高中生物 专题五 课题3 血红蛋白的提取和分离课件 新人教版选修1

专题专题5DNA和蛋白质技术和蛋白质技术 课题课题3血红蛋白的提取和分血红蛋白的提取和分离离 栏目链接栏目链接 栏目链接栏目链接蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作学研究中经常要做的工作 栏目链接栏目链接请思考：请思考：1怎样从血细胞中提取血红蛋白呢？怎样从血细胞中提取血红蛋白呢？2用猪血和鸡血提取血红蛋白，效果一样吗？用猪血和鸡血提取血红蛋白，效果一样吗？ 栏目链接栏目链接 栏目链接栏目链接1概念概念 _是根据是根据_分离蛋白分离蛋白质的有效方法，也称作分配色谱法质的有效方法，也称作分配色谱法。一、凝胶色谱法一、凝胶色谱法血红蛋白的分离方法血红蛋白的分离方法 凝胶色谱法凝胶色谱法 相对分子质量的大小相对分子质量的大小 多孔球体多孔球体 多糖类化合物多糖类化合物 贯穿的通道贯穿的通道 栏目链接栏目链接(2)分离原理：分离原理： 相 对 分 子 质 量 较 小 的 蛋 白 质 ： 容 易 进 入相 对 分 子 质 量 较 小 的 蛋 白 质 ： 容 易 进 入_的通道，路程的通道，路程_，移动速度较慢，通过，移动速度较慢，通过凝胶柱的时间凝胶柱的时间_。 相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶内相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程部的通道，只能在凝胶外部移动，路程_，移动，移动速度较快，通过凝胶柱的时间速度较快，通过凝胶柱的时间_。 凝胶内部凝胶内部 较长较长 较长较长 较短较短 较短较短 栏目链接栏目链接二、缓冲溶液二、缓冲溶液1作用作用 在 一 定 范 围 内 ， 缓 冲 溶 液 能 够 抵 制在 一 定 范 围 内 ， 缓 冲 溶 液 能 够 抵 制_对溶液对溶液pH的影响，维持的影响，维持pH基本不变。基本不变。2配制配制 通常由通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的缓冲剂的_就可以制得在就可以制得在_的缓冲液。的缓冲液。 外界的酸和碱外界的酸和碱 使用比例使用比例 不同不同pH范围内使用范围内使用 栏目链接栏目链接三、电泳三、电泳血红蛋白的分离或鉴定方法血红蛋白的分离或鉴定方法1概念概念 带电粒子在带电粒子在_的作用下发生的作用下发生_的过的过程程。2原理原理 (1)许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有有_，在一定的，在一定的pH下，这些基团会带上下，这些基团会带上_或或_。 电场电场 迁移迁移 可解离的基团可解离的基团正电正电 负电负电 栏目链接栏目链接( 2 ) 在 电 场 的 作 用 下 ， 这 些 带 电 分 子 会 向 着在 电 场 的 作 用 下 ， 这 些 带 电 分 子 会 向 着_移动。移动。 ( 3 ) 电 泳 利 用 了 待 分 离 样 品 中 各 种 分 子电 泳 利 用 了 待 分 离 样 品 中 各 种 分 子_以及分子本身的以及分子本身的_、_的不同，使带电分子产生不同的的不同，使带电分子产生不同的_，从而实现，从而实现样品中各种分子的分离。样品中各种分子的分离。 与其所带电荷相反的电极与其所带电荷相反的电极 带电性质的差异带电性质的差异 大小大小 形状形状 迁移速度迁移速度 栏目链接栏目链接四、蛋白质的提取和分离过程四、蛋白质的提取和分离过程蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：_、粗分离、粗分离、_和纯度鉴定。和纯度鉴定。样品处理样品处理 纯化纯化 栏目链接栏目链接 栏目链接栏目链接一、血红蛋白的提取和分离的原理一、血红蛋白的提取和分离的原理1蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小直径大小直径大小大于凝胶颗粒空隙大于凝胶颗粒空隙直径直径小于凝胶颗粒空隙小于凝胶颗粒空隙直径直径运动方式运动方式垂直向下运动垂直向下运动无规则的扩散运动无规则的扩散运动运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路程运动路程较短较短较长较长洗脱顺序洗脱顺序先从凝胶柱中洗脱先从凝胶柱中洗脱出来出来后从凝胶柱中洗脱后从凝胶柱中洗脱出来出来 栏目链接栏目链接2.电泳原理及方法电泳原理及方法电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷程。许多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH中会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子中会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。或提纯的目的。 栏目链接栏目链接琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷，由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状差异及分子的大小、形状的不同的不同在凝胶中加入在凝胶中加入SDS，使蛋，使蛋白质解聚成单链，与各种白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质形成蛋白质SDS复合物，使其迁移速度完复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小全取决于分子的大小 栏目链接栏目链接例例1关于电泳的说法不正确的是关于电泳的说法不正确的是()A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程的过程B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动动C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少它所带净电荷的多少D用用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小泳迁移率完全取决于分子的大小 栏目链接栏目链接解析：解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能能与各种蛋白质形成蛋白质与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所带负电所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。于分子的大小。答案：答案：C 栏目链接栏目链接变式变式训练训练1凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须的蛋白质分子之间必须()A具有相同的相对分子质量具有相同的相对分子质量B相对分子质量不同，但都是相对分子量较大相对分子质量不同，但都是相对分子量较大的分子的分子C相对分子质量不同，但都是相对分子质量较相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子小的分子D具有相对分子质量不同的蛋白质具有相对分子质量不同的蛋白质 栏目链接栏目链接变式变式训练训练解析：解析：若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝捍材谝贫多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝捍材谝贫嗬嗬虢隙蹋虢隙蹋肿咏闲肿咏闲囊贫囊贫嗬虢铣谑欠肿咏洗蟮南嗬虢铣谑欠肿咏洗蟮南韧韧床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队排队”，凝胶表现出分子筛效应。凝胶表现出分子筛效应。答案：答案：D 栏目链接栏目链接二、血红蛋白的提取和分离的实验操作二、血红蛋白的提取和分离的实验操作1样品处理样品处理(1)红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，再加采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无净。洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。 栏目链接栏目链接(2)血红蛋白的释放：红细胞在蒸馏水和甲苯的作用血红蛋白的释放：红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。下破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况：第显看到试管中的溶液的分层情况：第3层的红色透明液层的红色透明液体是血红蛋白的水溶液。体是血红蛋白的水溶液。(4)透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质。杂质。 栏目链接栏目链接2凝胶色谱操作凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填：装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现存在气泡，必须重装。现存在气泡，必须重装。装填完后，立即用装填完后，立即用300 mL 20 mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。充分洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。 栏目链接栏目链接(2)样品的加入和洗脱：样品的加入和洗脱：加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。按正确方法加样，不能破坏凝胶面按正确方法加样，不能破坏凝胶面。进行洗脱时，等红色蛋白质接近色谱柱底端时，进行洗脱时，等红色蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集采用试管收集。 栏目链接栏目链接例例2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用的作用是是()A增大蛋白质的相对分子质量增大蛋白质的相对分子质量B改变蛋白质分子的形状改变蛋白质分子的形状C掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别D减少蛋白质分子的相对分子质量减少蛋白质分子的相对分子质量 栏目链接栏目链接解析：解析：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入破坏蛋白质分子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入还原剂还原剂SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和侧链和SDS结合成蛋白结合成蛋白SDS复合物，复合物，SDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这样就消除的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。子的大小。答案：答案：C 栏目链接栏目链接2下列对凝胶电泳的相关认识，错误的是下列对凝胶电泳的相关认识，错误的是()A蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取决于分子的大小决于分子的大小B蛋白质在蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小率完全取决于分子的大小CSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相对分子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离对分子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离D凝胶中加入凝胶中加入SDS可以消除净电荷对迁移率的影可以消除净电荷对迁移率的影响响变变 式式训训 练练 栏目链接栏目链接解析：解析：电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，而性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十量，是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然分子所带的负电荷远远超过天然变变 式式训训 练练 栏目链接栏目链接蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低。对分子质量的高低。答案：答案：A变变 式式训训 练练 栏目链接栏目链接