第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗,第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗,1,（优选）第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗,（优选）第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗,“the specificity in development and control of the immune system” and the the discovery of “the principle for production of monoclonal antibodies”,“the specificity in developmen,Natural-Selection Theory of antibody formation,（抗体形成过程中的自然选择学说）,1955,年,Somatic Generation of immune Recognition,（免疫系统的自我建立学说）,1971,年,Network Theory,（免疫系统的相对稳态学说）,1974,年,Natural-Selection Theory of an,免疫相关疾病和生物学过程,自身免疫疾病：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮,器官移植：免疫排斥,过敏：有机体对某些药物或外界刺激的感受性不正常地增高的现象；过分敏感,疫苗：基因重组乙肝疫苗,免疫相关疾病和生物学过程,T cell在胸腺中经历阳性和阴性筛选过程,T cell在胸腺中经历阳性和阴性筛选过程,第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗课件,1,、多克隆抗体（,polyclonal antibody, pAb,）：,用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个,B,细胞,克隆,产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。,2,、单克隆抗体（,monoclonal antibodies, mAb,）：,由一个识别一种抗原表位的,B,细胞,克隆,产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。,与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。,1、多克隆抗体（polyclonal antibody, p,每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.,包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。,2、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：,HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系,HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系,前5天进行,预先腹腔注射pristane（降植烷）,但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；,包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等,b、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。,前5天进行,预先腹腔注射pristane（降植烷）,h、分装96孔细胞培养板，每孔0.,经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。,A、杂交瘤细胞的染色体分析,（genetic engineering antibody),对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-56；,h、分装96孔细胞培养板，每孔0.,A（Aminopterin）：氨基喋呤；,HGPRT酶与TK酶：,McAb and PcAb,每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0,杂交瘤技术的诞生,1975,年,8,月,7,日，,Kohler,和,Milstein,在英国自然杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（,Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity,）,1984,年度荣获诺贝尔生理学和医学奖,杂交瘤技术的诞生,一、 杂交瘤技术的基本原理,聚乙二醇（,PEG,）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细,胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,HAT,培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤,细胞系,单克隆抗体生成：接种杂交瘤,细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体,一、 杂交瘤技术的基本原理 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂,抗体种类：,第一代抗体 多克隆抗体,（,polyclonal antibody),第二代抗体 单克隆抗体,（,monoclonal antibody),第三代抗体 基因工程抗体,（,genetic engineering antibody),抗体种类：,B,淋巴细胞,:,寿命短,分泌特异系性抗体,骨髓瘤细胞：寿命长,杂交瘤细胞：寿命长，单,隆抗体,B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体,流,程,流,不产生,Ig,的重链和轻链,HGPRT-,（次黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）,;TK-,（胸腺嘧啶核苷激酶）,与提供淋巴细胞的动物品系相同,（一）小鼠骨髓瘤细胞,小鼠骨髓瘤细胞系均来源于,BALB/c,小鼠，大鼠骨髓瘤细胞都来源于,LOU/c,大鼠,建立的骨髓瘤细胞系,: SP2/0-Ag14,，,X63-Ag8.653,NSO/1,不产生Ig的重链和轻链（一）小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞系,1108的淋巴细胞 无菌手术,HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系,（3）单抗与相应抗原的反应性测定,二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存,20-37静置10分钟。,McAb and PcAb,NSO/1,（二）单克隆抗体的纯化,（1）单克隆性的确定,小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠,通常每只小鼠1108-2.,FACS法（fluorescence activated cell sorter）,h、分装96孔细胞培养板，每孔0.,叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径（D途径）,细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）,防止非分泌细胞的过度生长,ABC-ELISA试验,亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。,最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题,（一）单克隆抗体的产生,动 物：,BALB/,c,小鼠,4,8,周龄,20g,25g,体重,（二）免疫脾细胞,1108的淋巴细胞 无菌手术（二）免疫脾细胞,细胞性抗原：,（,1,2,）,10,7,/,只，不加佐剂，,2,3,周重复一次,可溶性抗原：,首次，完全福氏佐剂,+100,微克抗原，,3,6,周,100,200,微克抗原，融合前,3,天，加强免疫,体内免疫法,-,免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了,免疫小鼠,细胞性抗原：免疫小鼠,。,淋巴细胞,。淋巴细胞,。,浆细胞,。浆细胞,。,抗原接种,。抗原接种,免疫原特性,抗原量,接种次数,间隔时间,单抗的特性,抗体滴度,亲和性,免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等）,10,6,-10,7,个细胞或,1-10ug,2-4,2-4,周,高,中等至强,免疫原性中等,10-100ug,2-4,2-4,周,中等或高,中等或强,免疫原性弱,A.20-400ug,2-4,随后,2-3,每月,2-3,月,中等,强,B.10-50ug,其后,200-400ug,2,其后,4,每月,每天,中等,中等,C.10-100ug,2,其后,4,其后“休息”,最后加强,每月,10,天,1-2,月,中等,中等或强,表,6-1,不同免疫抗原的免疫程序,（引自刘秀梵，,1994,）,免疫原特性抗原量接种次数间隔时间单抗的特性抗体滴度亲和性免疫,培养液：,RPM1640,培养液,DMEM,培养液,（三）细胞融合,培养液：（三）细胞融合,细胞融合剂：,PEG:,分子量,4000,的,PEG,是最常用的细胞融合剂,作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合,作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的,PEG,，其纯度与毒性有所不同,最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（,PEG,）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题,细胞融合剂：,培养骨髓瘤细胞：,选择对数生长期的细胞进行传代培养,细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐,避免细胞返祖：定期用,8-AG,（,8,氮鸟嘌呤）处理细胞，以维持,HGPRT-,的状态。,注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于,-80,或液氮及干冰中,培养骨髓瘤细胞：,取已经免疫的,BALB/c,小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。,同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于,75%,酒精中,5,分钟,通常每只小鼠,1,10,8,-2.5,10,8,个脾细胞，每只大鼠脾脏可得,5,10,8,-10,10,8,脾细胞。,免疫脾细胞的制备：,1,10,8,的,淋巴细胞,无菌手术,取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗,常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞,其中巨噬细胞还有清除死亡细胞的作用,饲养存活一般不超过,2,周，不影响杂交瘤细胞的纯化,在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞（,Feeder cells,）。,饲养细胞：,常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞,。,饲养细胞,。饲养细胞,融合方法,a,、将,110,8,脾细胞与,210,7,-510,7,骨髓瘤细胞,SP2/0-Ag14,混合于一支,50ml,融合管中，补加不完全培养基至,30ml,，充分混匀。,b,、,1000r/min,离心,5-10,分钟，将上清尽量吸净。,c,、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀,;,置,40,水浴中预热。,d,、用,1ml,吸管在,1,分钟左右（最佳时间为,45,秒）加预热至,40,的,50% PEG,（,PH 8.0,）,1ml,，边加边轻轻搅拌。,e,、用,10ml,吸管在,90,秒内加,20-30ml,预热至,37,的不完全培养基；,20-37,静置,10,分钟。,f,、,1000r/min 5,分钟；弃去上清。,g,、加入,5ml HAT,培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的,HAT,培养基至,80-100ml,。,h,、分装,96,孔细胞培养板，每孔,0.10-0.15ml,；分装,24,孔板，每孔,1.0-1.5ml,；然后将培养板置,37,，,5% CO,2,培养箱内培养。,i,、,5,天后用,HAT,培养基换出,1/2,培养基。,j,、,7-10,天后用,HT,培养基换出,HAT,培养基；（第,14,天后可用普通完全培养基）。,l,、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积,1/10,以上时吸出上清供抗体检测。,融合方法a、将1108脾细胞与2107-5107骨髓瘤,防止非分泌细胞的过度生长,单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体,包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等,软琼脂平板法(soft agar method),软琼脂平板法(soft agar method),二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存,ABC-ELISA试验,单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体,首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加强免疫,最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题,2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.,每次用BALB/c或F1代小鼠，（510）105/只, 使用的动物当然首选BALB/c小鼠 ,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。,从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力,与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。,b、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。,106-107个细胞或1-10ug,DNA合成的主要途径被A阻断,叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径（D途径）,前5天进行,预先腹腔注射pristane（降植烷）,DNA合成的主要途径被A阻断,DNA合成的主要途径被A阻断,10,20,天出现克隆,HAT,筛选,杂交瘤细胞在融合后,2,周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。,融合细胞的早期培养,防止非分泌细胞的过度生长1020天出现克隆融合细胞的早期培,常用的抗体检测方法：,（,1,）免疫酶技术,免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。,用可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,用全菌抗原的,ELISA,用全细胞抗原的,ELISA,抗体捕捉,ELISA,试验,ABC-ELISA,试验,Dot-ELISA,试验,免疫组化染色法,（,2,）免疫荧光技术,间接免疫荧光法,活细胞的膜荧光染色,（,3,）间接血凝试验,（,4,）放射免疫测定,常用的抗体检测方法：（1）免疫酶技术,HGPRT,酶与,TK,酶,：,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,胸腺嘧啶核苷激酶,（四）杂交瘤细胞的选择性培养,应用液：,8-,氮鸟嘌呤,HGPRT酶与TK酶：（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：,HAT,培养基：,H,（,Hypoxanthine,）,:,次黄嘌呤,A,（,Aminopterin,）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断,DNA,合成主要途径（,D,途径）,T,（,Thymidine,）：胸,腺嘧啶核苷酸；,“,核苷酸前体,”,，供细胞通过替代途径合成,DNA,。,H,和,T,联合阻断,DNA,合成的替代途径。,HAT培养基：,第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗课件,HAT,选择作用：,淋巴细胞：不能生长，,5,7,天死亡。,DNA,合成的主要途径被,A,阻断,骨髓瘤细胞：不能生长，,5,7,天死亡。,HGPRT,缺乏，,DNA,合成的替代途径被阻断,HAT选择作用：,SP2/O: HGPRT-,，,TK-;,长,命,脾细胞,:,HGPRT+,，,TK+ ;,短命(7,天,),杂交,瘤细胞,:,HGPRT+,，,TK+;,长,命,骨髓瘤细胞、脾细胞与,杂交,瘤细胞,SP2/O: HGPRT- ，TK-;长命骨髓瘤细胞、脾,杂交瘤细胞特点：,长期生长繁殖,利用淋巴细胞的,HGPRT,，将,H,合成为嘌呤碱并最终与,T,一起合成,DNA,从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息,从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力,杂交瘤细胞特点：,有限稀释法,(limiting dilution),FACS,法,（,fluorescence activated cell sorter,）,软琼脂平板法,(soft agar method),二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存,有限稀释法(limiting dilution) 二、阳性,特点：,不需任何特殊设备,克隆出现效率高,实验室常用方法,方法：,细胞悬液通过系列稀释,每个培养孔含,0.5,1,个细胞,有限稀释法,每种杂交瘤细胞分装,96,孔板一块，每个稀释度,32,孔，每孔量为,0.2ml,，每孔的杂交瘤细胞数分别为,0.5,、,3,和,10,。,特点：有限稀释法每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度3,效率最高,价格昂贵,FACS,（,Fluorescence Activating Cell Sorter,）,FACS（ Fluorescence Activating,106-107个细胞或1-10ug,第二代抗体 单克隆抗体,其中巨噬细胞还有清除死亡细胞的作用,可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig）,B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体,c、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40水浴中预热。,软琼脂平板法(soft agar method),PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB,防止细胞密度过高而死亡,A、杂交瘤细胞的染色体分析,亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。,g、加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。,首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加强免疫,5108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5108-10108脾细胞。,每次用BALB/c或F1代小鼠，（510）105/只, 使用的动物当然首选BALB/c小鼠 ,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。,i、5天后用HAT培养基换出1/2培养基。,DNA合成的主要途径被A阻断,通常每只小鼠1108-2.,软琼脂平板法,(soft agar method),按,1:1,比例使,1.2%,的琼脂糖和,2DMEM,培养基,(,含有,2,抗生素和,20%,的小牛血清,),混合后，取,3mL,混合液注入直径,6cm,平皿中,(10cm,平皿加,7,10mL),，冷却凝固，可作底层琼脂置,CO2,温箱中备用。,按,1:1,比例让,0.7%,的琼脂糖和,2DMEM,培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入,0.2mL,的细胞悬液，充分混匀，注入铺有,1.2%,琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入,37 5%CO2,温箱中培养,10,14,天,克隆生长至,2mm,时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的,24,孔板，扩大培养。,吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。,106-107个细胞或1-10ug软琼脂平板法(soft a,配制方案：杂交瘤细胞（,1,5,）,x10,6,/ml) +,细胞冻存液,(30%,40%,牛血清，,50%,60% RPMI-1640,培养液，,10%DMSO ),“,慢冻,”,：分步冷冻，,30-70,液氮,保存数年至数十年,“,快融,”,：取出立即浸入,37,40,水浴中，使其迅速融化、复苏,杂交瘤细胞的冻存与复苏,在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故,配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml) + 细胞冻,防止污染,避免染色体丢失,防止非分泌细胞的过度生长,防止细胞密度过高而死亡,细胞冷冻的意义,防止污染细胞冷冻的意义,（,1,）单克隆性的确定,包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。,A,、杂交瘤细胞的染色体分析,对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为,40,，小鼠骨髓瘤细胞,SP2/0,为,62-68,，,NS-1,为,54-56,；,B,、,单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定,免疫扩散,ELISA,C,、单抗纯度的鉴定,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）、,SDS-PAGE,、等电点聚焦电泳（,IEF,）及免疫,转印分析（,WB,）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。,PAGE,、,SDS-PAGE,、,IEF,、,WB,（,三,）,单克隆抗体的性质鉴定,（1）单克隆性的确定（三）单克隆抗体的性质鉴定,（,2,）单抗理化特性的鉴定,抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（,K,）表示。,常用的方法有竞争,ELISA,、非竞争性,ELISA,、间接,ELISA,、间接法夹心,ELISA,等,（,3,）单抗与相应抗原的反应性测定,包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等,（2）单抗理化特性的鉴定,三、单克隆抗体的制备,经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。,三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体,（一）单克隆抗体的产生,1,动物体内诱生方法：,每次用,BALB/c,或,F1,代小鼠，（,5,10,）,10,5,/,只,使用的动物当然首选,BALB/c,小鼠,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括,Ig,）,（一）单克隆抗体的产生1 动物体内诱生方法：,腹腔注射法,腹腔注射法,2,体外培养法：,a,、悬浮培养法：小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器,b,、微载体培养法,Microcarrier,：主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品,c,、中空纤维细胞培养系统：由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成,d,、微囊化细胞培养系统：先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。,2 体外培养法：,3.,杂交瘤细胞的无血清培养,已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基,利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。,但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；,3. 杂交瘤细胞的无血清培养,可溶性抗原：,ELISA,抗体捕获法,细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按,1:1,比例固定细胞）,（二）单克隆抗体的纯化,可溶性抗原：ELISA抗体捕获法（二）单克隆抗体的纯化,前,5,天进行,预先腹腔注射,pristane,（,降植烷,）,（,1,5,）,10,6,细胞,1,3,w,形成腹水,腹水型单抗的纯化,高滴度腹水,前5天进行,预先腹腔注射pristane（降植烷）腹水型单抗,盐析沉淀,亲和层析,离子交换层析,McAb,的纯化,盐析沉淀 McAb的纯化,ELISA,多头加样枪,ELISA多头加样枪,