紫外可见分光光度法的原理及应用课件

紫外紫外-可见分光光度法的原理及应用可见分光光度法的原理及应用(Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)紫外-可见分光光度法的原理及应用(Ultraviolet-V1.紫外-可见吸收光谱法的基本原理2.紫外-可见分光光度计3.紫外-可见吸收光谱法的应用1.紫外-可见吸收光谱法的基本原理2.紫外-可见分光光度计3紫外-可见分光光度法的原理物质对光的选择吸收当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被吸收或被反射，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收。物质呈现各种各样颜色，就是它们对可见光中某些特定波长的光线选择吸收的结果。紫外-可见分光光度法的原理物质对光的选择吸收当一束光照射到某物质对光的选择性吸收物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定。人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：400760nm。让白光通过棱镜，能色散出红、橙、黄、绿、蓝、紫等各色光。单色光：单一波长的光复合光：由不同波长的光组合而成的光，如白光。光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定比例混合得到白光，称这两种单色光为 互补色光，这种现象称为 光的互补。物质对光的选择性吸收物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定物质颜色和吸收光颜色的关系吸收光物质颜色颜色波长(nm)黄绿紫400 450黄蓝450 480橙绿蓝480 490红蓝绿490 500紫红绿500 560紫黄绿560 580蓝黄580 600绿蓝绿600 650蓝绿红650 750物质颜色和吸收光颜色的关系吸收光物质颜色颜色波长(nm)黄绿物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收选择性吸收而产生。即物即物质质的的颜颜色是它所吸收光的互色是它所吸收光的互补补色。色。无色溶液：透过所有颜色的光有色溶液：透过光的颜色黑色：吸收所有颜色的光白色：反射所有颜色的光物质的本色物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生。即紫外可见分光光度法的原理及应用课件物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波长的光。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收来了解物质的结构特性。用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，通过测量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，就可以得到该物质在测量波长范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力，称为吸收光谱。紫外-可见分光光度法的原理入射光透射光不同波长光检测器吸收光谱物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波长的光。我们紫外-可见分光光度法的原理紫外-可见分光光度法是利用物质对光的吸收光谱，对物质进行定性分析或定量分析的方法。按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。0.01nm 0.1nm 800nm 10m 500 m 1cm 波长200nm 400nm 2.5 m 25m 1m 光谱可区域见 射线 射线紫外光光红外光微波无线电波分析分光方法 射线紫外分光度核磁共振 射线光谱法光谱法光光度法法红外光谱法微波光谱法光谱法紫外-可见分光光度法的原理紫外-可见分光光度法是利用物质对光基于物质对200-800 nm 光谱区辐射的吸收特性建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它具有如下特点：1.灵敏度高。可以测定 10-710-4gmL-1的微量组分。2.准确度较高。其相对误差一般在 1%-5%之内。3.仪器价格较低，操作简便、快速。4.应用范围广。基于物质对200-800 nm光谱区辐射的吸收特性建立起来的紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：200 400 nm可见吸收光谱：可见吸收光谱：400 800 nm两者都属电子光谱：分子吸收紫外辐射能后引起价电子跃迁所产生的。只是所用光源波段不同。跃迁所产生的。只是所用光源波段不同。紫外光谱法与可见分光光度法和红外光谱法统称分子吸收光谱法。价电子n电子电子电子紫外吸收光谱：200 400 nm可见吸收光谱：400 一、分子吸收光谱1分子吸收光谱的产生由能级间的跃迁引起能级：电子能级、振动能级、转动能级跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程转振电分EEEE?chhE?能级差一、分子吸收光谱1分子吸收光谱的产生由能级间的跃迁引起能?分子选择性地吸收一定波长的光，从能量较低状态跃迁到较高状态，使得透过的光谱中这些波长光的强度减弱，这种光谱即称为分子吸收光谱。?E 的大小是由物质的分子结构决定的，不同的分子结构，E 是不同的，吸收光的波长不同，反映物质分子的结构不同，所以研究物质的分子吸收光谱可以提供物质的分子结构的信息。?分子选择性地吸收一定波长的光，从能量较低状态跃迁到较高状态2分子吸收光谱的分类：分子吸收光谱涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序3紫外-可见吸收光谱的产生由于每个电子能级上耦合有许多的振-转能级，所以处于紫外-可见光区的电子跃迁而产生的吸收光谱具有“带状吸收”的特点。转振电EEE?远红外吸收光谱红外吸收光谱可见吸收光谱紫外转振电?mevEmevEmevE?2525005.0005.025.125105.025.106.02012分子吸收光谱的分类：分子吸收光谱涉及三种跃迁能级，所需能图1 分子中的电子（S）、振动（V）、转动（J）能级示意图图1 分子中的电子（S）、振动（V）、转动（J）能级示意图吸收光谱：吸收光谱：又称吸收曲线，是以波长（nm）为横坐标，以吸光度A为纵坐标所绘制的曲线。1213241、吸收峰 2、谷 3、肩峰 4、末端吸收A图2 紫外吸收光谱图吸收光谱：又称吸收曲线，是以波长（nm）为横坐标，以吸光度4、光的吸收定律、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1760 年和1852 年研究吸光度与溶液厚度和其浓度的定量关系：朗伯定律：A=k1L比尔定律：A=k1CA=k C L一束平行单色光通过一均匀、非散射 的吸光物质溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液温度等保持不变时，该溶液的吸光度A与其浓度C及液层厚度L的乘积成正比。入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。均匀、无散射溶液、固体、气体。吸光度A具有加和性。Aa+b+c=Aa+Ab+Ac注意!适用范围朗伯-比尔定律:吸光系数浓度液层厚度4、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别当一束平行的单色光通过液层厚度一定的溶液时，在入射光波长、强度和溶液温度等不变时，吸光度与溶液浓度 c 关系：比耳定律实验k c当一束平行的单色光通过液层厚度一定的溶液时，在入射光波长、强当一束平行的单色光通过浓度一定的溶液时，在入射光波长、强度和溶液温度等不变时，吸光度与液层厚度（b）关系：朗伯定律实验k L当一束平行的单色光通过浓度一定的溶液时，在入射光波长、强度和朗伯-比耳定律实验朗伯-比耳定律实验?如果溶液的浓度用摩尔浓度（mol/L），吸收池的厚度以厘米（cm）为单位，则Lambert-Beer 定律的吸光系数（k）可表示为，称为摩尔吸光系数（molar absorptivity）。A=LC；即A/LC吸光系数的意义:（1）一定条件下是一个特征常数。（2）在温度和波长等条件一定时，仅与物质本身的性质有关，与待测物浓度c和液层厚度L无关；（3）定性和定量分析依据：同一物质在不同波长时值不同。不同物质在同一波长时值不同。max表明了该物质在最大吸收波长max处的最大吸光能力?如果溶液的浓度用摩尔浓度（mol/L），吸收池的厚度以厘米二、电子跃迁二、电子跃迁1.电子跃迁的基本概念分子轨道成键轨道非键轨道反键轨道?通常情况下，分子中 电子排布在成键轨道上,这种状态称为基态。分子吸收一定能量的光子后，基态的一个电子被激发到反键分子轨道(激发态)，这个过程称为电子跃迁。二、电子跃迁1.电子跃迁的基本概念分子轨道成键轨道非键轨道?有机化合物中的价电子有形成单键的 电子电子和形成双键或叁键的电子，以及未成键的n电子（nonbonding）等，它们由基态跃迁到激发态的跃迁能是各不相同的。?有机化合物中的价电子有形成单键的电子和形成双键或叁键的分子中的价电子：电子 饱和的键电子 不饱和的键n电子 孤对电子分子中分子轨道有成键轨道与反键轨道：各轨道能级高低顺序：?n?*?*（分子轨道理论计算结果）分子中的价电子：电子 饱和的键电子 不饱和的键nh2.分子中价电子跃迁类型电子跃迁的类型不同，实现跃迁所需的能量不同，跃迁能量越大，则吸收光的波长越短。各种跃迁所需的能量跃迁顺序为：*n*n*h2.分子中价电子跃迁类型电子跃迁的类型不同，实现跃迁所1、*跃迁跃迁所需能量最大150nm 104饱和烃（远紫外区）C-H共价键，如CH4（max125nm）C-C键，如 C2H6 (max135nm)1、*跃迁跃迁所需能量最大 104 强带 102 弱带2.红移和蓝移由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或四、吸收带四、吸收带紫外-可见光谱为带状光谱，故将紫外-可见光谱中吸收峰称为吸收带。吸收带是吸收峰在紫外光谱中的位置，它与化合物的结构和电子跃迁类型密切相关。根据类型不同可分为:R带、K带、B带、E带四种。为n*跃迁引起的吸收带。如羰基CO,NO2、CHO等，其特点为吸收强度弱，100，吸收峰波长一般在270nm以上；1.R带从德文Radikal(基团)得名四、吸收带紫外-可见光谱为带状光谱，故将紫外-可见光谱中吸收2.K带从德文Konjugation(共轭作用)得名为*跃迁引起的，如共轭双键。该吸收带的特点为吸收峰很强，104，最大吸收峰位置一般在217280nm。共轭双键增加，max向长波方向移动，max也随之增加；2.K带从德文Konjugation(共轭作用)得名为3.B带从德文Benzenoid(苯的)得名为芳香化合物(包括杂环芳香化合物)的特征吸收带。这是由于*跃迁和苯环的振动重叠引起的。苯蒸气在230270nm处出现精细结构的吸收光谱，称为笨的多重吸收带或精细结构吸收带。在极性溶剂中或苯环上有取代基时，复杂的B吸收带简化，精细结构消失，出现一宽峰，中心在256nm，220。3.B带从德文Benzenoid(苯的)得名为芳香化合物(是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的*跃迁所产生的芳香族化合物的特征吸收带。分为E1和E2吸收带，其中E1在185nm 附近，=47000，E2在204nm，=7900，均为强吸收。4.E带?苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并一起红移（长移）苯在环己烷中B带和E1和E2带是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的*跃迁所产生的芳紫外可见分光光度法的原理及应用课件根据吸收带的特点，我们可以预测一个化合物紫根据吸收带的特点，我们可以预测一个化合物紫外外-可见吸收光谱的吸收带可能出现的波长范围，可见吸收光谱的吸收带可能出现的波长范围，或由光谱的吸收带推断可能的结构类型以及所含或由光谱的吸收带推断可能的结构类型以及所含的官能团。的官能团。根据吸收带的特点，我们可以预测一个化合物紫外-可见吸收光谱的4-2 紫外-可见分光光度计仪器结构：光源、分光系统、吸收池、检测器0.575光源单色器吸收池检测器信号处理及显示4-2 紫外-可见分光光度计仪器结构：光源、分光系统、吸收4-2 紫外-可见分光光度计仪器结构：光源、分光系统、吸收池、检测器钨灯或卤钨灯可见光源 3501000nm氢灯或氘灯紫外光源200360nm1光源：4-2 紫外-可见分光光度计仪器结构：光源、分光系统、吸收光源光源氘灯紫外卤钨灯-可见光源氘灯紫外卤钨灯-可见4-2 紫外-可见分光光度计仪器结构：光源、吸收池、分光系统、检测器2吸收池：玻璃能吸收紫外光，仅适用于可见光区石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区4-2 紫外-可见分光光度计仪器结构：光源、吸收池、分光系吸收池光光比色槽比色杯吸收池光比色槽比色杯检测器检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管、光电倍增管或光二极管阵列。检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用一、主要部件光源：钨灯和卤钨灯、氢灯或氘灯紫外可见分光光度计单色器：透镜、光栅、全息光栅吸收池：玻璃比色皿、石英比色皿检测器：光电管、光电倍增管、二极管阵列检测器二、分光光度计的分光类型单波长单光束分光光度计、单波长双光束分光光度计双波长单光束分光光度计、二极管阵列分光光度计一、主要部件光源：钨灯和卤钨灯、氢灯或氘灯紫外可见分光光度计分光光度计外观分光光度计外观光源单色器吸收池检测器信号处理显示器721型可见分光光度计分光光度计外观光源单色器吸收池检测器信号处理显示器721型可分光光度计原理分光光度计原理分光光度计原理721单束分光光度计单束分光光度计721单束分光光度计754c 可见分光光度计使用可见分光光度计使用754c可见分光光度计使用紫外、可见分光光度法的应用一、定性分析二、有机化合物构型和构象的确定三、定量分析定性鉴别纯度检查和杂质限量鉴定单组分的定量方法多组分的定量方法紫外、可见分光光度法的应用一、定性分析二、有机化合物构型和构一、定性分析一、定性分析（一）定性鉴别（一）定性鉴别定性鉴别的依据吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数一、定性分析（一）定性鉴别定性鉴别的依据吸收光谱的特征吸收二、有机化合物构型和构象的确定二、有机化合物构型和构象的确定?采用紫外光谱，可以确定一些化合物的构型和构象。一般说来，顺式异构体的最大吸收波长比反式异构体小，因此可以用紫外光谱进行区别。?采用紫外光谱法，还可以测定某些化合物的互变异构现象测定某些化合物的互变异构现象。例如，乙酰乙酸乙酯有酮式和烯醇式间的互变异构。?紫外光谱也可以用于确定构象。例如-卤代环己酮有两种构象，一个C-X键为直立键、另一个为平伏键。二、有机化合物构型和构象的确定?采用紫外光谱，可以确定一些化三、定量分析（一）单组分的定量方法定量依据：A=LC三、定量分析（一）单组分的定量方法定量依据：A=LC1吸光系数法（绝对法）吸光系数法（绝对法）要求单色光前提：iECAmLgCigW?求含样过程：已知稀释)/(/)(lEAmLgCi?100/lALmolCi?/或%100%?样CCii1吸光系数法（绝对法）要求单色光前提：iECAmLgCig?例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为 207，用1cm比色池测得某维生素 B12溶液的吸光度是 0.414，求该溶液的浓度。?解：mLgmLglEAC/0.20100/00200.01207414.0?例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为20?例：精密称取 B12样品25.0mg，用水溶液配成 100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于 361nm处测定吸光度为 0.507，求B12的百分含量？?解：mLgmLgCi/1045.2100/1045.21207507.053?mLgC/1050.2100101001050.252?样%0.98%1001050.21045.2%100%5512?样CCBi?例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml?例：?解：%)0.764(591.01001025000.20367255iEAmLmLmLmgmlmLHCL求已知测移取稀至样品稀至吡啶?mLgmLglEACi/1092.7100/1092.7764591.064?%0.99%10025010100100.21092.7%100%26?样CCii?例：?解：%)0.764(591.01001025000.2标准曲线法标准曲线法条件前提：固定仪器和测定CACKA?样样同上条件固定条件查得测定样品曲线分别测定配制标准系列过程：CAACA?标样标样标样标样AACCAACC?2标准曲线法条件前提：固定仪器和测定CACKA?样样?芦丁含量测定芦丁含量测定mLmgmLmLmLmg250.32550/200.0?样品标样分别移取0.710mg/25mL示例示例?芦丁含量测定mLmgmLmLmLmg250.32550/3对照法：外标一点法对照法：外标一点法?注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时标样与样品浓度相近；截距为固定仪器和测定条件；前提：0标样和分别测定一定过程：AA?SiSiAACC?sCiCCSiSiAAmm?%100%?mmii3对照法：外标一点法?注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数THE ENDTHEEND（二）多组分的定量方法?cbaAAAA总定量依据：?三种情况：1两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自max下不重叠分别按单组分定量aaaaaaEACCEA1111?由bbbbbbEACCEA2222?由bbaaAEAE222111；测定；测定过程：?（二）多组分的定量方法?cbaAAAA总定量依据：?2两组分吸收光谱部分重叠1测A1b组分不干扰可按单组分定量测Ca2测A2a组分干扰不能按单组分定量测CababaaaAEEAE?2222111；和测定；测定过程：?aaaaaaEACCEA1111?由bbaababaCECEAAA?22222由baababECEAC222?2两组分吸收光谱部分重叠1测A1b组分不干扰可按单3两组分吸收光谱完全重叠混合样品测定（1）解线性方程组法（2）等吸收双波长消去法（3）系数倍率法3两组分吸收光谱完全重叠混合样品测定（1）解线性方程组1解线性方程组法解线性方程组法?步骤：babababaAEEAEE?22221111；和测定；和测定?bbaababaCECEAAA?11111bbaababaCECEAAA?22222bababbabbaaEEEEEAEAC12211221?babaabaababEEEEEAEAC12212112?1解线性方程组法?步骤：babababaAEEAEE?2等吸收双波长法等吸收双波长法?步骤：?消除a的影响测bbabababaAAAAAA222111?babbaabababaAAAAAAAAA?)()(212121aaAAa2121?和的等吸收点选bbbbbbbbaCECEEAAA?)(2121bbabbbabEAEEAC?212等吸收双波长法?步骤：?消除a的影响测bbabababa续前?消去消去b的影响测的影响测a?注：须满足两个基本条件?选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点?选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大bbAAb 2 1 2 1?和的等吸收点选aaaaaaabaCECEEAAA?)(21 2 1abaaabaaEAEEAC?2 1续前?消去b的影响测a?注：须满足两个基本条件?选定的两个3系数倍率法系数倍率法?前提：干扰组分b不成峰形无等吸收点3系数倍率法?前提：干扰组分b不成峰形无等吸收点续前?步骤：b曲线上任找一点1另一点2?优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号K倍，提高了待测组分测定灵敏度ab12倍率因子令KAAbb?21)()()()(1212112212aabbababbababaAKAAKAAAAAKAKAA?bA1bA2aaaaabaCEKEAKAA?)(1212的干扰消除了bCAaba?续前?步骤：b曲线上任找一点1另一点2?优点：同时将练习解：mLgmLgCi/10900.4100/10900.419.927463.064?mLgC/10000.55052001000.1063?样%0.98%10010000.510900.4%100%66?样咖啡酸CCi5052001?稀释因子注：1、取咖啡酸，在 165干燥至恒重，精密称取 10.00mg，加少量乙醇溶解，转移至 200mL 容量瓶中，加水至刻度线，取此溶液5.00mL，置于50mL容量瓶中，加6mol/L 的HCL 4mL，加水至刻度线。取此溶液于 1cm比色池中，在 323nm处测定吸光度为0.463，已知该波长处的，求咖啡酸百分含量。练习解：mLgmLgCi/10900.4100/10900.练习解：%11cmE12000.100120001010%11?MEcmmLgmLglETlEACi/10165.3100/10166.311200417.0lglg64?mLgC/10000.410022500500.06?样%15.79%10010000.410165.3%100%66?样样品CCi2精密称取0.0500g样品，置于250mL容量瓶中，加入0.02mol/L HCL 溶解，稀释至刻度。准确吸取 2mL，稀释至100mL。以0.02mol/L HCL 为空白,在263nm处用1cm吸收池测定透光率为41.7%，其摩尔吸光系数为 12000，被测物分子量为100.0，试计算263nm处和样品的百分含量。（见书后P215题17）练习解：%11cmE12000.100120001010%1?例：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品 25.00mg，加水稀释至 1000mL。在361nm处，用 1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12注射液的标示量为100g/mL）。?解：1）对照法mLgCCii/1.98518.0508.01000100000.25105.2?%1.98%100%12?标示量标示量iCB?例：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL760双束分光光度计双束分光光度计760双束分光光度计紫外-可见分光光度法的原理-定性分析不同结构的物质吸收光谱也不同，这是对物质进行定性分析的基础：通过检测吸收光谱来比对鉴定分析物质。波长范围吸光度利用标准物质定性分析在相同条件下，测定未知物的吸收光谱，与标准物的吸收光谱进行比较，如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、拐点等完全一致，就可初步判定未知物与标准物是同一种物质。紫外-可见分光光度法的原理-定性分析不同结构的物质吸收光谱也紫外-可见分光光度法的原理-定量分析Lambert Beer 光吸收定律：当一束平行单色光通过均匀的样品时，其吸光度与吸光组分的浓度、吸收池的厚度乘积成正比.入射光 I0透射光 ItLC紫外-可见分光光度法的原理-定量分析Lambert Bee紫外-可见分光光度法的原理-定量分析波长范围吸光度最大吸收波长利用标准曲线法定量分析在一定波长（max）下测定某物质的标准系列溶液的吸光度作标准曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由标准曲线求得样品溶液的浓度或含量。0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)0.800.600.400.200.00Axcx紫外-可见分光光度法的原理-定量分析波长范围吸光度最大吸收波