外泌体的生物特点及在肿瘤诊断中的应用

外泌体的生物特性及在肿瘤临床诊断中的应用陈利鹏摘要： 外泌体是生物体内广泛存在的由各类细胞释放的囊泡小体，被磷脂双分子层包裹。里面含有蛋白和RNA等多种成分，在细胞间信息传递中扮演重要角色。具有抗肿瘤免疫、 促血管新生等生理功能。在肿瘤的发生发展中起着重要的作用 ，特别是有携带肿瘤遗传信息、调节肿瘤微环境、促进肿瘤血管生成等效应。越来越多的研究将目光投向了利用外泌体进行疾病的诊断、预后及治疗临床应用。本文就其研究现状和在肿瘤临床诊断中的应用做简要综述。关键词：外泌体，肿瘤，诊断，临床应用1 外泌体简介外泌体（exosome）是细胞向外分泌的一种囊状小泡，直径大约40-140 nm。具有脂质双层膜结构1。Johnstone在网织红细胞培养液中分离得到一种囊泡状的结构物质，并将其命名为外泌体（exosome）2。但当时研究人员认为它只是一种细胞的废弃物。最近几年研究发现，外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生和进程密切相关。2013年，诺贝尔生理或医学奖颁发给了外泌体领域的三位科学家，使得外泌体成为医学领域研究的热点。目前外泌体研究主要集中在细胞通讯介导细胞行为、生物标志物筛选、药物载体研发三大方向3。1.1 外泌体的形成真核细胞和原核细胞都能分泌细胞外小囊泡（extracellular vesicles， EVs）。在哺乳动物中，血液、淋巴液、组织液、尿液都能分离到EVs4。细胞向外分泌的膜性小囊泡有多种，包括微泡（microvesicle）、凋亡小体和外泌体。微泡是细胞胞体直接出芽，脱落后形成的细胞外囊泡，直径约50-1000 nm。凋亡小体则是细胞凋亡时产生的囊泡，一般直径在500-2000 nm。外泌体是通过细胞内体途径生成，首先是细胞内内溶酶体微粒体内陷，形成多囊泡小体（multi-vesicle body ，MVBs），在刺激作用下，多囊泡小体与细胞膜融合，然后将小体内的囊泡释放到细胞外，即为外泌体。外泌体大小均一，直径一般在40-140 nm5。1.2 外泌体的组分外泌体是膜性小体，富含胆固醇和鞘磷脂。外泌体内含有蛋白、脂质、DNA、RNA，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。蛋白质占据了外泌体内含物的很大部分，种类非常丰富，根据Vesiclep数据库显示， 外泌体以及各种胞外囊泡中大约包含92 897种蛋白质6。这些蛋白大致可分为两类：一类是外泌体中普遍存在，参与其结构形成的蛋白质，多分布于外泌体的表面或内腔中，包括微管蛋白、肌动蛋白和微丝结合蛋白等细胞骨架成分；膜转运和融合相关蛋白，如: Annexins、多种Rab蛋白、Flotillin、Alix和TSG101等；一些信号分子，如蛋白激酶、G-蛋白等；还有大量与外泌体生成密切相关的四跨膜区蛋白质超家族成员，如CD9、CD63、CD81和CD82等7, 8。另一大类蛋白质与细胞来源有关，相对特异。抗原呈递细胞来源的外泌体中含有丰富的MHC-I和MHC-II、CD80和CD86；血小板来源的外泌体中含有血友病因子和整合蛋白CD41a；而T淋巴细胞分泌的外泌体表面带有穿孔蛋白和颗粒酶9。肿瘤细胞产生的外泌体中还可以检测到过度表达的蛋白质标志物，如FasL、TRAIL 和TGF-等肿瘤抗原和免疫抑制蛋白，这使得外泌体在肿瘤及相关疾病的诊断中具有重要的潜在应用价值。外泌体内的RNA主要为小RNA，如miRNA，不仅仅是遗传信息的内源性调控者也是调节细胞通讯的分泌因子及疾病的生物标志物。从人乳汁中提取的外泌体中含有60 余种与免疫调节相关的miRNA；胶质瘤细胞的外泌体中则含有大量与细胞增殖迁移、血管形成和免疫反应相关的miRNA；肿瘤来源的外泌体中miRNA的存在极为普遍并且丰度较高，在肿瘤自身的调控中发挥重要作用，目前已成为研究热点10。目前发现，RNA 含量丰富的外泌体，主要参与组织间遗传信息的传递过程；RNA含量低的外泌体，如免疫细胞来源的外泌体，主要在抗原递呈和免疫共刺激过程中发挥作用。1.3 外泌体的作用方式外泌体释放后，可以通过近分泌、旁分泌和内分泌等三种方式实现生物信息的交换和传递。外泌体可以通过细胞间质作用于近距离的细胞，也可以进入血液或其他体液循环作用到远距离的靶细胞。距离较近的可由近分泌途径直接被受体细胞吸收，距离稍远的可由旁分泌途径被吸收，还有部分外泌体进入循环系统作用于全身系统由内分泌途径被吸收。外泌体与靶细胞发生作用的方式一般有一下2种11：(1) 通过蛋白或其他活性物质直接作用于靶细胞表面的受体；(2)通过与靶细胞膜融合，将外泌体中的成分释放到胞内。 一旦外泌体被受体细胞吸收后，其内载有的脂质、蛋白质、 mRNA、microRNA 等成分可以通过改变转录和翻译程序影响蛋白修饰和定位，调节信号级联通路、关键酶反应以及细胞自动调节等方式影响受体细胞的细胞表型和功能，而来源细胞和受体细胞的种类及其生理病理状态将决定具体是哪种机制发挥主要作用。2 外泌体在肿瘤发生过程中的作用相比正常细胞，肿瘤细胞会分泌更多的外泌体，并且含有肿瘤相关的遗传信息。 Khalid等用电镜拍摄到了神经胶质瘤细胞的EVs从分泌到脱落的图像，证实了肿瘤细胞可以分泌EVs12。肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤进展的多个方面。肿瘤分泌的外泌体可以引起间质细胞表型的改变，从而有利于肿瘤的侵袭和传播。外泌体可以促进肿瘤细胞和间质细胞间受体、活性蛋白、脂质或遗传信息的改变， 如肿瘤分泌的外泌体可以通过传递白介素8和趋化因子到邻近的细胞增强肿瘤的侵袭性。肿瘤分泌的外泌体能够抑制免疫反应，通过诱导免疫效应中诸如NK细胞和细胞毒性T细胞（CTLs）的凋亡，从而有利于肿瘤细胞逃避免疫监视。外泌体在肿瘤转移过程中发挥重要作用。肿瘤细胞可以分泌外泌体影响靶向器官的细胞，为肿瘤细胞转移提供合适的微环境。例如，巴一、应国光13等人研究发现，胃癌细胞分泌的外泌体中含有表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor, EGFR），可以被递送到肝脏，并且整合在肝脏基质细胞的质膜上，能有效激活肝细胞生长因子（HGF），为癌细胞向肝脏转移提供适合的肝样微环境，促进转移性癌细胞的着陆。来自机体细胞的外泌体也能影响肿瘤细胞，促进肿瘤细胞转移生长。Zhang14等研究发现，由于脑内星胶质细胞分泌的含有特定miRNA的外泌体传递到脑部肿瘤细胞内，导致肿瘤细胞内PTEN的表达下调，从而通过增加繁殖和抑制凋亡来相互促进脑转移肿瘤细胞的生长。除了促进肿瘤细胞转移，外泌体在肿瘤转移倾向上也发挥着调节作用。Hoshino15等通过外泌体的蛋白质组学分析发现，不同器官倾向性的肿瘤细胞来源的外泌体具有不同的整合素（integrin）表达谱，整合素64和61与肺转有关，而整合素v5与肝转有关。敲出整合素64和v5可减少外泌体被靶器官细胞获取，进而分别降低了肺和肝的转移。3外泌体在肿瘤诊断中的应用外泌体作为肿瘤细胞间信息交流的载体，其中所携带的一些特异性蛋白质以及核酸成为了肿瘤诊断和治疗的新靶标。在非小细胞肺癌的研究中，Rabinowits16等发现，肺癌患者与未患病对照组之间的总体miRNAs水平存在显著差异，且患者循环系统中的外泌体与肿瘤细胞释放的外泌体之间，其miRNAs组分具有很强的相似性，表明循环系统中外泌体包含的miRNAs有望成为肺癌筛查的分子标志。此外，Li17等发现，富亮氨酸-2糖蛋白1(leucine-rich -2-glycoprotein 1，LRG1)在非小细胞肺癌患者尿液外泌体以及肺组织中表达水平均较高，说明外泌体中的LRG1可作为非小细胞肺癌的诊断标记物。胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDACs)由于难以早期诊断，具有预后差、高转移的特点。来自美国的Sonia18等通过大量的胰腺癌病人血清样本分析发现，相较正常人而言，胰腺癌病人血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican-1，GPC1）阳性的外泌体占比显著增高。进一步研究发现，GPC1阳性外泌体在早期胰腺癌病人的血清中丰度就显著高于正常人群。而最近Lai19等人发现，外泌体miR-10b和miR-30c作为胰腺癌标志物的诊断方式要优于外泌体GPC1。这一发现为胰腺癌的前期诊断提供了十分重要的依据。在前列腺癌（PCa）的研究中，Logozzi M20等研究人员对比PCa患者和对照组血浆中表达有前列腺特异性抗原（PSA）的外泌体的水平，对照组中包含有良性前列腺肥大（BPH）的受试者。结果显示，只有PCa患者具有高水平表达CD81和PSA的纳米囊泡。这样携带的肿瘤生物标志物如PSA的外泌体可能代表了一种用于早期筛查诊断前列腺癌的新型非侵入性临床工具。到目前为止，已有肿瘤诊断的产品推出。如Exosome Diagnostics公司的推出了基于外泌体PSA的前列腺癌检测试剂盒。虽然已有外泌体诊断产品出来，但仍未被管理机构批准，因此目前只能与现已批准的检测方案并行使用21。随着肿瘤外泌体研究的深入，以及诊断技术的成熟，外泌体标志物用于肿瘤诊断的应用会越来越多，为肿瘤诊断、预后提供科学可靠的解决方案。4 总结外泌体作为细胞间的通信通道，参与一系列的胞间信号传递，调控一系列的生物过程。外泌体的发现和证实给人们对机体生理、病理过程的认识带来深刻影响。目前外泌体对其分泌机理、作用方式和功能有较多的认识，但对外泌体的分类尚有不明确，外泌体与微泡的区别还没有完全确定的物理、生化鉴别标准22。此外，外泌体的分离技术不够完善，难以快速得到纯度较高的外泌体，对后续的检测分析造成困难；另一方面，对外泌体的检测系统也尚未开发成熟，难以满足临床大样本量的检测。不过随着各种高灵敏度、高通量和高内涵的分析手段的进步，会大大加快外泌体的研究和应用。随着精准医学概念的提出，越来越多的人开始关注如何能做到疾病的精确诊断和治疗，外泌体作为一个新型的研究热点，由于它在体内存在的广泛性和获取的便捷性，已经成为了疾病诊断治疗的潜在有效方式，在精准医学发展上有着光明的前景。参考文献 1van der Pol E, Bing A N, Harrison P, et al. 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