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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章蛋白质和氨基酸的测定,1.,概述,2.,凯氏定氮法,3.,蛋白质的快速测定法,4.,氨基酸总量的测定,5.,氨基酸的分离与测定,1.蛋白质的组成,蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。但,含氮则是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志,。,在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮的色素等；）。,第一节 概述,蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分。,pro是食品的重要组成之一，也是重要的营养物质，一个食品的营养高低，主要看蛋白质含量的高低。pro除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。,许多食品都要求检验其蛋白质含量，蛋白质是最重要的常规检测指标，如：乳制品、肉制品中蛋白质的测定。“大头儿”事件，奶粉中几乎无蛋白质。,2.,食品中蛋白质含量的测定意义,在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说,来,动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，,例如,：,牛肉中蛋白质含量为,20.0%,左右，,猪肉中为,9.5%,，,兔肉为,21%,，,鸡肉为,20%,，,牛乳为,3.5%,黄鱼为,17.0%,，带鱼为,18.0%,，大豆为,40%,，稻米,为,8.5%,，面粉为,9.9%,，菠菜为,2.4%,，黄瓜为,1.0%,，桃为,0.8%,，柑橘为,0.9%,，苹果为,0.4%,和油菜为,1.5%,左右。,不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，,一般蛋白质含氮量为,16%,，即一,份氮素相当于,6.25,份蛋白质，此数值（,6.25,）称为蛋白质系数,。,不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为,6.25,，花生为,5.46,，大米为,5.95,，大豆及其制品为,5.71,，小麦粉为,5.70,，牛乳及其制品为,6.38,。,3.,蛋白质数系,4.,蛋白质的测定方法,蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。,具体测定方法：,凯氏定氮法GB经典法。最常用的，国内外应用普遍。,双缩脲反应,酚试剂法,紫外分光光度法 快速测定法,染料结合反应,考马斯亮蓝G250法,国外：红外分析仪,第二节凯氏定氮法,方法特点：,1.,测定样品中的总含氮量，再乘以相应的蛋白质换算系数，而求出蛋白质含量。不同食品的蛋白质系数有所不同。,2.,凯氏定氮法,是,测定总有机氮量较为准确,、,操作较为简单的方法之一，,可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析,方法，至今仍,被作为标准检验方法。,适用范围：,此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。,凯氏定氮法分：常量微量自动蛋白质分析仪三种，它们的测定原理相同。,原理,样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。,2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O,加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，,纯硫酸沸点,340,，加入硫酸钾之后可以提高,至,400,以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提,高沸点，但效果不如硫酸钾。,加硫酸铜 作为催化剂,。还可以作消化终点指示剂（消化终点不再有硫酸亚铜生成，溶液呈现清澈的蓝绿色）。（做蒸馏时碱性指示剂）。,还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。,加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。,常量蒸馏终点的判断：,NH3的检查：以奈氏试剂检查。,奈氏试剂的配制：P220,微量蒸馏的终点：蒸馏10min,常量蒸馏结束必须检查NH3是否蒸完全，微量蒸馏以时间判断终点，因它的NH3含量少。,操作方法：,整个过程分三步：,消化,蒸馏,吸收与滴定,样品消化,2NH,2,（,CH,2,）,2COOH+13H,2,SO,4,（,NH,4,）,2,SO,4,+6CO,2,+12SO,2,+16H,2,O,一定要用浓硫酸（,98%,）,消化装置：,P219,原始的装置,自动回流消化装置,红外线消煮炉,仪器：,219,页 要防止爆沸。,蒸馏：,在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：,2N,a,OH,(NH,4,),2,SO,4,2NH,3,Na,2,SO,4,2H,2,O,蒸馏装置：常量与微量凯氏定氮法有所不同。,常量凯氏定氮法：直接加热蒸馏,消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。,微量凯氏定氮法：水蒸汽蒸馏,见实验动画,注意事项：,（1）所用试剂应用,无氨蒸馏水,配制。,（2）消化过程应注意,转动,凯氏烧瓶，,利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲,下,消化完全。,（3）若样品含脂肪或糖较多时，应注意,发生,的大量,的,泡沬,可加入,少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度,。,（4）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300,g/L,23,ml,过氧化氢,后再加热。,一般消化至透明后，继续消化30,min,即可,，但当含有特别难以氨化的,氮,化,合,物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长,，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低,。有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色,。,（8）蒸馏过程应注意接头处无,松漏,现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1,min，,将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，,绝,不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。,（9）,硼酸吸收液的温度,不应超过40,C，,否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。,（10）混合指示剂在碱性溶液中呈,绿色,，在中性溶液中呈,灰色,，在酸性溶液中呈,红色,。,K氏自动定氮仪：,其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。,北京福德泰和科技有限公司,产品名称：凯氏定氮仪,第三节蛋白质的快速测定法,蛋白质快速测定法：,包括：双缩脲法,福林酚比色法,紫外分光光度法,考马斯亮蓝染料比色法,双缩脲法,原理,当脲（尿素）,NH,2,CONH,2,被小心地加热至,150160,时，两分子缩和成双缩脲。,NH,2,CONH,2,+,NH,2,CONH,2,NH,2,CONH,CONH,2,+NH,3,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成,紫色络合物,，这种反应叫,双缩脲反应,。（缩二脲反应）,蛋白质分子中含有肽键,CONH,与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，,其颜色深浅与蛋白质含量成正比,，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（,560nm,）,方法特点及应用范围,本法,灵敏度较低,，但,操作简单快速,，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于,豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。,另外，采用此法测定蛋白质样品不用消化。比色所用标准蛋白质采用凯氏定氮法测出的样品。,二、紫外吸收法,原理,利用蛋白质的特有基团，,R,（,NHCHCO,）,在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。在波长（,280mm,）下，光吸收程度与蛋白质浓度（,3,mg,mL,）成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照,事先用凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样所作的标准曲线,，即可求出样品蛋白质含量。,适用范围：,本法操作简便迅速，常用于生物化学研究工作；但由于许多非蛋白质成分在紫外光区也有吸收作用，干扰因素，故在食品分析领域中的应用并不广泛。,最早用于测定牛乳的蛋白质含量，也可用于测定小麦面粉、糕点、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量。,用凯氏法测定作标样做标准曲线,三、福林-酚比色法,1原理,蛋白质与福林（Folin）-酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。,2说明,福林-酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小2 个数量级。但对双缩脲法有干扰的物质对福林酚法的影响更大。酚类及柠檬酸均对本法有干扰。,本法在060mg/L 蛋白质范围呈良好线性关系。,四、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量,1.,原理,考马斯亮蓝,G,250,是一种蛋白质染料，考马斯亮蓝,G-250,在游离状态下呈,红色，当它,与蛋白质结合后变为,青色,，使蛋白质染色，在,620nm,处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。,此法简单而快速，适合大量样品的测定，灵敏度与福林酚法相似，但不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。,该法是,1976,年,Bradford,建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为,0,1 000g,mL,，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。,2.,说明,：,（,1,）,Bradford,法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。,（,2,）有些阳离子，如,K+,、,Na+,、,Mg2+,、,(NH4)2SO4,、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如,TritonX-100,、,SDS,等严重干扰测定。,（,3,）蛋白质与考马斯亮蓝,G-250,结合的反应十分迅速，在,2min,左右反应达到平衡；其结合物在室温下,1h,内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。,双指示剂甲醛滴定法：,电位滴定法：,茚三酮比色法：,第四节氨基酸总量的测定,一、双指示剂甲醛滴定法,1.原理：,氨基酸具有酸性的-COOH 基和碱性的-NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2 基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱溶液来滴定-COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如：,2方法特点及应用,此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。,在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。,脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；,酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；,溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。,3,试剂：,40%,中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用,氢氧化钠将,40%,甲醛中和至蓝色。,0.1%,百里酚酞乙醇溶液，,0.1%,中性红,50%,乙醇溶液，,0.1 mol/L,氢氧化钠标准溶液。,4,操作：同时取两份样：,+,中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和,样液中其它酸性物质。,+,百里酚酞,+,中性甲醛,+NaOH,滴定，中和了,样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总,和。二者之差可计算氨基酸含量,5说明及注意事项,（1）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。,（2）若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定。,(3),氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们,不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示,，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。,百里酚酞PH9.2,中性红PH7.0中点,二、茚三酮比色法-,
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