PCR一、片段分析技术原理 TP-PCR(Triplet Primer PCR)，三重引物PCR 理论上可以用于检测所有类型的短串连重复序列。这种方法可避免Std-PCR可能漏检超长重复序列的固有缺陷。TP-PCR(Triplet Primer PCR)，三重引物PCR PCR的反向引物被设计与致病基因的重复区进行杂交。各种大小不一的序列在三重PCR反应中被扩增出来。如果重复数量增加了，一个明显的PCR产物轮廓（梯形轮廓）会在峰图中出现。TP-PCR(Triplet Primer PCR)，三重引物PCR TP-PCR技术的优势在于：无论重复数目长度有多少，总是有一定量的产物产生，能够指示扩增的重复数目的存在。缺点在于：同一份样本的不同重复数目的等位基因所产生的信号会相互干扰，造成重复数目的定量不准。TP-PCR(Triplet Primer PCR)，三重引物PCR一、片段分析技术原理二、片段分析技术特点三、片段分析技术实验操作、结果分析四、片段分析技术的临床应用第六章 第二节 片段分析 目录临床基因组学检验五、片段分析技术常见问题二、片段分析技术特点一、片段分析技术原理二、片段分析技术特点三、片段分析技术实验操作、结果分析四、片段分析技术的临床应用第六章 第二节 片段分析 目录临床基因组学检验五、片段分析技术常见问题三、片段分析技术实验操作 主要涉及到：体系配置 添加DNA模板 PCR扩增 PCR扩增产物检测实验操作FA 反应所需要的仪器 测序仪 PCR仪三、片段分析技术结果分析 标准PCR：以质控为参考，根据软件分析得出未知标本的片段大小后，与质控比较后计算相差的bp数。对于如何选择哪个等位基因作为参考，可按就近原则。标准-PCR的结果计算三、片段分析技术结果分析 TP-PCR：此PCR得出的结果不必计算重复数，可用作验证标准PCR的结果。如标准PCR只检测到单个等位基因，TP-PCR会有两种检测结果，一是提示该样本只有一个等位基因，即纯合子，按照标准PCR结果报告；二是有阳性峰出现，按照标准PCR结果报告。三、片段分析技术结果分析三、片段分析技术结果报告 结果报告，诸如此类的描述：“检测到SCA3相关基因的CAG重复数，其中一个为23次，属于正常范围；另一个为72次，属于全突变范围。”一、片段分析技术原理二、片段分析技术特点三、片段分析技术实验操作、结果分析四、片段分析技术的临床应用第六章 第二节 片段分析 目录临床基因组学检验五、片段分析技术常见问题四、片段分析技术的临床应用 主要用来检测动态突变（dynamic mutation）：动态突变是指DNA中的核苷酸（主要为三核苷酸）重复序列的拷贝数发生扩增而产生的突变。重复序列的大小从3个碱基到33个碱基长不等。在基因的编码区、3或5-UTR、启动子区、内含子区出现三核苷酸重复，及其他长短不等的小卫星、微卫星序列的重复拷贝数。四、片段分析技术的临床应用 动态突变 在减数分裂或体细胞的有丝分裂过程中发生扩增而造成遗传物质的不稳定状态。动态突变伴随着世代的传递而不断扩增，重复序列的拷贝数越来越多，在达到一定的倍数后就导致疾病的发生，其发病率和疾病的严重性也逐代升高加重。四、片段分析技术的临床应用 动态突变 例如，1型强直型肌营养不良（DM1）是由DMPK基因（19q13.3）的CTG重复数扩增而引起的，正常人重复数为5-34次，遗传不稳定正常等位基因为35-49次，全突变则50次，病情严重者甚至在2000次以上。DM1的诊断需联合应用std-PCR和TP-PCR技术。一、片段分析技术原理二、片段分析技术特点三、片段分析技术实验操作、结果分析四、片段分析技术的临床应用第六章 第二节 片段分析 目录临床基因组学检验五、片段分析技术常见问题五、片段分析技术常见问题（一）如何选峰？（二）如何读峰？常见的问题是峰型复杂 初学者不知道该如何选择、读取峰型的选择 单峰形态：可由主峰、stutter峰组成，若STR位点重复数目较大时可以产生Stutter+峰，Size大于主峰；stutter峰的特点是，相邻的stutter峰之间、与主峰之间Size差别总是重复片断的整数倍。主峰、stutter峰均有可能产生由于Taq酶加A/不加A引起的N/N+峰形。峰型的选择 双峰形态：两个单峰Size较为接近时，Size较大的峰所产生的Stutter峰与Size较小的主峰发生重叠。双峰峰形应该与单峰峰形区分开来。（一）如何选峰？由于扩增时会出现由于扩增时会出现stutter峰及峰及A峰，一般峰，一般规定选择最高峰作为等位基因的片段规定选择最高峰作为等位基因的片段。（一）如何选峰？峰型选择-1 峰型选择-2峰型的选择-32a、2b、2c、2d、2e为单峰形态2f、2g、2h为双峰形态（二）如何读峰？1、原则上读取主峰的Size；出现N/N+峰形时，可根据具体的情况读取N峰或N+峰，但应该统一。（二）如何读峰？2、遇到存在Stutter+峰的情形，首先找到整个峰中最高的2个峰，读取Size最大者。重点回顾1、FA的定义2、FA的原理3、FA的实验步骤4、FA的临床应用第六章第二节 片段分析(FA)技术