可见紫外分光光度法课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章,紫外-可见分光光度法,(UV-vis Spectrophotometry),内容提要,第一节 分光光度法基本原理,一、透光率和吸光度,二、物质的吸收光谱,三、Lambert-Beer定律,第二节 可见分光光度法,第三节 提高测量灵敏度和准确度的方法,一、分光光度法的误差,二、提高测量灵敏度和准确度的方法,基本要求,掌握Lambert-Berr定律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数等基本概念。,熟悉可见分光光度法的定量测定方法,标准曲线法。,熟悉吸收光谱的意义。,了解提高测量灵敏度和准确度的方法。,分光光度法,根据,物质的,吸收光谱,及光的,吸收定律,，对物质进行,定性,、,定量,分析的一种方法。,分光光度法特点,灵敏度高 检测限10,-5,10,-6,mol.L,-1,适于,微量组分,测定,准确度高 相对误差25%,操作简便，测定快速。显色-测定,应用广泛,第一节 分光光度法基本原理,一、透光率和吸光度,二、物质的吸收光谱,三、Lambert-Beer定律,第一节,分光光度法,基本原理,入射光,I,0,吸收,I,a,透射,I,t,I,0,=,I,a,+,I,t,+,I,r,I,0,=,I,a,+,I,t,一,、,透光率(,T),和吸光度(,A),第一节,分光光度法,基本原理,透光率,(transmittance),T,=,I,t,/,I,0,吸光度,(absorbance),一,、,透光率(,T),和吸光度(,A),T,=10,-A,第一节,分光光度法,基本原理,物质对光的吸收具有选择性，只有当光子的能量(,h,)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时才能被吸收。,M(基态)+,h,M*(激发态),物质对光的选择性吸收,Why Absorption Occurs?,Energy level:,E,0,E,1,E,1,E,1,Ground level,electronic Excited level,molecular vibration,molecular rotation,UV/Vis,infrared,互补（色）光,complementary colors,第一节分光光度法基本原理,若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补色,。,用不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的溶液，分别测定其对不同波长的吸光度，以波长,为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，即为,吸收光谱,(absorption spectra)，或称,吸收曲线,。,(邻二氮菲)合铁(II)的吸收光谱,二物质的吸收光谱,max,峰形曲线，具有最大吸收波长,max。在此波长下，溶液吸光度最大。,浓度越大，吸收峰越高(A越大)。,同一物质不同浓度的溶液，吸收光谱基本形状相同。最大吸收波长,max位置不变。,吸收光谱的特点:,同一物质的同种溶液,max不随物质的浓度而变。,max与溶剂有关。,不同物质,max不同,max是定性分析的依据（与吸光系数结合）。,定量,分析时，用,max的单色光作入射光，灵敏度最高。,最大吸收波长,max重要参数,当入射光,波长,、,强度,、,溶剂,、,吸光物质,的种类和溶液,温度,一定时，,A,与,液层厚度,b,和溶液,浓度,c,有关：,c,一定,A,b,Lambert,b,一定,A,c,Beer,A,=,bc,三、,Lambert,Beer,定律,三、,Lambert-Beer定律,A=,bc,溶液厚度,b,单位:cm,浓度,c,，单位mol,L,-1,摩尔吸光系数,，单位L,mol,-1,cm,-1,若用质量浓度,代替,c,A,=,ab,质量浓度,单位:g,L,-1,质量吸光系数,a,单位:L,g,-1,cm,-1,吸光系数,重要参数,与入射光的波长、物质的性质、溶剂和温度有关；与浓度无关；,10,3,，可用于定量测定；,与,max,一起可以作为定性的依据。,A,=,bc,A,ab,=,aM,T,=10,-,bc,Lambertbeer定律,适用条件,Preconditions,:,Parallel&Monochromatic incident light,Homogeneous media,No emission,scattering or photo-chemical reactions,low concentration(c0.001mol,L,-1,),A,1,=,e,1,bc,1,A,2,=,e,2,bc,2,A,=,A,1,+,A,2,=,e,1,bc,1,+,e,2,bc,2,吸光度的加合性,Addition of,A,例：测试酶与腺苷酸(AMP)混合体系的吸光度如下,A,(280nm)=0.46，,A,(260nm)=0.58，试计算每一组分的浓度。,已知：酶的,(280nm)=2.96,10,4,L,mol,-1,cm,-1,(260nm)=1.52,10,4,L,mol,-1,cm,-1,AMP的,(280nm)=2.4,10,3,L,mol,-1,cm,-1,(260nm)=1.5,10,4,L,mol,-1,cm,-1,吸收池厚度为1.00cm。,A,1,=,e,1,bc,1,A,2,=,e,2,bc,2,A=A,1,+A,2,=,e,1,bc,1,+,e,2,bc,2,A,(280nm)=0.46=,(280nm),bc,A,(260nm)=0.58=,(260nm),bc,第二节 可见分光光度法,1.标准曲线法,配制系列浓度标准溶液；,测定系列标准溶液吸光度,A,，作吸光度,A,对溶液浓度,c,的图，得过坐标原点的直线-,标准曲线,；,在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液浓度。,I,参比溶液的作用：扣除一切不来源于,目标产物,的光吸收。,如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。,常用参比溶液：,溶剂空白,试剂空白,试样空白,参比,（空白）溶液 blank,常用参比溶液,成份,溶剂,显色剂,试 样,其他,适用范围,溶剂空白,显色剂、试样均无吸收,试剂空白,试样无吸收显色剂有吸收,试样空白,显色剂无吸收，试样有吸收,第三节 提高测量灵敏度和 准确度的方法,自学 重点看：,分光光度法的误差来源,显色剂的选择,测定条件的选择,本章小结,基本概念：吸光度，透光率，吸光系数，最大吸收波长，显色剂，参比溶液吸收曲线，标准曲线,基本计算：,A,=,bc,测定方法：标准曲线法,判断题,1.分光光度法灵敏度高，特别适用于常量组分的测定。（）,2.光照射有色溶液时，,A,与,T,的关系为lg,T,=,A,。（）,3.当某一波长的单色光照射某溶液时，若T=100%，说明该溶液对此波长的光无吸收。（）,4.符合Lambert-Beer定律的某有色溶液，其他条件一定，浓度越大，吸光度越大。（）,5.如果吸收池的厚度增加1倍，则溶液的透光率将减少1倍。（）,6.吸光系数与入射光波长、溶剂及溶液浓度有关。（）,7.,愈大，表明溶液对入射光愈易吸收，测定的灵敏度愈高。（）,8.一般,值在10,3,以上即可进行分光光度法测定。（）,9.吸收曲线的基本形状与溶液浓度无关。（）,二、选择题,1关于Lambert-Beer定律，下述正确的是 A.该定律仅适用于可见光区的单色光。,B.该定律仅适用于有色物质的含量测定。,C.其他条件不变，溶液浓度改变，吸光度和吸光系数都会改变。,D.其他条件不变，入射光波长改变，吸光度和吸光系数都会改变。,2在分光光度法中吸光度A可表示为 A.,I,t,/,I,0,B.1/,T,C.lg,T,D.lg(,I,0,/,I,t,),3,下列各式哪些不符合L-B定律,A.T=10,bc,B.1/T=10,bc,C.T=-lgA D.lg(1/T)=,bc,4在可见分光光度法中，影响吸光系数的因素是 （）,A.入射光波长 B.溶液浓度,C.溶液厚度 D.入射光强度,5下面说法正确的是,A.吸收光谱的基本形状与溶液的浓度无关,B.吸收光谱与物质的特性无关,C.浓度愈大，吸光系数愈大,D.其他因素一定时，吸光度值与测定波长成正比,E.波长一定时，测定不同浓度溶液的A值可绘制吸收光谱曲线,6符合Beer定律的某有色物质溶液，当其浓度改变时，其吸收光谱曲线上的最大吸收峰的位置将 （）,A.向短波方向移动,B.向长波方向移动,C.不改变，但峰高度改变,D.不改变，峰高度也不变,E.改变，但峰高度不变,7分光光度法中使用试剂空白作对照的目的是：,A.用以消除仪器测量误差,B.用以消除溶液偏离Beer定律引起的误差,C.用以消除单色光纯度差引起的误差,D.用以消除溶剂、显色剂等物质对入射光的吸收,8下面有关显色剂的叙述正确的是 （）,A.能与被测物质生成稳定的有色物质,B.必须是本身有色的物质,C.必须是本身无色的物质,D.与被测物质的颜色互补,E.在测定波长处，应有明显吸收,