高中生物-BCA法测定蛋白质浓度课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,测定蛋白质浓度,BCA,法,测定蛋白质浓度BCA法,学习掌握,BCA,法测定蛋白质浓度的基本原理。,【,实验目的,】,【实验目的】,【,实验原理,】,BCA(bicinchoninic acid,，二辛可酸,),法测定蛋白质的原理与,Lowery,法相似，即在碱性条件下蛋白质与二价铜离子,Cu2+,络合，并将其还原成一价铜离子,Cu1+,。一价铜离子和,BCA,试剂反应,使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，在,562 nm,有强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此可用于蛋白质浓度测定。,BCA,测定蛋白质的范围是,20g/ml200g/ml,，微量,BCA,测定范围在,0.5g/ml 10g/ml,。,【实验原理】BCA(bicinchoninic acid，,Folin-,酚试剂法,(Lowry,法,),测定蛋白质浓度,蛋白质在碱性溶液中其肽键与,Cu2+,螯合，形成蛋白质一铜复合物，,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，,在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并,测定样品中蛋白质的浓度。,Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 蛋白质在,【,实验器材与试剂,】,1,器材,（,1,）仪器：分光光度计；恒温水浴箱；枪式移液管。,（,2,）玻璃仪器：试管,13,支，吸管,2ml 1,支、,O.1ml 3,支。,【实验器材与试剂】1器材,高中生物-BCA法测定蛋白质浓度课件,高中生物-BCA法测定蛋白质浓度课件,高中生物-BCA法测定蛋白质浓度课件,2,试剂,（,1,）试剂,A,：,1,BCA,二钠盐,2,无水碳酸钠,0.16%,酒石酸钠,0.4,氢氧化钠,0.95,碳酸氢钠,混合，调,pH,值至,11.25,。,（,2,）试剂,B,：,40g/L,硫酸铜。,（,3,）,BCA,工作液：试剂,A 100ml,试剂,B 2ml,，混合即成。市面有,BCA,法试剂盒销售,4,）蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用生理盐水配制成,1.5mg/ml,的蛋白质标准液。,（,5,）待测样品。,2试剂（1）试剂A：1BCA二钠盐,【,实验步骤,】,1,取试管,13,支，编号（除空白管只做,1,管外，其它各号测定管均重复做两管），,按下表操作并记录：,BCA,法测定蛋白质含量,管号,试剂,(l),空白管,标准管,测定管,2,12,22,32,42,52,蛋白质标准液,(1.5mg/ml),20,40,60,80,100,双蒸水,100,80,60,40,20,待测样品,100,BCA,工作液,(ml),2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,混匀，,37,保温,30min,，比色测定,光吸收值,(=562nm),【实验步骤】1取试管13支，编号（除空白管只做1管外，其它,2,以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。,3,用测定管平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量，计算求出该待测血清蛋白质的含量,(g/L),。,4,从标准管中选择一管与测定管光吸收值相接近者，按比色法计算公式计算求出该待测血清的蛋白质浓度,(g/L),。,2以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。,【,思考题,】,试比较,BCA,法与双缩脲法、,Lowery,法的异同。,为什么,BCA,法常常用于科研？其有哪些优势？,【思考题】,【,实验原理,】,分子中含有两个或两个以上肽键,(-CONH-),的化合物，,在碱性溶液中能与硫酸铜中,Cu2+,反应生成紫红色化合物，,此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键，具有双缩脲反应，,且在一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比,，因此可以用光吸收法测定样品中蛋白质的含量。,双缩脲法测定血清蛋白质含量,【实验原理】双缩脲法测定血清蛋白质含量,此方法被科研工作者广泛选用，其特点：,1.,操作简便，快速，比经典的,Lowry,法快,4,倍；,2.,灵敏度高，最小检测量达,0.5g,；,3.,准确，试剂稳定性好，在,20g/ml2000g/ml,浓度范围内有良好的线性关系，检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法；,4.,经济实用，测定可在微板孔中进行（待测样品体积为,1l-20l,），可大大节约样品和试剂用量；,5.,抗干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质影响。,此方法被科研工作者广泛选用，其特点：,高中生物-BCA法测定蛋白质浓度课件,方法,基本原理,灵敏度,（,mg/ml,）,干扰程度,和主要干扰物,蛋白质,种类造成误差,快速性,复杂性,凯氏定氮法,(Kjedahl,法,),将蛋白质蒸馏转化为氨,再用酸吸收后滴定,计算其含量,0.21.0,低，非蛋白蛋,小,慢,复杂,双缩脲法,(Biuret,法,),多肽链与碱性酮离子生成紫红色复合物,120,中等，硫酸铵；,Tris,缓冲液；某些氨基酸,小,快速,简易,Folin-,酚试剂法,(Lowry,法,),磷钼酸,-,磷钨酸被酪氨酸和苯丙氨酸还原生成蓝色复合物,0.0010.005,严重,硫酸铵；,Tris,缓冲液；甘氨酸；各种硫醇,大,较复杂,紫外分光光度法,(UV,法,),蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基在,280nm,有光吸收,0.010.1,较严重，各种嘌呤、嘧啶、核苷酸,大,快速,简单,考马斯亮蓝法,（,Bradford,）,蛋白质与考马斯亮蓝结合最大光吸收,465nm,变为,595nm,0.0010.005,低，强碱性缓冲液；,TritonX-100,；,SDS,大,快速,简单,BCA,法,(bicinchonininc acid,法,),在碱性条件下，,BCA,与蛋白质结合，将,Cu,2+,还原为,Cu,+,0.020.2,0.00050.01,(,微量法,),低，抗干扰能力较强,小,快速,简单,方法基本原理灵敏度干扰程度蛋白质快速性凯氏定氮法将蛋白质蒸馏,