亲本细胞制备

亲本细胞的准备细胞融合技术中亲本细胞的准备通常包括：小鼠骨髓瘤细胞的准 备以及脾细胞的准备。1）收集骨髓瘤细胞一些品系的小鼠经腹腔注射矿物油可诱生出骨髓瘤。骨髓瘤细胞 由于存在合成和分泌蛋白的机制，也会分泌一些免疫球蛋白。一般用 于融合的骨髓瘤细胞通常都是经筛选出来的缺失抗体分泌能力的细 胞株，已避免杂交瘤细胞分泌一种以上的免疫球蛋白而影响单克隆抗 体的产生。对于骨髓瘤细胞的冻存，通常应用如下步骤：1）在融合前一周左右复苏冻存的小鼠骨髓瘤细胞，（2）将保存细胞从液氮中取出后立即置于3739C温水浴中,（3）融化后取出细胞，充分洗涤除去冷冻液，4）悬浮于含 20%胎牛血清的 DMEM 或 RPMI-1640 完全培养基中，对细胞计数并检查活力（M90%）,调整细胞浓度，（5）细胞培养液中可添加8-AZ防止HGPRT酶缺失回复突变，（6）经24h培养稳定生长后，细胞即进入对数生长期，此时应 及时更换新鲜培养液保持细胞充分营养供应，并调整细胞 浓度，使细胞保持在对数生长期。免疫脾细胞作为亲本的骨髓瘤细胞虽然具有无限的繁殖能力，然而长期体外 培养可能会对以后的融合产生不利影响。因此，对产生较高融合率的 亲本骨髓瘤细胞应培养扩增一批，并及时冻存以用于下一次融合，细 胞的冻存可用精密的细胞冷冻仪，也可用简单的方法冻存而获得良好 效果。加具有抗体活性细胞的特异性的B细胞，然后抗原直接交联到骨髓瘤 育，往往可以得到更多的融合体。2)收集小鼠脾细胞脾细胞分离，一般在末次免疫后 3-5d 左右即可取脾脏分离淋巴 细胞。收集脾细胞过程中要严格进行无菌操作，是整个过程都处于无 菌状态。从小鼠体内得到脾细胞有以下方法;不锈钢网挤压法：(1) 引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2) 无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用 5ml 无血清培养液冲洗一次；(3) 把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中；(4) 在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用 无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中；(5) 把细胞悬液注入50ml离心管中，加10 20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中置5分钟；(6) 离心(800一1000转分)计数、备用。骨髓瘤细胞针对于这种方法对脾细胞损伤较大，因此，现在很少使用。而被 另外一种方法所取代。通过断颈处死，皮肤消毒等步骤取出脾脏，注入 0.5ml 无血清 培养基使脾脏轻度肿胀，用小号针头多点刺破脾脏被膜，轻轻挤压使 淋巴细胞逸出。(这种方法对脾细胞的影响较小。) 利用以上两种方法所得到的细胞悬液 中都存在红细胞，可能会对融合造成不利影 响，因此很多研究人员采用尽量放血来处死 动物，以减少脾内红细胞的数量。