15酵母基因工程(精品)

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,第十五章 酵母基因工程,五、,酵母菌的表达系统,第十五章,酵母基因工程,三、,酵母菌的载体系统,二、,酵母菌的宿主系统,一、,酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,六、 利用重组,酵母生产乙肝疫苗,四、,酵母菌的转化系统,一、,酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,第十五章,酵母基因工程,1,、 酵母菌的分类学特征,酵母菌（,Yeast,）,是一群以,芽殖,或,裂殖,方式进行,无性繁殖,的单细,胞,真核生物,，分属于,子囊菌纲,（子囊酵母菌）、,担子菌纲,（担子酵母,菌）、,半知菌类,（,半知酵母菌,），共由,56,个属和,500,多个种组成。如,果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最,成熟的真核生物表达系统。,一、,酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,2,、酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国,FDA,认定为安全的,基因工程受体系统（,Generally Recognized As Safe GRAS）,酵母菌是最简单的真核模式生物,第十五章,酵母基因工程,二、,酵母菌的宿主系统,2,、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,3,、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,4,、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,1,、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,第十五章,酵母基因工程,1,、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：,酵母属,如,酿酒酵母,（,Saccharomyces,cerevisiae,）,克鲁维酵母属,如,乳酸克鲁维酵母,（,Kluyveromyces,lactis,）,毕赤酵母属,如,巴斯德毕赤酵母,（,Pichia,pastoris,）,裂殖酵母属,如,非洲酒裂殖酵母,（,Schizosaccharomyces,pombe,）,汉逊酵母属,如,多态汉逊酵母,（,Hansenula,polymorpha,）,其中,酿酒酵母,的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但,巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,2,、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型,ssc,1,改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的,ATP,酶,ssc,2,提高重组蛋白表达 转录后加工,rgr,1,提高重组蛋白表达 转录水平,ose,1,提高重组蛋白表达 转录水平,ssc,11,改善重组蛋白分泌 羧肽酶,Y,rho,-,提高重组蛋白表达 转录水平,突变类型,生物效应,作用位点,3,、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn,甘露糖生物合成缺陷型,alg,天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och,外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由,糖基核心,和,外侧糖,链,两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统，但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制，呈,超糖基化倾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,4,、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,（,1,）泛素、介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,HOOC,Ubiquitin,76,aa,ubiquitin,ligase,E3,Lys,ubiquitin,ligase,E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,（,2,）酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因：,UBI,1,编码,泛素-羧基延伸蛋白52,（,CEP52）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,2,编码,泛素-羧基延伸蛋白52,（,CEP52）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,3,编码,泛素-羧基延伸蛋白76,（,CEP76）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,4,编码,泛素五聚体,对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因：,UBC,1、,UBC,2、,UBC,3、,UBC,4、,UBC,5、,UBC,6、,UBC,7,（,3,）泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中，泛素主要由,UBI,4,基因表达，,UBI,4,-,突变株能,UBI,4缺陷型：,正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，,因此,UBI,4,缺陷突变株是外源基因表达理想的受体,UBA,1缺陷型：,UBA,1,编码,泛素激活酶,E1，,UBA,1突变株是致死性的，但其等位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解,Ubc4,-,ubc5,双突变型：,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,三、,酵母菌的载体系统,酵母菌克隆表达质粒的构建,酵母菌中的野生型质粒,第十五章,酵母基因工程,酵母菌中的野生型质粒,酿酒酵母中的2,m,环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有,2,m,双链,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,环状质粒，拷贝数达,50,至,100,个。,IRs,反向重复序列，600,bp,，,重组,FLP,编码产物驱动,IRs,的同源重组,REP,编码产物控制质粒的稳定性,STB,REP,的结合位点,接合酵母属中的,pSR1,和,pSB1,，,以及,克鲁维酵母属中的,pKD1,等均与,2,m,质,粒类似。,酵母菌中的野生型质粒,乳酸克鲁维酵母中的线,状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同,pGKL1 8.9 kb,DNA,聚合酶,毒素蛋白,ab,免疫蛋白,g,亚基,的双链线状质粒,pGKL1,和,pGKL1,拷贝数为,50-100,个，分别携带,K1,K2,两种能使多种酵母菌致死的毒,反向重复序列,素蛋白编码基因（,a b g,），,同时含有毒素蛋白抗性基因。,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有,ARS,的,YRp,质粒的构建,ARS,为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5,kb，,染色体上每30-40,kb,就有一个,ARS,元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括,复制子,、,标,记基因,、提供克隆位点的大肠杆菌,质粒,DNA,。,以,ARS,为复制子的质粒称为,YRp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达,200,个，但培养几代,以,2,m,质粒上的复制元件为复制子的质粒称为,YEp,后，质粒的丢失率高达,50%-70%,，主要是由于分配不均匀所致。,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有,CEN,的,YCp,质粒的构建,CEN,为酵母菌染色体,DNA,上与染色体均匀分配有关的序列,将,CEN,DNA,插入含,ARS,的质粒中，获得的新载体称为,YCp,YCp,质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有,1 - 5,个,含有,TEL,的,YAC,质粒的构建,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有酵母菌染色体,DNA,同源序列的,YIp,质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体,DNA,特定序列和标记基因，,构建出来的质粒称为,Yip,。,目的基因表达盒通常插在染色体,DNA,特定,序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体,DNA,区域,四、,酵母菌的转化系统,2,、,转化质粒在酵母细胞中的命运,1,、,酵母菌的转化程序,3,、,用于转化子筛选的标记基因,第十五章,酵母基因工程,1,、酵母菌的转化程序,（,1,）酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化,法，在,Ca,2+,和,PEG,的存在下，转化细胞可达原生质体总数的,1-2%,。,但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约,原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳,多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的,25-33%,1,、酵母菌的转化程序,（,2,）碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如,Li,+,等）、,PEG、,热休克,处理后，也可高效吸收质粒,DNA，,而且具有下列特性：,吸收线型,DNA,的能力明显大于环状,DNA，,两者相差80倍,共转化现象极为罕见,1,、酵母菌的转化程序,（,3,）酵母菌电击转化法,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒,DNA，,但在此过程中应避免使用,PEG，,它对受电击的细胞具有较很大的负,作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件,适用范围广,，而且转化率可高达,10,5,/,m,g,DNA。,2,、转化质粒在酵母细胞中的命运,单双链,DNA,均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍,含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制,不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组极为有利,克隆在,YIp,整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体,DNA,的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总,数的,50-80%,3,、用于转化子筛选的标记基因,用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有,营养缺陷型互补基因,和,显性基因,两大类,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：,LEU,、,TRP,、,HIS,、,LYS,、,URA,、,ADE,但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难,营养缺陷型的互补基因,3,、用于转化子筛选的标记基因,显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,aph,氨基糖苷转移酶 抗,G418,cat,氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素,dhfr,二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1,铜离子螯合物 耐受铜离子,suc2,蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖,ilv2,乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,五、,酵母菌的表达系统,2,、外源基因在酵母菌中表达的限制因素,1,、酵母菌启动子的可控性,3,、酵母菌表达系统的选择,第十五章,酵母基因工程,1,、酵母菌启动子的可控性,pho4,TS,-PHO5,启动子：,酿酒酵母,PHO5,启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开,PHO4,基因编码产物是,PHO5,启动子的正调控因子,因此，装在,pho4,TS,-PHO5,启动子下游的外源基因在,35,时关闭,23,诱导表达,（,1,）温度控制型启动子,PHO4,温度敏感型突变基因,pho4,TS,的编码产物在35,时失活,1,、酵母菌启动子的可控性,a,a,型启动子：,酿酒酵母有,a,和,a,两种单倍体，分别由,MAT,a,和,MAT,a,两个等位基因决定。,a,1,因子决定,a,细胞特征表达,a,2,因子阻遏,a,细胞,特征表达,a1-a2,阻遏,a,细胞特征表达,编码,a,2,因子的基因突变型,hml,a,2-102,能产生,a,2,变体,，它能灭活,a1,，,同时阻遏,a,型,温度控制型启动子,a,型启动子,hml,a,2-102,MATa,a1,Sir3-8,TS,a,型启动子,受体细胞基因组 重组质粒,a,型启动子,hml,a,2-102,MATa,a1,Sir3-8,TS,a,型启动子,a,2,a,1,25,35,1,、酵母菌启动子的可控性,酿酒酵母,（,2,）超诱导型启动子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导时，,GAL4,高效表达，,GAL1,、,GAL1,、,GAL10,超高效表达,GAL10,Promoter,的半乳糖,利用酶系,由,GAL1,GAL7,和,GAL10,基因编码,2,、外源基因在酵母菌中表达的限制因素,外源基因稳态,mRNA,的浓度,外源基因,mRNA,的翻译活性,酵母菌对密码子的偏爱性,在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶,GAPDH,、,磷酸甘油激酶,PKG,、,乙醇脱氢酶,ADH,）,中,96%,以上的氨基酸是由,25,个密码子编码的,3,、酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油,醛-3-磷酸脱氢酶基因,GAPDH,、,磷酸甘油激酶基因,PKG,、,乙醇脱氢,酿酒酵母表达系统,酶基因,ADH,所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。,酿酒酵母表达系统的最大问题在于其,超糖基化,能力，往往使得,有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能,大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。,3,、酵母菌表达系统的选择,乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒,pKD1,已被广泛用作重组异源,蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也,乳酸克鲁维酵母表达系统,能稳定遗传40代以上。,乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优,于酿酒酵母表达系统。,3,、酵母菌表达系统的选择,巴斯德毕赤酵母是一种,甲基营养菌,，能在低廉的甲醇培养基中生,巴斯德毕赤酵母表达系统,长，,甲醇,可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长,迅速、乙醇氧化酶基因,AOX,1,所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯,德毕赤酵母表达系统的三大优势。,由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因,的表达序列一般整合入受体的染色体,DNA,上。在此情况下，外源基因,具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种,3,、酵母菌表达系统的选择,多型汉逊酵母也是一种,甲基营养菌,。其自主复制序列,HARS,已被,多型汉逊酵母表达系统,克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载,体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，,HARS,质粒,能高频自发地整合在受体的染色体,DNA,上，甚至可以连续整合,100,多,目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获,个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。,得成功表达。,六、 利用重组,酵母生产乙肝疫苗,由,乙型肝炎病毒,（,HBV,）,感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重,的传染病，每年约有,200万,病人死亡，并有,3亿,人成为,HBV,携带者，其,中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒,还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒,感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其,广泛应用提供了可靠的保证。,第十五章,酵母基因工程,六、 利用重组,酵母生产乙肝疫苗,2,、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,1,、乙型肝炎病毒的结构与性质,3,、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,1,、乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒是一种蛋白包裹型的,双链,DNA,病毒,，具有感染力的病毒,乙型肝炎病毒的结构,颗粒呈,球面,状，直径为,42,nm,，,基因组仅为,3.2,kb,。,病毒颗粒的主要,结构蛋白是病毒的,表面抗原,多肽（,HBsAg,）或,S,多肽，它具有糖基化,和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括,核心抗原,（,HBcAg,）、,除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的,22,病毒,DNA,聚合酶,、,微量病毒蛋白,。,nm,的,空壳亚病毒颗粒，,其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的,1000,倍,。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：,S,、,M,、,L,多肽,。,1,、乙型肝炎病毒的结构与性质,乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因,ATG,ATG,ATG,TAA,108,aa,55,aa,226,aa,preS1,preS2,S,S,多肽,226,aa,M,多肽,281,aa,L,多肽,399,aa,1,、乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫,传统乙肝疫苗的制备,苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的,疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。,2,、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组,HBsAg,，,主要工作包括,将,S,多肽的编码置于,ADH1,启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活,性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平,均颗粒直径为 22,nm，,其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中,的病毒颗粒相同。,目前，由酿酒酵母生产的重组,HBsAg,颗粒已作为乙肝疫苗商品化,重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。,进一步的研究表明，,M,多肽和,L,多肽对,S,型疫苗具有显著的增效作,用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对,S,抗,原缺乏响应的人群的免疫反应。,3,、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建,PARS2,Bgl,II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,Bgl,II,pBSAG151,11 kb,Bgl,II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his,+,的转化子,重组分子,转化,his,-,的受体细胞,染色体,DNA,3,、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,重组巴斯德毕赤酵母的性能,由于巴斯德毕赤酵母染色体,DNA,上还拥有第二个乙醇氧化酶基因,AOX2,，,所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。,重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲,醇诱导,HBsAg,表达，最终,S,蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的,3%,在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个,240,L,的发酵罐,中培养，最终可获得,90克,22,nm,的,HBsAg,颗粒，足够制成,900万份,乙肝,疫苗。,