抗体-抗体的多样性及其产生机制-gaobo

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,抗体，抗体的多样性及其产生机制,INSTITUTE FOR IMMUNOBIOLOGY,DEPARTMENT OF IMMUNOLOGY,高波,2014-10-09,抗体研究简史,20,世纪有关抗体研究获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家,年代,学者姓名,国家,获奖成就,1901,E.A.Behring,德国,发现抗毒素，开创免疫血清疗法,1908,P.Ehrlich,德国,提出体液免疫理论和抗体生成的侧链学说,1960,F.M.Burnet,澳大利亚,提出抗体生成的克隆选择学说,1972,G.M.Edelman,美国,阐明抗体的本质,R.R.Porter,英国,阐明抗体的化学结构,20,世纪有关抗体研究获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家,年代,学者姓名,国家,获奖成就,1984,N. Jerne,丹麦,提出天然抗体选择学说和免疫网络学说,G. Kohler,德国,建立杂交瘤技术制备单克隆抗体,C. Milstein,阿根廷,单克隆抗体技术及免疫球蛋白基因表达的遗传调控,1987,Tonegawa,日本,阐明抗体多样性的遗传基础,Emil von Behring, 1901, antitoxins,Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody,Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene,Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody,Paul Ehrlich , 1908, production of antibody,Nobel Prize winners,Burnet, 1960,，,Clonal selection,Jerne, 1984,Idiotype network,抗体,生物体最奇妙的分子,无限的多样性（,diversity,),功能与结构的双重性,可变区,抗原结合,(,特异性,specificity,),恒定区,生物学效应功能,分泌型和膜型表达,B,细胞接受抗原刺激后增殖分化成浆细胞产生的糖蛋白。,基本概念,Ag1,Ab1,Ag1-Ab1,Ag2,Ag2,Ag2-Ab2,与相应抗原,特异性,结合。,主要存在于血清中。,Emil von Behring,(1845-1917),抗毒素（,1888,）,凝集素（,1896,Gruber and Durham,）,沉淀素（,1897, kraus,）,抗体,(antibody),是介导体液免疫的重要效应分子，是,B,细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白。,抗体一词的由来（,19,世纪末）,1937,年,Tiselius,和,Kabat,用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动最慢的血清组分，称为,球蛋白,抗体与,球蛋白关系,抗体,球蛋白,1968,和,1972,年,WHO,和国际免疫学会分别决定将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白,.,抗体与免疫球蛋白关系,抗体 免疫球蛋白,功能,概念,结构,概念,一、基本概念,B,细胞接受抗原刺激后增殖分化成浆细胞产生的糖蛋白,与相应抗原特异性结合,主要存在于血清中,又称免疫球蛋白,(Immunoglobulin),分泌型,sIg,、膜型,mIg,1,）四肽链通过链间二硫键组成,H,2,L,2,重链：五类,(isotype:,a,、,g,、,m,、,d,、,e,),轻链：两型,(,k,、,l),一、基本结构,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,3,C,H,4,V,L,C,L,Fab,Hinge region,Fc,COO,NH,3,+,免疫球蛋白的结构,Rodney Porter 1917-1985,Nobel Prize in 1972,Gerald Edelman 1929 -,Nobel Prize in 1972,Fab,Fab,Fc,Porter,主要致力于将抗体中负责与外来抗原结合的部分从抗体中分开，他发现可利用酵素,-,木瓜蛋白,(papain),，将抗体分成三部分。,H,H,L,L,Edelman,将抗体分子假定与其它各种蛋白质一样，由一些,polypeptide,链所构成，而他认为,polypeptide,链间最可能以二硫键结合在一起，故他试图将这些键结打断来观察其中的各条,polypeptide,链，结果他发现这些氨基酸链单独存在时都不具有任何抗体的功用。,重链（,Heavy chain:H,链）, 大约,500 a.a,糖基,(+),类别,（,Class,）,:,H,链：, , , , .,(Ig) IgA, IgG, IgM IgD, IgE,轻链（,light chain:L,链）,大约,214 a.a,糖基,(-),型别（,type,）,:, ,重链和轻链（,Heavy & light chains,）,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,3,C,H,4,V,L,C,L,Fab,Hinge region,Fc,COO,NH,3,+,可变区,(Variable region, V,H,/V,L, Fv),：结合抗原,V,H,和,V,L,：,高变区,HVR, 抗原结合部位互补决定区,CDR,骨架区,FR,1,4,(,1971, Kabat),恒定区,(Constant region, C,H,/C,L,),绞链区,(Hinge region),The basic structure of immunoglobulins,三个功能区,(Domain),0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220,50,40,30,20,10,0,CDR1,CDR2,CDR3,抗体分子的多样性,Ig,l,链 的 氨 基 酸 序 列,酸残基的变异率,相应位置上氨基,对来自不同,B,细胞克隆的,Ig,轻链氨基酸序列进行比较，发现,V,区的变化主要集中在,3,个分别由,6,10,个氨基酸残基组成的狭小区域内。这,3,个区又被称作高可变区或互补决定区（,CDR,），参与抗原结合部位的组成。,0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220,50,40,30,20,10,0,CDR1,CDR2,CDR3,抗 体 分 子 的 多 样 性,酸残基的变异率,相应位置上氨基,Diversity and Specificity,抗原,B,细胞表位,抗体,CDR,表位,Ab,Ag,铰链区（,Hinge region,）,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,3,C,H,4,V,L,C,L,Fab,Hinge region,Fc,COO,NH,3,+,特点：,1),极富弹性,2),富含脯氨酸,功能,:,1),有利于,Ab,与,Ag,的结合,2),有利于,Ab,与补体的结合,IgG,分子结合抗原前后的构象变化,Fab,段,Fc,段,C1q,结合位点被屏障,结合抗原之前,C,H1,C,H2,暴露的,C1q,结合位点,结合抗原之后,结构域,1,）,Ig,分子中由链内二硫键构成的致密立体球体,(V/C/H),。,2,）,b,-sheet,、,b,-barrel,、,immunoglobulin fold,。,3,）,CDRs(Hypervariable regions),、,FRs(Framework regions),。,免疫球蛋白的结构功能区,“Ig-like Domain (Ig,样结构域,)”,二、免疫球蛋白的其他成分,(1),化学本质：浆细胞分泌的多肽链,J CHAIN,IgA dimer,(2),存在：,IgM,（五聚体）, sIgA,（双体）,IgM,连接链,（,joining chain,，,J,链）,Secretory,piece,Joining,chain,SP,IgA dimer,分泌片,（,Secretory Piece,，,SP),(1),化学本质：,多肽链,(70kD),(2),来源：上皮细胞,J,chain,（,3,）作用：,a.,帮助,IgA,穿越黏膜,b.,保护,s IgA,抵抗蛋白酶的水解作用,Secretory IgA(sIgA),Plasma cells,IgA dimer,pIgR,SP,Epithelial Cell,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,Fc,pFc,F(ab),2,Fab,三、免疫球蛋白的水解片段,木瓜蛋白酶作用于,IgG,分子重链间二硫键的,N,端侧，将其裂解为,Fab,段和,Fc,段。胃蛋白酶则切在该二硫键之,C,端侧，产生,F(ab)2,和,pFc,段。,类,(Class):,重链,C,区抗原性,IgG,、,IgA,、,IgM,、,IgD,、,IgE,亚类,(Subclass):,重链抗原性,/,二硫键数目位置,IgG,1-4,型,(Type):,轻链,C,区抗原性,k,、,l,亚型,(Subtype):,轻链,C,区,aa,差异排列,l1,4,免疫球蛋白的异质性,免疫球蛋白的类型,血清型,免疫球蛋白既可结合抗原，又可作为抗原，激发机体的免疫应答，因而也是一类抗原物质。由于免疫球蛋白的遗传基础不同，不同的免疫球蛋白的抗原性也有差异。利用血清学方法测定和分析免疫球蛋白抗原性予以分类，称为免疫球蛋白的血清型。,1,、,同种型,(isotype),：,同一种属所有个体免疫球蛋白分子共同的抗原特异性标志。,由,C,区决定 。,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,3,C,H,4,V,L,C,L,Fab,Hinge region,Fc,2,、同种异型（,allotype),：,同一种属不同个体间免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原特异性标志。,由,链、链、链、链,C,区决定。,V,H,C,H,1,C,V,L,C,L,Fab,Hinge region,Fc,3,、独特型,(idiotype,Id),：,每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志。,由超变区特殊的氨基酸序列及其构型决定。,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,3,C,H,4,V,L,C,L,Fab,Hinge region,Fc,1,）与相应抗原特异性结合：,Fv,2,）激活补体：,3,）结合,FcR,：促吞噬,(opsonization),介导过敏,介导细胞毒,(ADCC),免疫调理,4,）穿过胎盘和粘膜,5,）调节免疫功能,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,3,C,H,4,V,L,C,L,Fab,Fc,COO,NH,3,+,免疫球蛋白的功能,免疫球蛋白的功能,a.,b.,免疫球蛋白的功能,Fc,R,A,ntibody-,D,ependent,C,ell-mediated,C,ytotoxicity,(,抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用,),Target cell,Ab,Effector cell,Target cell,表达,Fc,受体的组织细胞,(NK,、,M,、中性粒细胞）,通过识别抗体的,Fc,段直接杀伤被抗体包被的的靶细胞。,ADCC,免疫球蛋白的功能,抗体的抗病毒效应,NK,靶细胞,介导,ADCC,经典途径激,活补体,C1qr2s2,调理吞噬作用,免疫球蛋白的功能,IgG,IgM,IgA,IgE,IgD,各类免疫球蛋白的特点和功能,出生后,3,个月开始合成，,3,5,岁接近成人,含量最多 占血清总,Ig,的,75%,产生比较晚，是再次应答的主要抗体,半衰期最长,(,t,=23,天,),分布最广，血管外的主要抗体,唯一能通过胎盘的,Ig,激活补体,IgG1,3,（经典），,IgG4,（替代）,结合细胞,巨噬细胞，单核细胞,调理作用,NK,细胞，巨噬细胞,介导,ADCC,结合,SPA,协同凝集实验,特性：,IgG,IgG,功能：,抗感染的主要抗体,介导,II,III,型超敏反应,介导自身免疫,调理,介导,ADCC,固定补体,中和病毒和毒素,抗菌,抗病毒,抗外毒素,IgG,四个亚类的特点,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,血清含量,(,占,IgG,的百分比）,70 20 6 4,血清半衰期,(,天,) 23 23 7 23,通过胎盘,+ + + +,固定补体,+ + +,结合,Fc,受体,+, + +,特性,血清中含量第三,出现最早的,Ig,分布局限，主要在血管内,d),通过经典途径激活补体,e),分子量最大,f),凝集细菌,e),结合细胞,巨噬细胞,单核细胞,-,调理,NK,细胞,巨噬细胞,-,介导,ADCC,IgM,J,链,IgM,抗感染的先锋抗体,介导,II,III,型超敏反应,介导自身免疫,天然血型抗体,调理作用,(,最强,),激活补体,中和病毒和外毒素,凝集微生物,介导,ADCC,功能：,抗菌作用,最强,(500,1000IgG),抗病毒,抗外毒素,IgA,特点,:,血清中含量第二,(,血清型,IgA,，,serum IgA),主要以分泌型存在,(,外分泌液中）,.,(secretory IgA,sIgA),sIgA,通过初乳被动转移给新生儿,唾液,眼泪,乳汁,鼻黏膜,支气管分泌液,生殖 道分泌物,前列腺液,小肠黏膜分泌液,.,SC,J chain,IgA dimer,sIgA,功能：,粘膜局部抗感染的主要抗体,阻止病原体粘附于粘膜细胞,中和病毒和外毒素,伤寒沙门氏杆菌,奈瑟氏淋球菌,脊髓灰质炎病毒，流感病毒,抗菌作用,抗病毒作用,抗外毒素作用,IgD,分 子 的 结 构,IgD,分 子,*,在膜表面的表达是,B,细胞成熟的主要标志；,*膜型,IgD,作为,BCR,的组成部分，发挥信号传导作用,Structure of IgE molecule,IgE,特性,1),含量最少,2),与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的,Fc,R,受体结合,亲细胞性抗体,:,不与,Ag,结合，即可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的,FcR,牢固结合,3),不能激活补体,IgE,参与过敏反应,( I,型超敏反应,),结合肥大细胞,和嗜碱性粒细胞,导致各种生物活性的,介质的释放,嗜酸性粒细胞有,IgE,的,FcR,，,嗜酸性粒细胞通过此受体结合,包被在蠕虫上的,IgE,的,Fc,段，,最终杀死寄生虫,抗寄生虫感染,作用,人抗体分子的特性,抗体类别,IgG,IgA,IgM,IgD,IgE,重链类别,g,a,m,d,e,重链亚类,g1, g2, g3, g4,a1, a2,轻链类别,k,和,l,k,和,l,k,和,l,k,和,l,k,和,l,分子式,g,2,l,2,或,g,2,k,2,a,2,l,2,或,(a,2,l,2,),5,SCJ,a,2,k,2,或,(a,2,k,2,),5,SCJ,(m,2,l,2,),5,J,或,(m,2,k,2,),5,J,d,2,l,2,或,d,2,k,2,e,2,l,2,或,e,2,k,2,分子量,（,kDa,）,150,160,或,400,900,180,190,固定补体能力,+,0,+,0,0,血清浓度,(mg/100ml),1000,200,120,3,0.05,血清半衰期,(,天,),23,6,5,3,2,穿过胎盘,0,0,0,0,肥大细胞和嗜碱,性细胞脱颗粒,？,0,0,0,+,裂解细菌能力,+,+,+,?,?,抗病毒能力,+,+,+,?,?,2014-10-13,抗体的多样性及其产生机制,抗体的多样性,抗体的多样性产生的机制,抗体的类别转换,1897,年,Paul Ehrlich,提出,侧链学说,1930,年,Haurowitz,提出,直接模板学说,1941,年,Pauling,提出,间接模板学说,1955,年,Niels Jerne,提出,自然选择学说,1958,年,FM Burnet,提出,克隆选择学说,抗体生成理论的发展史,（一）抗体的多样性,抗体,/,免疫球蛋白的基因结构,抗体基因的重排,抗体基因的重排机制,抗体的多样性早期假说一：生殖细胞学说,抗体的多样性早期假说二：体细胞突变学说,The,genome contains many loci encoding antibody molecules.,B cell express one of these loci.,Different B cells express different loci.,There are a small number of antibody genes which undergo mutation as the B cell matures , thus giving rise to B cells expressing antibody of different specificity.,1971,年,Kabat,基因嵌入模型,利根川进：抗体的基因重排理论,免疫球蛋白的基因结构,In heavy chains, the V, D and J segments encode the variable domain while the C segment encodes the constant domain.,In light chains, the V and J segments encode the variable domain while the C segment encodes the constant domain.,抗体基因的重排,During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.,During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.,During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.,During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.,The kappa and lambda loci undergo similar rearrangement.,Since there are no D segments, there is a single V-J rearrangement.,In both heavy and light chain rearrangement, a number of J segments may,remain between the V(D) and C segments.,These are included in the RNA transcript but are spliced out during RNA,processing.,The final light chain mRNA contains one VJC unit.,Kuby Figure 5-4,Kuby Figure 5-4,抗体基因重排的机制,（,1,）重组信号序列,(recombination signal sequence, RSS),在,V,H,和,V,L,基因,3,端、,J,基因,5,端和,D,基因两端有高度保守的核苷酸序列，包括一个,7,核苷酸组成的七聚体,(heptamer),和一个,9,核苷酸组成的九聚体,(nonamer),，两者间隔,12,1,或,231,个核苷酸，称为,RSS,。,只有间隔,12,个碱基对和间隔,23,个碱基对的,RSS,之间发生重组，而间隔长度相等的,RSS,之间不发生重组，这就是,12/23,碱基对规律,(12/23 base pair rule),，也叫做,1+2,圈规律,(1+2 turn rule),。,Kuby Figure 5-3,Recombination signal sequences,- conserved sequences in regions just upstream or downstream of gene segments.,Consist of a conserved heptamer and nonamer with a 12 or 23 bp spacer.,Kuby Figure 5-3,The one-turn/two-turn rule (12/23 rule) - recombination occurs only,between a segment with a 12 bp spacer and a segment with a 23 bp spacer.,Recombination Signal Sequences Direct Recombination,Recombination Activating Genes,(encode RAG-1 and RAG-2),RAG-1 and RAG-2 mediate recognition of signal sequences and rearrangement of DNA segments.,Mice deficient in RAG-1 or RAG-2 are unable to rearrange heavy or light chain genes.,These mice have no mature B cells.,-,B cells will not mature if they cannot express a BCR.,（,2,）重组活化基因,Recombination Activating Genes,RAG-deficient mice also lack mature T cells.,- The T cell receptor is also encoded by loci containing gene segments that must be rearranged before the TCR can be expressed.,T cells will not mature if they cannot express a TCR.,SCID (severe combined immune deficency) mice also have a defect that affects rearrangement of BCR and TCR loci.,They also have no mature T or B cells.,Flow cytometry of normal vs. RAG-1 deficient mice:,Lymph node cells,FITC anti-CD19 (B cell marker) and PE anti-CD3 ( T cell marker),Normal mice,RAG-1 - deficient mice,How recombination in the V regions of antibody happens?,A G C T,T A T A,Terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt),An enzyme that randomly adds in nucleotides during joining of heavy,chain (NOT light chain) segments.,Read Kuby pages 113-115: Gene Segments Are Joined by Recombinases,Productive and nonproductive rearrangements,Joining of segments is not precise and may result in loss of the correct reading frame.,This may lead to introduction of stop codons - nonproductive,rearrangements.,RSS,RSS,RSS: recombination signal sequence,RAG: recombination activating gene,P-,核苷酸和,N-,核苷酸的加入,片段断端形成发夹结构,TC,AG,D,TA,AT,J,内切酶切开发夹结构产生,P-,核苷酸,T C G A,D,A T A T,J,TdT,酶加入,N-,核苷酸,T C G A C T C,D,G A G C G A T A T,J,通过,DNA,修复，断端连接，恢复双键结构,T C G A C T C G C T A T A,A G C T G A G C G A T A T,D,J,P N P,Two alleles are available at each locus (maternal and paternal).,A B cell expresses only one heavy and light chain allele.,- ALLELIC EXCLUSION,First,one allele of,the heavy chain,is rearranged.,If the rearrangement is successful, the other allele will not be rearranged.,If the rearrangement is nonproductive, the other allele will be rearranged.,Once a,heavy chain,allele rearrangement is,productive,light chain,rearrangement will,begin.,If rearrangement of both heavy chain alleles is nonproductive, the B cell will not mature further but will die of apoptosis within the bone marrow.,If a heavy chain allele is successfully rearranged, light chain rearrangement begins.,In humans, the kappa locus is rearranged first,.,Rearrangement occurs at one allele at a time and continues until a productive rearrangement occurs.,If,both kappa,alleles rearrange,nonproductively, rearrangement will,begin,at the,lambda,locus.,If all 4 alleles (both kappa alleles and both lambda alleles) rearrangements are nonproductive, the B cell will not mature but will instead die of apoptosis within the bone marrow.,If,either,both heavy chain alleles,or,all four light chain alleles, rearrange nonproductively, the B cell will not mature.,Allelic exclusion,Allelic Exclusion Ensures a Single Antigenic Specificity,组合多样性（,combinatorial diversity,）,连接多样性（,junctional diversity,）,体细胞高频突变（,somatic hypermutation,）,（二）抗体多样性产生机制,（,1,）,组合多样性,包括多副本的,V,基因、,D,基因、,J,基因及轻链重链等随机配对所形成的多样性,以,IgH,为例，按,50,个,V,H,基因、,30,个,D,基因、,6,个,J,H,基因、,40,个,V,基因、,5,个,J,基因计算，固有多样性可达：,50306405,1.810,6,（,2,）接头处的变化所产生的多样性,（,junctional diversity,）,这种变化不依赖于抗原，发生在,CDR3,，包括重组时编码端核苷酸的删除、添加、,P,核苷酸和,N,区的形成等,有些是在原有遗传信息基础上的变化，如接头处不准确连接所造成的编码框架的变化、,D,段阅读框架的变化、,P,核苷酸的形成等,有些与基因,DNA,中携带的信息无关，如,N,区的形成,估计,CDR3,的多样性可达,10,14,（,3,）体细胞高频突变,（,somatic hypermutation,）,亲和力成熟过程中的体细胞突变仅发生于重组后的可变区基因及其,3,端和,5,端,300,个左右碱基以内，而不见于恒定区，主要是点突变，也可能有插入和缺失，相当于“微调”,突变率比细胞中正常基因高数百万倍,发生在生发中心（,germinal center,）,H,V(D)J,基因片段的组合,V,D,J,组合多样性,65,27,6,11000,40,0,5,200,30,0,4,120,重链,/,轻链,11000(200+120),3.510,6,不准确连接,多样性增加,100,倍,核苷酸插入,多样性增加,300,倍,多样性预期,10,10,10,11,IGH,基因超突变,突变频率是其它基因的百万倍以上,抗体分子的多样性,（三）,抗体,类别转换,(class switch),抗体分子的类别转换,m,d,g3,V,J,g3,D,V,J,D,Primary transcript,V-D-J,m,mRNA,Primary transcript,V-D-J,g3,mRNA,m,d,Lost genes,IgM,maturation,IgG,IgG,IgM,primary antigen,secondary,antigen,antibody response,primary response,secondaryresponse,time,（,Class-switching,）,Thank you !,