光合、荧光测定技术在园艺植物研究中的应用.ppt

光合、荧光测定技术 在园艺植物研究中的应用 秦嗣军 沈阳农业大学 园艺学院 2014年4月1日,一、光合作用研究的基础知识 光合作用的发现 从1771年英国化学家Priestley发现光合作用， 光 6CO2 + 6H2O C6H12O6 + 6O2 叶绿体 到现在已有240多年历史了，这期间有多人因相关研究获得诺贝尔奖。,光合作用的意义：1. 一切生命活动的物质基础 2. 人类活动能量的主要来源,光合作用的基本过程 光反应：光能吸收，能量传递与转化 水的光解，O2产生，同化力形成。 暗反应：利用同化力固定和还原CO2 2ATP 2NADPH RuBp + CO2 2PGA - 2DPGA- 2PGAld,羧化,还原,更新,光反应中形成ATP和NADPH在暗反应中用于CO2的同化，故合称为同化力。 光反应和暗反应是靠同化力联系起来的。光反应与暗反应相互协调与制约。环境因素可分别通过影响光、暗反应来影响光合机构的运转。,X Pheo Q Fd PQ NADP Cytf O2 PC P700 光 量 子 H2O Z P680 光 量 子,光 合 电 子 传 递 链,PS,PS,研究光合作用的工具 光反应 叶绿素荧光仪、氧电极 暗反应 光合仪 群体光合光合仪、光谱仪、冠层分析仪,测定光反应仪器,红外线分析仪（暗反应）的应用,群体光合,CIRAS-1/2 可配各种群体同化室。,CPY-3 开放式群体同化室,CPY-3 开放式群体同化室,群体或单株光合作用的研究,植物单叶的光合速率并不一定与植物群体的生产力成正比 叶面积指数是影响植物群体光合作用的一个重要因素,CPY-2 密闭式群体同化室,PLC(I) 膨胀型群体同化室,光合作用（暗反应）研究中常用参数,净光合速率（Pn）：net photosynthetic rate 光合能力（Pm）:photosynthetic capacity 羧化效率（CE）:carboxylation efficiency 表观量子效率（AQY）：apparent quantum yield 光、CO2补偿点（LCP 、CCP）compensation point 饱合光、CO2（SL、SC）saturation RuBP最大再生速率:max regeneration velocity of RuBP 气孔限制值（Ls）:stomatal limitation value 蒸腾速率（Tr）transpiration rate 水分利用效率（Tr/Pn）,二、光合测定技术在园艺植物研究中应用,园艺植物光合作用研究意义 干物质的90%以上来源于叶片的光合作用，通过光合作用形成碳水化合物是产量形成的主要物质基础，因此，研究园艺植物的光合生产对于揭示产量形成的规律具有重要的意义。 改善光合性能是提高产量的关键因素。,园艺植物光合作用研究内容,（1） 园艺植物种类、品种和砧木的光合特性比较 （2） 叶片发育过程中的光合特性 （3） 环境因素对光合作用的影响（温、光、水、土） （4）栽培管理因素对光合生产力的影响（栽植方式、栽植密度、整形方式等） （5）各种试验处理对植株影响的（只要涉及植物的生长发育）光合作用机理。 （6）从分子角度，如转基因后表达等,光合作用是衡量、评价园艺作物产量、品质的生理基础。,光合测定技术与数据分析,各种响应曲线 叶片发育进程光合作用特征 日变化和季节变化 光合特性对环境条件的响应等,不同植物的净光合速率和不同叶位叶片表观量子效率(dPn/dPAR),光补偿点（LCP） 饱和光强（SL） 表观量子效率 (AQY=dPn /dPED) 暗呼吸速率 光补偿点和饱和光强是区分阴生和阳生植物的重要参数; AQY反映植物光能利用率和光抑制的指标。,通过Pn-PAR响应曲线得出以下重要参数,Pn-PAR响应曲线,表观量子效率 AQYdPn/dPFD,（饱和光强）,光补偿点,呼吸速率,通过Pn-Ci/Ca响应曲线可得出重要参数 CO2补偿点（CCP） 饱和CO2浓度（SC） 羧化效率 (CE=dPn /dCi) RuBP最大再生速率(Jmax) 气孔限制值(Ls) CO2补偿点是区分C3和C4植物的重要参数 CE反映RuBP羧化酶的有效活性。,PnCi/Ca 响应曲线,A为CO2(Ci)补偿点； B为实际大气CO2浓度的光合速率； C为细胞间隙浓度等于大气CO2浓度时的 光合速率； D为CO2 浓度饱和时的光合速率Jmax，相当与RUBP最大再生速率； CE为响应曲线初始斜率表示羧化效率；,CE=dPn /dCi,Jmax,四种蓝莓叶片的光合-温度响应曲线,Pn-LT响应曲线,通过温度响应曲线得出以下重要参数 高温补偿点 低温补偿点 光合最适温度 以上参数是反应植物生态适应的重要参数。,不同叶位叶片光合作用对水气压亏缺VPD的响应,PnRH响应曲线,光合作用的日变化,长期干旱(D)、淹涝(W)及正常浇水(CK) 大豆倒数第1、4、7位叶片光合日变化,1st node,4th node,7th node,大豆功能叶和老叶Pn、Gs、对强光的响应,光合作用启动过程的研究,园艺植物光合研究测定技术实用技巧 1.试材选择具有代表性、一致性（可用光合仪预选） 2.时间选择（光合参数测定在上午9时-11时最好） 3.测试项目的选择（根据想要说明问题设计测试指标，不必全部平行） 4.立意的选择（如植物分根实验） 5.做图技巧,分析:如何巧妙设计实验证实气孔关闭是由干旱引起十分重要,光合作用的气孔限制与非气孔限制,限制因子定律:如果一个过程的速度受多种因子的制约 , 则这些因子中处于最低水平或最不能满足过程要求的因子将成为限制整个过程速度的关键所在,并被称为限制因子。只有提高了 限制因子的水平,整个过程的速度 才能进一步增加。,在过去相当长的一段时间内，人们夸大了气孔阻力对光合的限制作用。因为人们观察到在几乎所有造成光合下降的场合，都观察到气孔导度与光合一起下降。 不管气孔导度和光合速率如何变化， CO2供不应求条件下，气孔是限制因素 CO2供过于求条件下，叶肉是限制因素,(Ca-Ci) Pn= ( Rb+Rs+Rm) Rb 边界层阻力 Rm叶肉阻力 Rs 气孔阻力 相对Rs和Rm来说Rb可以忽略不计因而光合速率可以表示为: (Ca-Ci) Pn = (Rs+Rm),不同叶位大豆叶片光合速率对气孔导度的响应,光合速率并不是随气孔导度的增加而无限增加的,气孔限制值的计算,1. 制作PnCi 响应曲线 A 为实际大气CO2浓度的光合速率； Ao为气孔阻力为零时，即细胞间隙浓度等于大气CO2浓度时的 光合速率； 气孔限制值Ls为 Ls=(A0-A)/A Ls= (Ca-Ci)/Ca,Jmax,虽然后一种计算方法非常简单，但是只有在A0和A都在光合响应曲线的直线部分才可使用。,Farquhar和Sharkey气孔限制的判据 只有当Ls和Ci都下降时，光合作用的下降才是由气孔限制造成的，否则光合的下降是由叶肉因素造成的。 大量的研究表明，在轻度逆境胁迫下，光合的下降是多数是由气孔限制造成的；而在严重的逆境胁迫下，虽然气孔导度大幅度下降，但是Ci却显著升高，Ls下降，说明此时光合的下降多数是由叶肉限制造成的。,气孔不均匀关闭时，会夸大Ci值的计算，使该判据失去作用。如何解决？ 无论什么情况下，只要提高CO2浓度能够显著地增加光合速率，就说明光合的下降是气孔限制造成的，反之亦然。 比较大气条件下的光合速率和高CO2浓度下的光合速率。,光合作用的羧化限制与RuBp再生限制 Pn-CO2响应曲线的初始阶段受RuBp羧化效率的限制。 dA/dCi(CE)反应了Rubisco的活性或活化的Rubisco量。 第二阶段受RuBp再生限制受同化力ATP, NADPH制约Jmax被看成RuBp最大再生速率，因为它与光合电子传递相偶联又被当成电子最大传递速率。,光合作用的光化学限制 光反应限制有两种情况，一种是光照不足； 另一种是光照充足，但光化学反应效率下降。 光合作用的表观量子效率，反映了光能转换效率,光合作用的光抑制与光破坏防御机制 光抑制概念: 强光造成光合功能下降的过程称为光抑制 特征：光合效率下降；Fv/Fm 及AQY 下降 过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认为发生了光抑制就意味着光合机构遭到破坏。甚至把光抑制 、光破坏、光漂白、光氧化等概念通用。,光抑制的基本特征 AQY及Fv/Fm下降. 说明叶片吸收的光能不能有效地转化为化学能。 光抑制的机理 光合机构的破坏：PSII是光抑制损伤的主要场所，破坏也可能发生在反应中心也可能发生在与次级电子受体结合的蛋白上。发生光破坏后的结果：电子传递受阻，光合效率下降。 产生光破坏的原因：过剩光能产生的高能电子无法利用，产生如 chl*, 单线态氧、超氧阴离子等氧化性很强的分子破坏光合机构。,光破坏的概念,当过剩的光能不能及时有效地排散时，对光合机构造成不可逆的伤害，如对光合色素造成光漂白、光合作用中心D1蛋白的降解及光合机构的光氧化等。,一切影响CO2同化的外接界因素如低温、高温、水分亏缺、矿质元素亏缺等都会减少对光能的利用，、导致过剩光能增加，进而加重光破坏。,3P680 + O2 P680 + 1O2 氧化性极强的1O2首先攻击反应中心色素P680，使PS反应中心失去电荷分离能力，最终引起D1蛋白降解.PS受体侧电子传递受阻时易产生此种破坏。 Fd + O2 Fd + O2 O2。启动类囊体膜的脂质过氧化，破坏光合色素、类囊体系统以及膜结合酶使电子传递效率下降，严重时使电子传递系统失活。 P680+ + Car P680 + Car+ PS受体侧电子传递受阻时易产生此种破坏。P680+还能氧化D1蛋白肽链中酪氨酸残基和叶绿素等色素。,激发能,光化学反应形成同化力,热耗散,荧光,光破坏防御机制,CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢,荧光是研究光能分配的探针,（1）减少对光能的吸收 增加叶片的绒毛、蜡质 减少叶片与主茎的夹角 （2）增强代谢能力 碳同化 光呼吸与活性氧清除系统 氮代谢 Mehler反应与活性氧清除系统 （3）增加热耗散 依赖叶黄素循环的热耗散 作用中心可逆失活 状态转换,三条途径相互竞争 F0作用中心完全开放时的荧光 Fm作用中心完全关闭时的荧光 完全关闭时荧光又与耗散的多少有关，由于耗散Fm下降为Fm，=NPQ Fv=Fm-F0 因为光化学反应而降低的荧光 最大光化学效率=Fv/Fm,热耗散过程虽然能耗散过剩光能,保护植物不被强光破坏,但却不可避免地降低了光化学效率,按传统的观点凡是导致光化学效率降低的过程都称为光抑制。 由此可见,光破坏的防御机制也是光抑制的一种形式,实际上在自然条件下,大多数的光抑制都是由光破坏防御机制造成的。,问题的提出 1 . 植物在发育过程中光合能力不断发生变化，这种变化是由光能吸收转化效率造成的还是由碳同化能力改变造成的？ 2. 植物叶片衰老过程中，光合作用光反应过程和碳同化能力都降衰退。哪个过程是限制因素？ 3 . 如果碳同化能力下降快，必定导致过剩光能增多，光抑制和光破坏的危险增大；如果衰老过程是由叶绿素降解造成的， 就会使光合机构捕获的光能也减少，造成过剩光能的可能性降低，此时还能否光抑制和光破坏？,光呼吸的生化历程,光呼吸的原因： Rubisco的加氧活性,光呼吸是否仅仅是一个浪费过程？ 抑制光呼吸是否会提高光合速率？ 高CO2会抑制Rubisco的加氧活性，那么 在高CO2浓度下光呼吸是否会降低？ 光强对光呼吸是如何影响的？,不同生育期大豆叶片光合Pn、光呼吸Pr日变化,三、叶绿素荧光分析技术在园艺植物生理生态研究中的应用,Kautsky and Hirsh（1931）发现，将暗适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光（Kautsky效应）。 荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。,叶绿素荧光现象的发现,激发能,光化学反应形成同化力,热耗散,荧光,荧光是研究光能分配的探针,CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢,通过调节PSII反应中心的开放的程度干涉荧光的发射，根据不同情况下荧光的变化来分析光合机构运行情况。,如何测定叶绿素荧光？ 现有两类荧光仪可以用来测定叶绿素荧光。 1.续激发式荧光仪（如PEA)，必须将测定叶片在避光下测定，在照光条件下，仪器无法区分叶绿素荧光和自然光中与荧光波长相同的红光和远红光。 但是这类荧光仪有很高的分辨率，每秒钟能够测定10万次荧光变化，因此是研究光合机构中电子传递瞬间变化的有力工具。,2.脉冲调制式荧光仪（如FMS-2)，可以避免上述问题。在测定时，仪器提供一种脉冲调制式光，能诱导出的脉冲式的荧光。当有其它光线同时存在时，会产生以下三种光信号（1）自然光中具有荧光波长的红光信号 （2）自然光诱导的非脉冲荧光信号 （3）脉冲调制光诱导的脉冲荧光信号 仪器排除前两种信号，监测脉冲荧光信号的变化,Fv/Fm =(Fm-Fo)/Fm ； qP=(Fm-Ft )/(Fm-Fo) ； PSII =(Fm-Ft )/Fm ；NPQ =(Fm-Fm)/Fm ；qNP= (Fm-Fm)/(Fm-Fo),t,(Fs),主要荧光参数及其意义 Fo： 初始荧光产量（Original fluorescence yield ）也 称基础荧光，是PS反应中心（经过充分暗适应以后）处于完全开放状态时的初始荧光产量。,。 此时光化学猝灭系数qP1，非光化学猝灭系数qNP0。一般认为，这部分荧光是在天线中的激发能尚未被反应中心捕获之前，由天线叶绿素发射出的。当存在天线热耗散时，Fo会降低；当反应中心失活或遭到破坏时，Fo会提高。已知过高的温度往往使PSII放氧复合体脱离，反应中心失活。此时Fo会明显提高。因此，可以用Fo随温度的变化动态来反映高温对光合器的危害，并用来评价植物的抗热性。,主要荧光参数及其意义 Fm：最大荧光产量（Maximal fluoreseence yield ）， 是PS反应中心完全关闭时的荧光产量。通常叶片经暗适应20min后测得。 Fv=Fm-Fo：可变荧光，反映PS的电子传递最大潜力。经暗适应后测得。,Fv/Fm：暗适应下PS反应中心完全开放时的最大 光化学效率，反映PS反应中心最大光能 转换效率。,在非胁迫条件下，Fv/Fm的值很稳定，据Bjorkmanand Demmig对大量植物的测定，其平均值为0.832+0.004，但在逆境条件下，Fv/Fm显著降低。正因为如此，所以Fv/Fm的降低常作为发生光抑制或PSII遭受其他伤害的指标。 在一些研究论文中，CO2同化的表观量子效率的降低也常常作为光抑制的指标，但其意义是不同的,Fv/Fo：代表PS潜在光化学活性，与有活性的反 应中 心的数量成正比关系。 Fo： 光适应下初始荧光。 Fm： 光适应下最大荧光。 Fv=Fm-Fo：光适应下可变荧光。 Fv/Fm：光适应下PS最大光化学效率，它反映有 热耗散存在时PS反应中心完全开放时的 光化学 效率，也称为最大天线转换效率。,Ft(或Fs ): 稳态荧光产量 steady-state fluorescence yield。 PS=(Fm-Fs)/Fm ： PS实际光化学效率，它反 映在照光下PS反应中心部分关闭的情况下的 实际光化学效率。 qP =(Fm -Fs)/(Fm-Fo) ： photochemical quenching 光化学猝灭系数，它反映了PS反应中心的开 放程度。指PSII天线色素吸收的光能用于光化学反应电子传递的份额 1- qP 用来表示PS反应中心的关闭程度。,qNP =(Fm-Fm)/(Fm-Fo) ：非光化学猝灭系数 NPQ = (Fm-Fm)/Fm Fm/Fm-1 ：非光化学猝灭 non-photochemical quenching ETR = PS absorbed PFD 0.5 ：PSII电子 传递 速率,荧光参数是研究植物光化学效率、 光抑制与光破坏防御的有效的工具 该技术被广泛的使用在植物生态、植物抗逆性、筛选高光效或抗逆品种、转基因植物的功能分析、光抑制和光破坏的防御机制等方面的研究。,激发态叶绿素的4种去激发途径,叶绿素荧光分析应用实例,NaCl胁迫对杂交酸模叶片光化学猝灭系数（qP）、PSII反应中心光能捕获效率（Fv/Fm）、和PSII量子效率(PSII)的影响,A：光化学猝灭系数（qP） B：光能捕获效率（Fv/Fm） C：PSII量子效率(PSII),对照叶片和盐胁迫叶片光化学猝灭系数（qP）、PSII光能捕获效率（Fv/Fm）、PSII量子效率(PSII，)、非光化学猝灭(NPQ，D)对温度的响应。示NaCl出来增加叶片的抗高温能力,，对照； ，200 mmol/L NaCl,强光下对照与缺锰叶片PSII实际光化学效率（PSII）和电子传递速率（ETR）和光化学猝灭qP的变化。,经1200molm-2s-1强光及不同浓度PEG处理4小时后， 不同节位大豆离体叶片Fv/Fm、PSII、Prate、及NPQ的变化,田间大豆不同节位叶片在生长发育 过程最大光化学效率（Fv/Fm）的变化,叶绿素荧光用于能量分配的研究,长期干旱及淹涝胁迫大豆叶绿素荧光参数的日变化的比较,叶片由黑暗转入强光后叶绿素荧光的猝灭过程,叶绿素荧光用来研究光合机构在光下的启动过程,，对照； ，200 mmol/L NaCl,经热胁迫（44 ）处理后对照和盐胁迫（200 mmol/L）杂交酸模叶片光合作用的启动过程。 示盐胁迫后增强了叶片对高温的抗性。,快速叶绿素荧光诱导动力学的应用O，I,J,P 分析,O，I,J,P 曲线包含巨大的信息，是研究植物光合机构功能的有力工具,叶绿素荧光诱导动力学曲线,从O点到P点的荧光上升过程称为快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，主要反映了PS的原初光化学反应及光合机构的结构和状态等的变化。 从P点到T点的下降阶段主要反映了光合碳代谢的变化，随着光合碳代谢速率的上升，荧光强度（T）逐渐下降。,叶绿素荧光诱导动力学曲线的意义,调制式荧光荧光仪：FMS-1、FMS-2、PAM等（主要用来研究叶绿素荧光诱导动力学曲线的下降阶段，即光合作用的暗反应） 连续激发式荧光仪：PEA、HandyPEA、PEA Senior（主要用来研究快速叶绿素荧光诱导动力学，即光合作用的光反应）,研究叶绿素荧光诱导动力学曲线的主要手段,Handy PEA,PEA Senior,典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线（O-J-I-P荧光诱导曲线）,光合机构中原初光化学反应的简单模型,O-J-I-P荧光诱导曲线的意义,O：PS的电子受体（QA、QB、PQ等）处于最大程度氧化态时的荧光，最小荧光。O点时电子受体主要状态：QAQBPQ。O相的荧光强弱与反应中心色素含量的多少及组成有关。 J：PS的电子受体QA第一次处于瞬时最大程度还原态时的荧光。J点时电子受体主要状态：QAQB-，QA-QB-。,I：反应了PQ库的异质性,即快还原型PQ库和慢还原型PQ库的大小。I点时电子受体主要状态：QA-QB2-。 P：PS的电子受体（QA、QB、PQ等）处于最大程度还原态时的荧光，最大荧光。 P点时电子受体主要状态：QA-QB2-，PQH2。,苔藓脱水过程中O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,玉米缺铁后O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,不同逆境下O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,烟草叶片高温处理后O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,大豆叶片衰老后O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,New approach developped by Prof. Reto Strasser -Geneva University, Bioenergetics Lab.,JIP-test application and theory of energy flux,JIP-test理论基础：生物膜能量流动,高度简化的生物膜能量流动模型图,JIP-test分析的部分参数,Drought: 8.6.2004 Winter Wheat,Viginta Ilona Pobeda Arida Eva Stephens BU-9,Drought: 11.6.2004,Viginta Ilona Pobeda Arida Eva Stephens BU-9,杂交酸膜叶片展开过程中FV/FM和PIABS的变化,Fv/Fm相同时不同高温下大豆叶片O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,高温处理后杂交酸膜叶片能流动的变化,specific fluxes (membrane model),phenomenological fluxes (leaf model),与调制式荧光仪相比，连续激发式荧光仪有很多优点，获得信息量大、操作简便快捷、易于大量重复、便携、存储量大、价格便宜。,随着光合理论的发展，叶绿素荧光动力学特别是快速叶绿素荧光诱导动力学获得了迅猛的发展并日趋完善。由于具有快速和非破坏性的优点，快速叶绿素荧光诱导动力学目前不仅在植物生理研究中被广泛应用，它已深入到许多其它领域和应用部门，如遗传育种、病虫害防治及污染检测等。,