-免疫检测课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫检测,更多医学精品尽在医学吧,常用免疫检测方法,待测的样品,定位、定性及定量研究,IHC,组织,(,细胞,),定性、定位,ELISA,血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液（分泌型蛋白）,定性、定量,WB,蛋白质样品,定性、半定量、（间接定位：胞浆胞核胞膜蛋白分离出来分别做,wb,）,IHC(,免疫组化,Immunohistochemistry),是融合了免疫学原理,(,抗原抗体特异性结合,),和组织学技术,(,组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等,),，通过化学反应使标记,抗体,的显色剂,(,荧光素、酶、金属离子、同位素,),显色，来对组织,(,细胞,),内抗原进行定位、定性及定量的研究,(,主要是定位,),。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。,WB (,蛋白质印迹,Western Blot),先进行,SDS-PAGE,，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原,-,抗体,-,标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。,Western Blot,步骤,2,原理,3,1,其他,3,3,原理,采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。,经过,PAGE,分离的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变（这个过程就是转膜）。,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,步骤,样品处理,凝胶电泳,样品印迹,免疫检测,结果分析,样品制备,组织、细胞、裂解液、蛋白酶抑制剂、,Loading Buffer,一般比例：新鲜组织,1:1020,裂解液，细胞,10,7,-1ml,裂解液，制备高浓度样品可酌情减少裂解液,裂解液成分：,ph7.27.5,的,tris-hcl,缓冲体系，有效裂解成分多为去污剂,NP-40, Triton X-100,，去氧胆酸钠,蛋白酶抑制剂：,PMSF,COCKTAIL,Loading Buffer,：甘油，,sds,，还原剂（,DTT,或,2-,巯基乙醇）,PAGE,：聚丙烯酰胺凝胶,四甲基乙二胺（,TEMED),丙烯酰胺,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺,过硫酸铵（,AP),激活作用,聚丙烯酰胺,共聚合,提供自由基,分离胶,分离胶母液,10%AP,TEMED,浓缩胶,浓缩胶母液,10%AP,TEMED,灌制分离胶,加入异丙醇,灌制浓缩胶,上样与电泳,Staking gel,Separating gel,免疫检测,封闭,一抗、二抗孵育,二抗与底物反应显色,曝光,免疫检测,封闭,：,为避免,NC,与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对,NC,上的潜在结合位点进行封闭处理。,5%,脱脂奶粉（脱脂奶粉,+PBST),Tween-20,的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,免疫检测,一抗、二抗孵育：,把,NC,膜放在培养皿中，加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育,1,小时。,倒掉一抗溶液，用,PBST,漂洗膜,4,次，每次,5min,。,加入用,PBST,配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育半小时。,倒掉二抗溶液，用,PBST,漂洗膜,4,次，每次,5min,。,免疫检测,二抗与底物反应显色（,ECL,显色）,分类,1,、放射自显影,2,、底物化学发光,ECL,3,、底物荧光,ECF 4,、底物,DAB,显色,发光液,A,和,B,分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（,HRP,）的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，在暗室内形成肉眼可见的化学光带，利用胶片感光原理，将结果记录下来。,更多医学精品尽在医学吧,