肠道菌群细菌的鉴定

肠道菌群细菌的鉴定一、实验目的1.掌握革兰染色法。2.掌握 IMViC 试验。二、仪器与试剂 玻片，接种环，生理盐水，酒精灯，结晶紫溶液，卢戈氏染液，石炭酸-复红溶液，沙黄液， 光学显微镜，二甲基氨基苯甲醛试剂，葡萄糖蛋白胨水培养基，甲基红试剂（甲基红）.02g, 95%酒精60mL,蒸馏水40mL）, 6% a -萘酚酒精溶液，40% KOH，铵盐作为唯一氮源，并利 用枸橼酸盐作为唯一碳源的培养基，层析滤纸，正丁醇，甲酸， 1.5%乳酸， 1.5%乙酸溶液， 3%溴甲酚蓝酒精溶液，层析缸，需氧血琼脂平板，厌氧血琼脂平板，七叶苷培养基，胆汁 七叶苷培养基，65g/L NaCI血清肉汤，PYR试剂，DNA琼脂平板，1 mol/L盐酸，MRS培养基， X-Gal。三、实验步骤 1.革兰染色法（ 1）涂片：取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握培养皿，右手 持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌， 待冷却后，取培养细菌少许与盐水混匀，直接取 12 环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。 接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。（ 2）干燥：目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然 干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰， 以致标本烤枯，不堪检视。（3）固定：手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3 秒，以 玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢 以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。（4）初染：将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色13 分钟，用流水 缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液） 直至无颜色流下为止。（5）媒染：加卢戈氏染液45滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒 净。（6）脱色：在95%酒精缸中脱色约35秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复23次， 直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。（ 7 ）复染： 用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。8）光学显微镜下观察细菌染色情况（9） G+菌被染成紫色；G-菌被染成红色。2. 大肠杆菌（ 1）革兰染色法 实验结果应为被染成红色，即G-菌。（ 2 ） IMViC 试验 靛基质（吲哚）试验 斑点试验法：将一片滤纸放在培养皿的盖子上或一张载玻片上，滴加 11.5mL 二甲基氨基苯 甲醛试剂液于滤纸上使其变湿，取 1824h 琼脂平板培养物涂布于浸湿的滤纸上，在 13min 内观察。棕色的试剂由紫红变为红色者即为阳性。甲基红（MR）试验：取一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37C 培养4872h,取出后加甲基红试剂35滴，立即观察结果。如果培养液呈红色者为阳性， 橙色者为可疑，黄色者为阴性。二乙酰（V-P）试验：将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基后，于3537C培养48h，于 2mL培养液内加入甲液（6% a-萘酚酒精溶液）1mL和乙液（40% KOH） 0.4mL,摇振混合。 试验时强阳性者约于5min后，可产生粉红色反应。如长时间无反应，置室温过夜，次日不 变者为阴性。枸橼酸盐利用试验：将被检细菌少量接种到培养基（铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作 为唯一碳源）中，37C培养24d，观察培养基颜色变化。培养基变蓝色，阳性；不变，阴 性。实验结果应分别为：阳性，阳性，阴性，阴性。3. 乳酸杆菌（ 1）革兰染色法实验结果应为被染成紫色，即G+菌。（ 2）乳酸纸层析法层析滤纸的制备将层析滤纸剪成1.5cm*11cm的长条状，在距层析纸一端约4cm处用铅 笔划线确定点阳线，使用前充分干燥。配制展开剂正丁醇:甲酸:水=80:15:5 配制标准液配制 1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液。制备待测样品将培养基菌种加入生理盐水37C培养24h后离心，收集上清液离心，收 集上清液。点样一一用毛细管分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过2mm，平衡 2h层析一一将点好样的层析纸放入，使点有样品的一端浸在展开剂中，但不可浸及样点。观察 展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5cm处，取出层析纸。显色一一以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒并计算Rf 值。实验结果Rf值应该一致。4. 脆弱拟杆菌耐氧试验从每个琼脂平板上挑取45 个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2 块需氧血琼脂平板 和 1 块厌氧血琼脂平板（每个琼脂平板可划 46 区，每区种一个可疑菌落） ，然后将平板分 别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。 实验结果应为在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长。5.肠球菌（1）革兰染色法实验结果应为被染成紫色，即G+菌。（2）触酶试验取洁净玻片1 张，用接种环挑取细菌，加3% H2O2 1 滴，立即观察结果。实验结果应为无气泡，即阴性。（3）七叶苷水解试验 将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。实验结果应为培养基变为黑色，即阳性。（4）65g/L NaCl 生长试验：将待检菌接种65g/L NaCI血清肉汤中，35C孵育18-24h。 实验结果应为细菌生长且使得培养基变黄，即阳性。（5）PYR 试验：挑取被检菌落在含有PYR的纸片上涂擦，35C孵育5min,再于纸片上滴加PYR试剂，约 1min 后观察纸片颜色。实验结果应为纸片呈红色，即阳性。6. 梭杆菌属（1）靛基质（吲哚）试验 实验结果应为棕色的试剂由紫红变为红色者，即阳性。（2）DNA 酶试验法：DNA琼脂平板上点种待检菌，35C孵育1824h，用1 moI/L盐酸倾注平板，观察结果。 实验结果应为菌落周围有透明区，即阳性。（3）触酶试验取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3%H2O2 1滴，立即观察结果。 实验结果应为有气泡，即阳性。7. 双歧杆菌（1）革兰染色法实验结果应为被染成紫色，即G+菌。（2）在基础改良MRS培养基中添加X-Gal，对双歧杆菌进行检测双歧杆菌单独表面涂布呈白色或浅兰色，标准双歧杆菌表面涂布37C48h。培养后，双歧杆 菌呈白色或浅兰色,边缘整齐,表面隆起部分显白色，菌落背面观察呈兰色底晕，随机挑取 5 个白色菌落经革兰氏染色涂片镜检，该菌为革兰氏阳性，呈各种分叉，V形，棍棒状，单个, 成对，或链状排列，多种不规则形状，即可基本判定为双歧杆菌。四、注意事项使用革兰染色法应避免脱色的时间过少，以免将G-菌染成紫色。