第二次实验-rt-pcr技术-课件

第二次实验-rt-pcr技术ppt课件操操 作作(一一)细胞总细胞总RNA的提取的提取1、取小鼠肝脏约、取小鼠肝脏约0.1g（约绿豆大小），置匀浆器中，加入（约绿豆大小），置匀浆器中，加入1ml TRIzol，充，充分匀浆。分匀浆。2、将匀浆后样品转入、将匀浆后样品转入Ep管，离心数秒，取管，离心数秒，取250ul上清至一新上清至一新Ep管中。管中。3、每管样品中加入、每管样品中加入50ul氯仿（萃取酚），充分振荡混匀，静置氯仿（萃取酚），充分振荡混匀，静置10min。4、12000rpm10min。5、取上清转入新、取上清转入新Epg管，加等体积异丙醇，混匀，室温放置管，加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。6、12000rpm10min。7、弃上清，加入、弃上清，加入50ul 70%乙醇洗涤一次，自然晾干。乙醇洗涤一次，自然晾干。8、加入、加入50ul DEPC水溶解沉淀。水溶解沉淀。PCR(Polymerase Chain Reaction)1.What is PCR?n nPCR is an in vitro method of DNA synthesis by which a particular fragment of DNA can be specifically amplified.特异特异DNA片段的体外快速大量扩增技术片段的体外快速大量扩增技术.PCR技术的发明者技术的发明者2 Background knowledge of PCR:n nDNA replication DNA replication n nDNA denaturation,renaturation&DNA denaturation,renaturation&hybridizationhybridizationDNA Replication:5 3dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPDNA-pol3TemplateTemplatePrimerPrimer5DNA Replication:3heatingheatingannealingannealingDNA Denaturation&Renaturation:DenaturationDenaturationRenaturationRenaturationHybridizationDenaturation95Elongation72 Annealing603 Principles of PCRn n高温变性n n低温退火n n适温延伸n n循环25-30次 5 5 Template DNA5 Primer 15 Primer 2 5 5 5 5 The 1st cycleDenaturation95Annealing60Elongation72 5 5 Template DNA5 Primer 15 Primer 2 5 5 5 5 The 1st cycleThe 2nd cycle 5 5 5 5 5 5 5 5 The 3th cycle 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 After 20 30 cycles,the original DNA can be amplified millions-fold.平台期平台期指数扩增期指数扩增期到达平台期所需到达平台期所需PCR循环次数取决于模板循环次数取决于模板拷贝数、拷贝数、PCR扩增效扩增效率及率及DNA聚合酶的种聚合酶的种类及活性类及活性.4 The Characteristics of PCRn nHigh specificityn nHigh sensitivityn nSimple and rapid operation n nWide applicabilityHBVHBVHAVHAVHDVHDVHCVHCVPCRPCRHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHigh specificity引物设计的原则引物设计的原则n n引物长度：引物长度：引物长度：引物长度：15-30bp15-30bpn n引物中碱基分布：尽可能随机分布，引物中碱基分布：尽可能随机分布，引物中碱基分布：尽可能随机分布，引物中碱基分布：尽可能随机分布，G+CG+C占占占占45%45%55%55%n n引物自身不能互补引物自身不能互补引物自身不能互补引物自身不能互补n n引物之间不能互补引物之间不能互补引物之间不能互补引物之间不能互补n n引物与非扩增区同源性引物与非扩增区同源性引物与非扩增区同源性引物与非扩增区同源性70%70%，33末端连续末端连续末端连续末端连续8 8个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补n n引物引物引物引物33端碱基一定要与模板互补，最好选择端碱基一定要与模板互补，最好选择端碱基一定要与模板互补，最好选择端碱基一定要与模板互补，最好选择GG和和和和C Cn n引物引物引物引物55端可游离十几个碱基，可进行修饰端可游离十几个碱基，可进行修饰端可游离十几个碱基，可进行修饰端可游离十几个碱基，可进行修饰PCRPCRTarget DNATarget DNADNADNAHigh sensitivityPCR仪器设备：仪器设备：n n自动移液器和枪头自动移液器和枪头自动移液器和枪头自动移液器和枪头n n微量离心管微量离心管微量离心管微量离心管n nPCRPCR仪仪仪仪n n电泳设备电泳设备电泳设备电泳设备n nSimple and rapid operationSimple and rapid operationn n Wide applicability Wide applicabilityn template (ng)n primers（0.1-0.5umol/L）n Taq DNA pol（2.5-5U）n dNTP(20-200umol/L)n Mg2+（1.5-2.5 mmol/L）5 The Composition of PCR System:DNADNATarget SequencePrimer 1Primer 2DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）n n大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 的的的的KlenowKlenow片段；片段；片段；片段；n n耐热耐热耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶?美国黄石国家公园美国黄石国家公园美国黄石国家公园美国黄石国家公园n n耐热耐热耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(Taq DNA pol)(Taq DNA pol)，来自，来自，来自，来自Thermus aquaticusThermus aquaticus，在在在在9595的半衰期的半衰期的半衰期的半衰期为为为为 1.6 1.6 小时。小时。小时。小时。6.Standard PCR reaction:design the reaction system Target gene:-actinPrimer 1:5ATGGGTCAGAAGGACTCCTATC 3Primer 2:5ATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAG 3The length of DNA fragment:530bpddHddH2 2O O 15.5 ul 15.5 ul 10Buffer10Buffer 3 ul 3 ulMgclMgcl2 2(1.5mmol/L)2.5 ul2.5 uldNTPs(dNTPs(各各200umol/L)3 ul3 ulPrimer 1(Primer 1(10100pmol）1 ul1 ulPrimer 2(Primer 2(10100pmol)1 ul 1 ulDNA DNA 模板模板(0.12ug)3 ul 3 ulTaq DNA聚合聚合酶酶（5U/ul）1 ul1 ul 总体体积 30 ul30 uldesign the reaction system&transfer the reagents in reaction tube Heat for 5 min at 95 to make the template DNA denaturated completely.Cycle parameters：95 50 sec 60 45 sec 72 50 secCycle times:30 Finally,incubate for 10 min at 72 to make all DNA fragments polymerize completely.reaction proceduresdetect the amplified DNA molecule by gel electrophoresis几种重要的几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCRPCR技术原理技术原理（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNADNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析PCRPCR的主要用途的主要用途