海洋生物酶及其应用

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,海洋生物酶及其应用,海洋生物代谢过程中的酶类在性质、功能上与陆地生有很多不同，因此从海洋生物中筛选提取有应用价值的酶类，就成为海洋生物资源开发的一个重要方面。而海洋生物特别是海洋微生物是一类种类繁多的可再生的遗传基因库，是获取新型酶的重要资源。海洋酶研究在世界范围内发展迅速，自,20,世纪,80,年代，国内外相继报道发现一些来自海洋的极端酶（微生物酶）可应用于开发新型工业用酶，然而由于海洋产酶微生物资源样品采集和开发的技术难度及风险性，长期以来，该领域的研究与发展缓慢，产业化进程受限。但近些年来，借助于海洋生物高新技术手段，海洋酶研究得到了快速发展,目前成为各国优先发展的新领域。现已发现的海洋微生物酶包括：蛋白酶、多糖酶、溶菌酶、脂肪酶、木聚糖酶、环糊精酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、氨单价氧化酶、唾液酸酶、氢化酶、谷氨酰胺酶、葡萄糖脱氢酶、甲基化酶,脂酶和,DNA,聚合酶等。,以下就一些与工业应用广泛的海洋生物酶的研究和开发做一简单介绍。,1.,蛋白酶（,protease;proteinase,）,蛋白水解酶,(proteolytic enzyme),是催化蛋白质中肽键水解的酶。它广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用弹性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物等,20,世纪的,20,年代初，,Nobou Kato,在农业生化杂志上发表一篇关于从海洋嗜冷杆菌获得一种新型海洋碱性蛋白酶的文章，引起学术界和酶制剂公司的高度重视,迄今为止研究开发的海洋生物蛋白酶产品已有几十个，并有多个申请了国际专利。,1.1,碱性蛋白酶,日本开发的一种碱性蛋白酶是从海洋共生菌发酵提取的，酶的,MW,为,31kD,作用的,pH5-11,，,最适,pH,为,10,，最适温度,20,。用于洗衣粉添加剂。美国从海洋船蛆共生菌（,ATCC39867,）发酵生产一种新型碱性蛋白酶,分子量,3.6KD,、,pI8.6,作用,pH4-12,、最适温度,50,。可在复杂试剂中保持稳定性，并有抗氧化的功能。已应用于洗衣粉和镜头清洁剂。,挪威将海洋微生物蛋白酶用于鱼类加工以生产蛋白胨和用于鱿鱼脱皮，中科院微生物所邱锈宝报道筛选到一种海洋中性蛋白酶，该酶最适作用温度为,50,，最 适,pH,为,8.0,。我们实验室在,2009-2010,年共分离出,6,株产中温蛋白酶菌株，并对其活性较高的两株进行了,16SRNA,鉴定，皆为弧菌属。对一株产碱性蛋白酶海洋弧菌（,Vibrio sp.pro1,）的发酵条件进行了单因素和正交试验，找到了最佳发酵条件，并对该酶的性质做了初步研究。,1.2,适冷蛋白酶,海洋生物特别是地球的南极和北极的海洋生物，由于长期生活在低温的环境中，适应这种极端环境而产生的海洋酶大多数具有低温催化和对热不稳定的特征，其活性的最适温度移向低温和在低温下，如,4,甚至,0,仍保持高比例的活性，据此被称为低温（适冷）酶。适冷酶大部分具有以下酶学特征：在低温下具有较高的催化效率。这是适冷酶的基本特征，目前报道的适冷酶均具有此特征。与同类中温酶相比，适冷酶在低温下的酶活性要高出数倍甚至十几倍。具有较低的最适催化温度。由于适冷酶对热敏感，其最适催化温度一般都比同类中温酶和高温酶明显低。具有较高的热敏感性。适冷酶只能在相对低的温度下保持高催化效率，温度稍高即很快失活，表现出很高的热敏感性。适冷酶的热变性温度均比同类中温酶低,15,20,。,我的学生徐国英在海洋所实验室保存的极地微生物资源库中通过酪蛋白平板法筛选到,106,株在低温条件（,4,）下具有蛋白酶活性的菌株，其中,8,株低温条件下蛋白酶酶活较高的极地菌分别属于假交替单胞菌属（,Pseudoalteromonas,）、科尔韦尔氏菌属（,Colwellia,）、希瓦氏菌属（,Shewanella,）、嗜冷杆菌属（,Psychrobacter,）。对低温蛋白酶活性较高的菌株,Pseudoalteromonas sp.QI-1,进行研究表明，菌株,QI-1,的最适生长和产酶温度均为,5,；最佳接种浓度为,1%,；发酵培养基的最适初始,pH,值和装样量的最适值分别为,pH 5.0pH 10.0,和,10%,；,20,NaCl,对菌体的生长和产酶最有利。,中国水产科学研究院黄海水产研究所发现了黄杆菌属一个新种和一种具有我国自主知识产权的新型低温碱性蛋白酶，并获得利用海洋微生物开发低温蛋白酶的授权发明专利，进而在此基础上开发出三项可应用于日化、轻纺工业等领域的系列产品，,阐明了利用海洋微生物代谢产物开发海洋低温生物酶的可行性；并完成了中试及中试产品的推广应用，为产业化奠定了基础。在海洋其他生物类群中也存有低温蛋白酶，如从海洋鱼类的内脏中提取的胃蛋白酶、胰蛋白酶活性较高且耐低温，可广泛地应用于水产品的加工。最近报道从南极磷虾的头中提取到一种耐低温蛋白酶。,2.,多糖水解酶（,Polysaccharides hydrolases,）,海洋多糖水解酶主要包括淀粉酶、甲壳质酶、琼胶酶、褐藻酸酶、卡拉胶酶等。酶的来源主要包括两类生物：一类是海洋动物，主要是无脊椎动物如紫贻贝、日本鲟、滨螺、石鳖、鲍、海兔等；另一类是海洋微生物，如产气单胞菌、假单胞菌、交替单胞菌、弧菌等。,多糖水解酶具有很多作用。如在,海藻原生质体制备方面的应用,：海藻细胞生理生化的研究，进行目的基因的导入、创造新品种或作为生物反应器生产所需的物质，细胞间的融合，改变体细胞的遗传物质，创造优良杂交品种等；,单细胞饵料生产中的应用,：酶解大型海藻，分离成单细胞，作为海洋养殖动物的饵料，具有营养全面、材料易得、生产加工简便等优点；,用于单糖和寡糖的制备,：琼胶经琼胶酶水解可以形成寡糖如三糖和四糖，然后经,-,半乳糖苷酶降解可形成单糖，琼胶寡糖在食品生产中有广泛的应用，如可用于饮料、面包及一些低热量食品的生产，另外，近来在日用化工领域又发现了琼胶寡糖的一些新用途，日本以琼胶寡糖为添加剂生产的化妆品对皮肤的保湿效果良好，对头发有很好的调理效果。目前普遍认为,6,个糖残基的几丁质寡糖具有抗肿瘤的作用，小分子的几丁质寡糖或单糖可提高机体免疫力，有活化肠道乳酸杆菌、双歧杆菌的作用。,2.1,几丁质酶,(chitinase),几丁质是乙酰氨基葡萄糖组成的均一多糖，几丁质酶类是降解几丁质的一组酶，包括几丁质酶、几丁质二糖酶、几丁质脱乙酰基酶等。海洋中筛选的多种菌分泌的几丁质酶可将几丁质降解成不同分子量的寡糖、二糖和单糖。低分子量几丁寡糖因具有多种生物活性，在艾滋病和癌症治疗以及口腔医学领域有着广泛应用，它们是目前几丁质工业中高附加值产品，但采用化学类控制几丁质降解，难度较大，且成本高，工业前景暗淡。专家们认为，较为理想的是采用现代生物技术获得高效表达几丁质酶的基因工程菌株来解决几丁质工业化生产的技术难关。,国家海洋局第三海洋海洋研究所生物工程重点实验室承担的国家自然科学基金和国家海洋局科技项目,“,海洋微生物几丁质酶的研究,”,，就是要寻找解决这一问题的途径。该项目研究人员，从厦门海域分离到具有很强的降解虾、蟹壳几丁质能力的海洋细菌一豚鼠气单胞菌，又从发酵上清液中检测出,4,种不同分子量的几丁质内切酶和外切酶，并完整地克隆了其中一个几丁质内切酶基因，进行了,DNA,序列测定，结果表明该基因编码有一个几丁结合区、一个催化区和一个功能未知的折叠区，在几丁结合区又包括了多个几丁结合亚区。现正着手研究这些不同亚区对于不同种类几丁质质的识别、附着机理。,在此基础上，研究人员筛选出一种完全由矿物元素和几丁质为原料高效培养基，从而可低成本大量制备包括几丁质内切酶和外切酶的工业化粗酶，这种工业化粗酶可有效地把几丁质降解为低分子量几丁寡糖，产品质量远高于目前的出口标准。豚鼠气单胞菌株与相关的发酵工艺将在专利申请后投放市场。为了制备附加值更高的单一几丁寡糖，该重点实验室有关人员还构建了能高效表达几丁质内切酶基因工程菌株，其他几丁质内、外切酶基因的克隆及异源表达工作还在进行，预期不久能提供高纯度的几丁质内、外切酶和单一的几丁寡糖。,2.2,琼胶酶,(agarase),琼胶主要是由琼胶素和琼胶酯两部分组成。琼胶酶主要水解琼胶部分,D-,半乳糖和,3.6-,内醚,-L-,半乳糖之间的,-L-(1,3),和,-D(1,4),糖苷键。琼胶酶的研究,50,年代就有报道，主要从海洋微生物中提取的胞外琼胶酶,可分为,-,琼胶酶和,-,琼胶酶两种类型，其中,-,琼胶酶主要来自假单胞菌属、单胞菌属和弧菌属，分子量范围大约在,20-360kD,。例如一种来自,Alte ro nonas agarlyticus(GJ1B,株,),的琼胶酶，经离子交换层析纯化和,SDS-PAGE,测定，其分子量是,180 kD,，而经亲和层析和正电电泳分析，其分子量是,360 kD,，说明此酶有两个亚基。后来研究证明该酶,pI5.3,可以维持活性的,pH,范围是,6.0-9.0,酶的最适,pH7.6,。,pH,低于,6.5,长时间处理、高于,45,或去掉钙离子均会使酶失活。,-,琼胶酶主要来自弧菌属、交替单胞菌属和海洋软体动物。例如从,Vibrio-sp.(AP2,株,),提取的一种,-,琼胶酶，其分子量是,20kD,，酶的,pI5.3,，作用,pH,范围，最适,pH5.5,，在低于,45,的条件下可以保持稳定。我们实验室分离出产琼胶酶菌株,NBRC102603,，利用正交试验法对其发酵条件进行优化，在其最优条件下，发酵液酶活达,56.89U/mL,，对酶纯化得到琼胶酶,A,和琼胶酶,B,，琼胶酶,A,纯化倍数为,17.51,倍,酶比活力为,881.82U/mg;,琼胶酶,B,纯化倍数为,16.64,倍,酶比活力为,838.32 U/mg.,纯化的琼胶酶经,SDS-PAGE,检测,显示为单一条带,其相对分子质量酶,A,为,83.6KDa,、酶,B,为,36.8KDa,。,2.3,淀粉酶,(amylase),淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称。按水解淀粉方式不同，把淀粉酶分为,-,淀粉酶、,-,淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶四类。目前淀粉酶已广泛地应用于食品、发酵、畜牧业生产、谷物加工、纺织、造纸、轻化工业、医药和临床分析等领域。我们从威海文登海域筛选获得,10,株产淀粉酶海洋菌，对其中一株,W11,鉴定为弧菌，该酶在,pH 7.5,左右活性最高，,pH,在,4.07.5,范围内体现较强的稳定性。最适酶解温度为,55,，酶液在,60,以下有较好的热稳定性；表观,Km,值为,0.973 mg/mL,。海洋菌,W11,所产的中温淀粉酶保存温度范围较广、适应,pH,作用的范围广及稳定性较强，将有着广泛的应用潜力。,2.4,卡拉胶酶,(carrgeenase),卡拉胶是不均一多糖，多糖的相对含量和成分随海藻来源的不同而变化，目前已发现卡拉胶有,13,种类型。如,k-,卡拉胶、,-,卡拉胶、,-,卡拉胶等。其中,k-,卡拉胶是由,D-,半乳糖、,3-.2-,内醚半乳糖和硫酸酯组成。,k-,卡拉胶酶可以水解,k-,卡拉胶的,-1,，,4,糖苷键。目前已从交替单胞菌属等分离到卡拉胶酶。,2.5,褐藻酸酶,(algalase),褐藻酸存在于海带等褐藻细胞间质中，化学组成是聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸或是古罗糖醛酸和甘露糖醛酸交替连接，褐藻酸酶可水解糖残基间的,1,，,4-,糖苷键。褐藻酸酶主要来源于微生物和食藻的海洋软体动物如海螺、鲍鱼等。例 如从杆菌属提取