酶免疫技术ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 酶免疫技术,第一节酶免疫技术的特点,一、酶和酶作用底物,二、酶标记抗体或抗原,三、固相载体,第九章 酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点,1,第二节酶免疫技术的分类,一、均相酶免疫测定,二、非均相酶免疫测定,第三节酶联免疫吸附试验,一、基本原理,二、方法类型及反应原理,思考题,小结,第二节酶免疫技术的分类思考题,2,放射免疫技术,发光免疫技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,三大经典标记技术,放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标,3,第一节 酶免疫技术的特点,第一节 酶免疫技术的特点,4,主要试剂:,酶标记的抗体或抗原,酶标物特点：,免疫学活性,酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,原理及特点,主要试剂:抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性原理及,5,特点：,灵敏度高、特异性强、准确性好,酶标记试剂能够较长时间保持稳定,操作简便、对环境没有污染。,易与其它技术偶联,衍生出适用范围更广的新方法,。,原理：,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应,酶对底物的显色反应,对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,特点：原理：原理及特点,6,标记酶的要求：,活性高,性质稳定,专一性强,酶催化底物的显色信号易于判断和测量,方法敏感，重复性好，简单易行,酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉,一、酶和酶作用底物,标记酶的要求：一、酶和酶作用底物,7,辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）,亚铁血红素（辅基）,主酶与酶活性无关,辅基是酶的活性中心,RZ值：403nm （辅基）与275nm（主酶） OD值之比,RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,常用酶,酶和酶作用底物,辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶）RZ值：403nm,8,碱性磷酸酶（AP）,菌源性AP,肠粘膜AP,半乳糖苷酶（-Gal）,用于均相酶,免疫测定,常用酶,酶和酶作用底物,菌源性AP 用于均相酶常用酶酶和酶作用底物,9,HRP的底物,DH,2,+H,2,O,2, D+2H,2,O,HRP,供氢体DH,2,习惯上被称为底物，底物有多种,H,2,O,2,为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,常用底物,酶和酶作用底物,HRP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HR,10,HRP的常见底物,邻苯二胺 OPD,四甲基联苯胺 TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS,常用底物,酶和酶作用底物,HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD四甲基联苯胺 TMB5-氨,11,乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,酶标记试剂能够较长时间保持稳定,酶结合物（conjugate）,酶免疫技术的核心组成部分,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,病原体急性感染诊断中的IgM型抗体,酶标记试剂能够较长时间保持稳定,第三节酶联免疫吸附试验,需分离游离与结合的酶标记物,结合抗体或抗原的容量大,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,ELISA检测抗体的方法,5-氨基水杨酸5-ASA,对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,固相方法简便易行，快速经济,捕获待测标本中IgM类抗体,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,甲型肝炎HAV-IgM抗体,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,酶和酶作用底物,乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体OPD反应后显橙黄色，加酸,12,AP的,底物,-Gal,的底物,对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（ 4MUG ）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。,常用底物,酶和酶作用底物,AP的-Gal对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）4-甲基伞酮,13,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）,酶标记物,通过化学反应或免,疫学反应，让酶与,抗体或抗原形成的,结合物,二、酶标记抗体或抗原,酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate）通过,14,抗原要求纯度高，抗原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,制备方法要求,酶标记抗体或抗原,抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力,15,制备方法要求,技术方法简单、产率高，重复性好,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,酶标记物稳定 ，不形成聚合物,酶标记抗体或抗原,制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和,16,制备方法,过碘酸钠法（直接法）,常用于HRP标记抗体或抗原,戊二醛交联法,酶标记抗体或抗原,制备方法过碘酸钠法（直接法）戊二醛交联法酶标记抗体或抗原,17,戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,酶标记抗体或抗原,戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋,18,纯化及鉴定,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,常用的纯化方法：,葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化,50%饱和硫酸铵沉淀提纯,酶标记抗体或抗原,纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、,19,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,三、固相载体,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分,20,要求,结合抗体或抗原的容量大,抗体或抗原牢固地固定在其表面,不影响免疫反应性,利于反应充分进行,固相方法简便易行，快速经济,种类,塑料制品,微颗粒,膜载体,固相载体,要求 结合抗体或抗原的容量大 种类塑料制品 固相载体,21,将抗原或抗体结合于固相载体,用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附,包被coating,封闭blocking,包被与封闭,将抗原或抗体结合于固相载体用1%5%的牛血清白蛋白或5%,22,ELISA检测抗体的方法,捕获待测标本中IgM类抗体,enzyme-mutiplied immunoassay technique,技术方法简单、产率高，重复性好,竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。,甲型肝炎HAV-IgM抗体,二价或二价以上的较大分子抗原测定,辣根过氧化物酶（HRP）,酶催化底物的显色信号易于判断和测量,50%饱和硫酸铵沉淀提纯,cloned enzyme donor immunoassay,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,9ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？,原理：类似双抗体夹心法,酶标记试剂能够较长时间保持稳定,ELISA检测抗原的方法,酶免疫技术的核心组成部分,二、方法类型及反应原理,第二节酶免疫技术分类,ELISA检测抗体的方法第二节酶免疫技术分类,23,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均 相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或,抗体的定性和定量,酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均 相非均相固相酶免疫测定液相,24,用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。,原理,一、均相酶免疫测定,用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应,25,最具代表性的两种技术,酶放大免疫测定技术EMIT,enzyme-mutiplied immunoassay technique,克隆酶供体免疫分析,CEDIA,cloned enzyme donor immunoassay,均相酶免疫测定,最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMIT克隆酶供体免疫,26,EMIT示意图,EMIT示意图,27,CEDIA示意图,CEDIA示意图,28,分类：,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定,以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定,与均相不同之处,需分离游离与结合的酶标记物,二、非均相酶免疫测定,分类：液相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物,29,第三节酶联免疫吸附试验,第三节酶联免疫吸附试验,30,底物显色,定性或定量的分析,原理,包被,反应,加入待测抗体或,抗原和酶标抗原,或抗体,洗涤,使结合在固相上,的抗原抗体复合物,与未结合的分离,1,2,3,4,一、基本原理,底物显色原理包被反应洗涤1234一、基本原理,31,固相的抗原或抗体,酶标记物（酶结合物,）,酶反应的底物,三个必要试剂,二、方法类型及反应原理,固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必,32,双抗体夹心法,方法：,用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色,应用：,二价或二价以上的较大分子抗原测定,乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,ELISA检测抗原的方法,双抗体夹心法ELISA检测抗原的方法,33,酶免疫技术ppt课件,34,1、已知抗体包,3、加酶标抗体,4、加酶作用的底物,2、加待检物,4、加酶作用的底物,洗涤,洗涤,洗涤,洗涤,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包,2、加待检物无抗,3、加酶标抗体,+,-,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物4,35,竞争法,方法：,用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色,。,应用：,用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,ELISA检测抗原的方法,竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标,36,以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定,二价或二价以上的较大分子抗原测定,ELISA检测抗体的方法,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,第一节 酶免疫技术的特点,ELISA检测抗原的方法,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应,10对酶免疫技术的应用评价如何？,酶催化底物的显色信号易于判断和测量,二、方法类型及反应原理,常用于HRP标记抗体或抗原,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。,第一节酶免疫技术的特点,对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,酶标记试剂能够较长时间保持稳定,辣根过氧化物酶（HRP）,ELISA检测抗原的方法,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,ELISA检测抗体的方法,RZ值：403nm （辅基）与275nm（主酶） OD值之比,以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,37,洗涤,洗涤,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,E,2、加待检物,抗原与酶标抗,原竞争与抗体,结合,3、加酶作用,的底物不显色,或显色弱,3、加酶作用,的底物显色,1、已知抗体包,被于载体表面,1、已知抗体包,被于载体表面,2、加待测物,和酶标抗原，,酶标抗原与抗,体结合,Y,E,洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYE,38,间接法,方法,用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。,优点,一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体,应用,常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,ELISA检测抗体的方法,间接法ELISA检测抗体的方法,39,酶免疫技术ppt课件,40,1、已知抗原吸,2、加待检物,3、加酶标抗Ig,4、加酶作用的底物,1、已知抗体吸,2、加待检物,3、加酶标的抗Ig,4、加酶作用的底物,洗涤,洗涤,洗涤,洗涤,间接法测抗体,-,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,E,Y,+,1、已知抗原吸2、加待检物3、加酶标抗Ig4、加酶作用的底物,41,双抗原夹心法,原理：,类似双抗体夹心法,操作步骤,：,类似,应用：,乙型肝炎表面抗体,ELISA检测抗体的方法,双抗原夹心法ELISA检测抗体的方法,42,竞争法,原理：,类似检测抗原的竞争法,应用,：,乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,ELISA检测抗体的方法,竞争法ELISA检测抗体的方法,43,捕获法,应用：,病原体急性感染诊断中的IgM型抗体,甲型肝炎HAV-IgM抗体,乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,ELISA检测抗体的方法,捕获法ELISA检测抗体的方法,44,捕获法,原理：,抗人IgM链抗体包被,捕获待测标本中IgM类抗体,加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体,底物显色,捕获法 原理：,45,洗涤,洗涤,洗涤,洗涤,捕获法原理,+,-,E,Y,E,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,1、固相化抗人,IgM,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,1、固相化抗人,IgM,2、加待测物,特异性IgM与,非特异性IgM,和抗人IgM结合,3、加特异性,抗原，与特异,性抗体结合,4、加酶标抗体,与特异性抗原结,合，加底物显色,2、加待测物,只有非特异性IgM,和抗人IgM结合,3、加特异性抗,原，不能与非,特异性IgM结合,4、加酶标抗体,无抗原结合，,加底物不显色,洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYY,46,4常用的底物有哪几类？特点？,RZ值：403nm （辅基）与275nm（主酶） OD值之比,对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,酶结合物（conjugate）,TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理：类似检测抗原的竞争法,ELISA检测抗原的方法,6何谓包被与封闭？其作用？,该法有一步法和二步法。,半乳糖苷酶（-Gal）,常用于HRP标记抗体或抗原,原理：类似检测抗原的竞争法,常用于HRP标记抗体或抗原,酶标记的抗体或抗原,细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。,葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化,10对酶免疫技术的应用评价如何？,酶标记试剂能够较长时间保持稳定,对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,第二节酶免疫技术分类,3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？,第四,节,酶免疫测定的应用,4常用的底物有哪几类？特点？第四节 酶免疫测定的应用,47,均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。,均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定,48,1酶免疫技术的要点？,2酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？,3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？,4常用的底物有哪几类？特点？,5常用的酶有哪几类？特点？,6何谓包被与封闭？其作用？,7常用固相载体的种类和特点？,8举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。,9ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？,10对酶免疫技术的应用评价如何？,思考题,1酶免疫技术的要点？思考题,49,5-氨基水杨酸5-ASA,cloned enzyme donor immunoassay,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；,葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应,TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉,酶标记试剂能够较长时间保持稳定,3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？,用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附,2酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？,第一节 酶免疫技术的特点,以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定,甲型肝炎HAV-IgM抗体,操作简便、对环境没有污染。,固相方法简便易行，快速经济,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。,10对酶免疫技术的应用评价如何？,1酶免疫技术的要点？,酶结合物（conjugate）,葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化,二价或二价以上的较大分子抗原测定,ELISA检测抗体的方法,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,甲型肝炎HAV-IgM抗体,乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,第一节 酶免疫技术的特点,4常用的底物有哪几类？特点？,组织切片或其它标本中抗原的定位,TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,酶免疫技术的核心组成部分,原理：类似双抗体夹心法,ELISA检测抗原的方法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。,该法有一步法和二步法。,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,ELISA检测抗体的方法,ELISA检测抗原的方法,ELISA检测抗体的方法,1酶免疫技术的要点？,5-氨基水杨酸5-ASA,酶标记的抗体或抗原,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,50%饱和硫酸铵沉淀提纯,甲型肝炎HAV-IgM抗体,enzyme-mutiplied immunoassay technique,原理：类似双抗体夹心法,ELISA检测抗原的方法,常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应,第四节 酶免疫测定的应用,ELISA检测抗体的方法,二、酶标记抗体或抗原,酶免疫技术的核心组成部分,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,10对酶免疫技术的应用评价如何？,酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。,均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。,小 结,5-氨基水杨酸5-ASAOPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后,50,