第三章-转基因技术基本理论(转基因动物)转基因食品与安全课件

定义：转基因动物是指以实验方法导入定义：转基因动物是指以实验方法导入外源基因，在染色体组内整合，并能外源基因，在染色体组内整合，并能遗传给后代的一类动物。遗传给后代的一类动物。第二节第二节 转基因动物转基因动物n n1968年，鸡的转基因获得成功，但未受到年，鸡的转基因获得成功，但未受到重视。重视。n n1976年，用反转录病毒感染法将病毒基因年，用反转录病毒感染法将病毒基因导入小鼠。导入小鼠。n n1980年，转基因动物技术年，转基因动物技术显微注射技显微注射技术创立。术创立。概概 述述n n自自1981年，第一次成功地将外源基因导入年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。动物胚胎，创立了转基因动物技术。n n1982年获得转基因小鼠。转入大鼠的生长年获得转基因小鼠。转入大鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为因而被称为“超级小鼠超级小鼠”。n n以后相继在以后相继在10年间报道过转基因兔、绵羊、年间报道过转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转基因动物的成功。基因动物的成功。概概 述述n n转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动，对整个生命科学产生全局性影响。流动，对整个生命科学产生全局性影响。n n动物转基因技术面临着一些问题：如动物转基因技术面临着一些问题：如生产生产效率低，基因整合效率不高，生产周期长，效率低，基因整合效率不高，生产周期长，成本高，转基因动物死亡率高，常出现不成本高，转基因动物死亡率高，常出现不育导致转基因难以传代，无法大规模生产育导致转基因难以传代，无法大规模生产。概概 述述第一只转基因小鼠第一只转基因小鼠转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物 -转基因羊，转基因羊，转基因羊，转基因羊，鱼鱼鱼鱼转入人转入人凝血因凝血因子子IX基基因的山因的山羊羊转入牛生转入牛生长发育基长发育基因因（bGH)的绵羊的绵羊转入生长激素基因的鲤鱼，转入生长激素基因的鲤鱼，上为转基因鱼，下为对照。上为转基因鱼，下为对照。转基因猪转基因猪n20082008年，由中国农业年，由中国农业大学李宁院士领导的大学李宁院士领导的研发团队获得，是我研发团队获得，是我国首例转抗体基因的国首例转抗体基因的转基因奶牛。转基因奶牛。n转基因奶牛乳腺生物转基因奶牛乳腺生物反应器，即转基因奶反应器，即转基因奶牛的牛奶含有人牛的牛奶含有人CD20CD20单克隆抗体，通过纯单克隆抗体，通过纯化该单克隆抗体制备化该单克隆抗体制备成癌症特效药，为全成癌症特效药，为全球球B B淋巴细胞瘤等癌淋巴细胞瘤等癌症患者带来福音。症患者带来福音。携带转携带转CD20基因的奶牛乳腺生物基因的奶牛乳腺生物反应器的牛反应器的牛 转基因山羊所产羊转基因山羊所产羊奶含有在人奶中发奶含有在人奶中发现的同样成分现的同样成分乳铁蛋白。他们表乳铁蛋白。他们表示，对于无法喂奶示，对于无法喂奶的母亲来说，这项的母亲来说，这项突破可以帮助宝宝突破可以帮助宝宝享受母乳所能带来享受母乳所能带来的全部益处。的全部益处。俄罗斯和白俄罗斯科学家正在培育俄罗斯和白俄罗斯科学家正在培育的转基因山羊的转基因山羊 上海消息上海消息:最柔软而又最坚固的防弹衣是用什么做的？蜘蛛丝；最柔软而又最坚固的防弹衣是用什么做的？蜘蛛丝；但野生的蜘蛛丝又何其少。但野生的蜘蛛丝又何其少。中科院上海生命科学院中科院上海生命科学院运用转基因方法，在国际上首次实现了绿运用转基因方法，在国际上首次实现了绿色荧光蛋白与蜘蛛拖牵丝融合基因在家蚕丝基因中的插入，并获色荧光蛋白与蜘蛛拖牵丝融合基因在家蚕丝基因中的插入，并获得了荧光茧。得了荧光茧。据国家据国家863计划生物高科技项目计划生物高科技项目“应用蛋白质工程改进蚕丝性能应用蛋白质工程改进蚕丝性能研究研究”负责人介绍：蜘蛛丝是自然界中力学性能最好的丝，能以负责人介绍：蜘蛛丝是自然界中力学性能最好的丝，能以柔克刚，甚至优于钢丝。蚕丝与蜘蛛丝的氨基酸组成很接近，能柔克刚，甚至优于钢丝。蚕丝与蜘蛛丝的氨基酸组成很接近，能否让家蚕吐出蜘蛛丝？课题组历经五年攻关，在家蚕丝基因重链否让家蚕吐出蜘蛛丝？课题组历经五年攻关，在家蚕丝基因重链中产生了部分蜘蛛拖牵丝。中产生了部分蜘蛛拖牵丝。选取蚕丝基因中有关强度的部分，用蜘蛛拖牵丝（蛛网的支撑丝，选取蚕丝基因中有关强度的部分，用蜘蛛拖牵丝（蛛网的支撑丝，是强度、弹性最好的部分）的基因进行替代。是强度、弹性最好的部分）的基因进行替代。为便于识别和鉴定，为便于识别和鉴定，科技人员在蜘蛛拖牵丝基因中融入肉眼可见的绿色荧光蛋白，结科技人员在蜘蛛拖牵丝基因中融入肉眼可见的绿色荧光蛋白，结果得到了荧光茧。果得到了荧光茧。英国研究者有新成果英国研究者有新成果转基因鸡能下抗癌蛋！转基因鸡能下抗癌蛋！曾以培养克隆羊多利的英国罗斯林研究所研究人员培育出曾以培养克隆羊多利的英国罗斯林研究所研究人员培育出一种转基因母鸡，这种母鸡下的蛋含有能够抗癌和抗其他疾病一种转基因母鸡，这种母鸡下的蛋含有能够抗癌和抗其他疾病的蛋白质。的蛋白质。英国媒体报道，研究人员首先选定了两种蛋白质，一种是英国媒体报道，研究人员首先选定了两种蛋白质，一种是能能用于治疗皮肤癌的抗体用于治疗皮肤癌的抗体miR24，它对关节炎也有疗效；另一，它对关节炎也有疗效；另一种是种是人体干扰素人体干扰素b-1a，它属于免疫系统蛋白，能够攻击肿瘤和，它属于免疫系统蛋白，能够攻击肿瘤和病毒，阻止病毒在细胞中复制。病毒，阻止病毒在细胞中复制。随后，研究人员培育出携带能随后，研究人员培育出携带能合成上述两种蛋白质的人类基因的病毒，并将病毒感染小鸡早合成上述两种蛋白质的人类基因的病毒，并将病毒感染小鸡早期胚胎。通过多次繁殖，最后培育出的转基因母鸡下的鸡蛋蛋期胚胎。通过多次繁殖，最后培育出的转基因母鸡下的鸡蛋蛋清中就携带了抗癌药物。清中就携带了抗癌药物。研究人员表示，通过工业方式生产上述两种蛋白耗时且成研究人员表示，通过工业方式生产上述两种蛋白耗时且成本高昂，新方式则不存在上述问题，但具体的药物开发工作可本高昂，新方式则不存在上述问题，但具体的药物开发工作可能要能要10年之后开展。年之后开展。外源目的基因的制备外源目的基因的制备外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系筛选所得的转基因动物品系（一）显微注射法（一）显微注射法 原理原理：用显微注射针将外源基因直接注入：用显微注射针将外源基因直接注入实验动物受精卵的精原核，使外源基因整实验动物受精卵的精原核，使外源基因整合入基因组。合入基因组。一、转基因动物的方法一、转基因动物的方法显微注射法显微注射法显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原核（一般是雄原核）。拔出显微注射针解原核（一般是雄原核）。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。除固定管的负压，操作完成。显微注射法是最早使用、至今仍在使用显微注射法是最早使用、至今仍在使用的较成熟的基因导入方法。其缺点是：整合的较成熟的基因导入方法。其缺点是：整合效率低（小于效率低（小于1%1%）；不能定点整合，影响基）；不能定点整合，影响基因表达和遗传稳定性；方法复杂、设备昂贵。因表达和遗传稳定性；方法复杂、设备昂贵。DNADNA微注射法微注射法微注射法微注射法 给受精卵打针给受精卵打针给受精卵打针给受精卵打针右边是牛的雄原核，这是在两者结合（受精）前非常短暂的右边是牛的雄原核，这是在两者结合（受精）前非常短暂的一瞬间：把目的基因注射雄一瞬间：把目的基因注射雄原原核内。这样能培育出转基因牛。核内。这样能培育出转基因牛。通通过过激激素素疗疗法法使使小小鼠鼠超超数数排排卵卵，一一般般情情况况下下5-10个个，超超数数排排卵卵为为35个；个；取出受精卵取出受精卵将纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内将纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内；将将2540个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；从从小小鼠鼠子子代代体体内内取取出出DNA样样品品，进进行行分分子子杂杂交交，鉴鉴定定转转基基因因的的整合与否及位点整合与否及位点；子代小鼠间进行繁殖，观察转基因是否遗传及表达子代小鼠间进行繁殖，观察转基因是否遗传及表达。DNADNA显微注射法的基本程序显微注射法的基本程序主要步骤主要步骤：n目的基因的克隆目的基因的克隆n用于显微注射的用于显微注射的DNA溶液的制备溶液的制备n卵母细胞和胚胎的准备卵母细胞和胚胎的准备n将将DNA用显微注射法注入原核中用显微注射法注入原核中n将注射过将注射过DNA的胚胎移植到适当的受体中的胚胎移植到适当的受体中n新动物外源新动物外源DNA的检测的检测DNA的制备与纯化的制备与纯化uuDNA构型和末端结构构型和末端结构uu载体载体uuDNA的长度与浓度的长度与浓度uu溶解溶解DNA的缓冲液的缓冲液uuDNA的纯度的纯度通通过过 DNA 显显微微注注射射 获获得得 转转基基因因小小鼠鼠显微注射法获得转基因动物的成活率显微注射法获得转基因动物的成活率动物药厂动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因通过转基因动物生产感兴趣的基因把把YFG放在放在乳球蛋白的启动子下乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体内植入借腹怀孕的母羊体内YFG在乳腺中表达在乳腺中表达乳汁中提纯乳汁中提纯YFG蛋白蛋白优点：优点：转基因范围广，转移基因大，可达数转基因范围广，转移基因大，可达数百百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全绝对安全。缺点：缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等；造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等；需显微操作仪，技术性要求高。需显微操作仪，技术性要求高。（二）胚胎干细胞介导技术（二）胚胎干细胞介导技术胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）是从是从早期胚胎内细胞团（早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多潜能能在体外培养的一种高度未分化的多潜能干细胞。干细胞。它是一种含正常二倍体染色体的具有发育它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。全能性的细胞。ES可从胚胎外胚层中分离获得，可体外培可从胚胎外胚层中分离获得，可体外培养。若将外源基因转入养。若将外源基因转入ES细胞后，再接种细胞后，再接种到胚胎中可产生转基因嵌合动物。到胚胎中可产生转基因嵌合动物。胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法 将外源基因导入体外培养的将外源基因导入体外培养的ES细胞，将这细胞，将这些细胞注射到小鼠胚泡腔中，部分些细胞注射到小鼠胚泡腔中，部分ES细胞可细胞可与内细胞团融合并参与其分化，形成嵌合体。与内细胞团融合并参与其分化，形成嵌合体。在嵌合过程中，带有外源基因的在嵌合过程中，带有外源基因的ES细胞细胞可能进入生殖系统，经杂交育种可得到纯合体，可能进入生殖系统，经杂交育种可得到纯合体，即为所需的转基因小鼠。即为所需的转基因小鼠。主要步骤：主要步骤：1.ES细胞的建立与维持细胞的建立与维持2.ES细胞的基因组操作细胞的基因组操作将外源基因移入到将外源基因移入到ES细胞基因组，既能细胞基因组，既能高效稳定表达，又不影响高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。细胞的各种功能。3.转基因转基因ES细胞的筛选细胞的筛选4.转基因转基因ES细胞的检测细胞的检测1.ES细胞的建立与维持细胞的建立与维持动物的准备：动物的准备：取受精之后取受精之后3.5天的母鼠分离鼠胚。天的母鼠分离鼠胚。胚胎的分离和初培养：胚胎的分离和初培养：3.5天孕鼠天孕鼠 鼠断颈处死鼠断颈处死 解剖小鼠取出胚胎解剖小鼠取出胚胎 体外培养胚胎体外培养胚胎 46天后，天后，离散离散ICM（早期胚胎内细胞团）。）。ICM的离散与的离散与ES的分离：的分离：分离分离ICM 酶解细胞团酶解细胞团 培养离散细胞培养离散细胞 ES细胞。细胞。ES细胞的扩增：细胞的扩增：离散离散ES细胞细胞 置四孔培养板中培养置四孔培养板中培养 ES细胞的常规培养：细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养常规培养与整合位点两端区域同与整合位点两端区域同源的两段源的两段DNA序列序列（HB1和和HB2）转入的目的基因转入的目的基因（TG）编码抗编码抗G418的新霉素的新霉素磷酸转移酶基因（磷酸转移酶基因（neor）两个胸苷激酶基因两个胸苷激酶基因（HSV-tk1和和HSV-tk2）2.基因插入基因插入3.转基因转基因ES细胞的筛选细胞的筛选正负选择法正负选择法 正选择法筛选出转基因整合型正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：细胞：通过物理方法将重组通过物理方法将重组DNA分子导入分子导入ES细胞，在含有抗菌素细胞，在含有抗菌素G418的培养基中，的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。负选择法筛选出特异整合型负选择法筛选出特异整合型ES细胞：细胞：如果非特异性整合发生，则两个如果非特异性整合发生，则两个tk基基因或其中一个基因很可能与因或其中一个基因很可能与TG和和neor一一起整合，这时用起整合，这时用GCV筛选，筛选，tk基因表达基因表达的胸苷激酶能使的胸苷激酶能使GCV转化成有毒的化合物，转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是负选反择。使细胞死亡。这是负选反择。5.转基因小鼠的繁育：转基因小鼠的繁育：正确整合的转基因胚胎干细胞经培正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后移入胚泡期的供体胚胎。将这些胚养后移入胚泡期的供体胚胎。将这些胚胎移植到代孕母鼠子宫内，繁育转基因胎移植到代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。小鼠。6.获得纯合的转基因鼠获得纯合的转基因鼠n n优点：优点：基因转移效率大大提高，且能进行基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。定位基因转移。n n缺点：缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动需要多代才能得到纯合的转基因动物。对于饲养成本高，产仔数较少的大型物。对于饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件需要投入大量资金。件需要投入大量资金。研究成果报道研究成果报道n n20062006年，日本研究人员在世界上首次年，日本研究人员在世界上首次年，日本研究人员在世界上首次年，日本研究人员在世界上首次将人类干细将人类干细将人类干细将人类干细胞植入大白鼠胚胎而培育出人体肾脏组织，胞植入大白鼠胚胎而培育出人体肾脏组织，胞植入大白鼠胚胎而培育出人体肾脏组织，胞植入大白鼠胚胎而培育出人体肾脏组织，该成该成该成该成果可望帮助解决肾脏移植供体不足的问题。果可望帮助解决肾脏移植供体不足的问题。果可望帮助解决肾脏移植供体不足的问题。果可望帮助解决肾脏移植供体不足的问题。n n研究人员认为，这项技术成熟后，可以将重症肾研究人员认为，这项技术成熟后，可以将重症肾研究人员认为，这项技术成熟后，可以将重症肾研究人员认为，这项技术成熟后，可以将重症肾功能衰竭患者的骨髓干细胞植入猪等体格较大的功能衰竭患者的骨髓干细胞植入猪等体格较大的功能衰竭患者的骨髓干细胞植入猪等体格较大的功能衰竭患者的骨髓干细胞植入猪等体格较大的动物的胚胎内，在干细胞分化成肾脏组织后再植动物的胚胎内，在干细胞分化成肾脏组织后再植动物的胚胎内，在干细胞分化成肾脏组织后再植动物的胚胎内，在干细胞分化成肾脏组织后再植回患者体内。这样，患者既不需要人工透析，也回患者体内。这样，患者既不需要人工透析，也回患者体内。这样，患者既不需要人工透析，也回患者体内。这样，患者既不需要人工透析，也不必等待肾脏捐献者。不必等待肾脏捐献者。不必等待肾脏捐献者。不必等待肾脏捐献者。（三）反转录病毒载体法（三）反转录病毒载体法原理原理：反转录病毒是一条单链：反转录病毒是一条单链RNA分子，分子，进入细胞后，在反转录酶作用下，反转进入细胞后，在反转录酶作用下，反转录为双链录为双链DNA分子，整合到细胞核基因分子，整合到细胞核基因组中。组中。反转录病毒有高效感染性和宿主细胞反转录病毒有高效感染性和宿主细胞DNA上的高度整合特性。上的高度整合特性。（四）生殖细胞载体法（四）生殖细胞载体法 包括精子载体法、卵子载体法、受精包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法等。卵载体法等。精子载体法是将成熟的精子与外源精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源受精后外源DNA整合至染色体中。整合至染色体中。此法成功率不高、效果不稳定，有待继此法成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。续探索、完善。二、用于动物转化的基因二、用于动物转化的基因（一）提高动物的生长性能（一）提高动物的生长性能 提高生长速度：生长激素（提高生长速度：生长激素（GH）基因是运）基因是运用最早的基因。用最早的基因。（二）提高动物的产毛性能（二）提高动物的产毛性能 胱氨酸是动物毛发生长的限速氨基酸，但胱氨酸是动物毛发生长的限速氨基酸，但反刍动物瘤胃微生物能分解胱氨酸：日粮反刍动物瘤胃微生物能分解胱氨酸：日粮添加胱氨酸不能提高毛产量。添加胱氨酸不能提高毛产量。（三）提高食用肉质量（三）提高食用肉质量 增加蛋白质含量，减少脂肪含量是提高食增加蛋白质含量，减少脂肪含量是提高食用肉品质的目标。用肉品质的目标。（四）提高乳汁营养的基因（四）提高乳汁营养的基因 使乳汁营养提高或获得自然情况下不具使乳汁营养提高或获得自然情况下不具备的营养成分，目前的研究方向：备的营养成分，目前的研究方向：1、改变酪蛋白含量改变酪蛋白含量：增加酪蛋白含量，使凝：增加酪蛋白含量，使凝乳更均匀牢固，利于提高奶酪产量。乳更均匀牢固，利于提高奶酪产量。2、减少乳糖含量减少乳糖含量：3、提高乳铁蛋白的含量提高乳铁蛋白的含量：乳铁蛋白可通过肠：乳铁蛋白可通过肠粘膜上的受体为人补充铁离子，还能促进粘膜上的受体为人补充铁离子，还能促进双歧杆菌生长。双歧杆菌生长。4、减少乳球蛋白减少乳球蛋白：乳球蛋白是一种过敏源。：乳球蛋白是一种过敏源。5、增加乳汁中溶菌酶的含量增加乳汁中溶菌酶的含量：可抑制细菌的：可抑制细菌的生长。生长。（五）用转基因动物生产基因工程药物（五）用转基因动物生产基因工程药物l为了使转基因动物体内能产生大量的目的蛋白，满为了使转基因动物体内能产生大量的目的蛋白，满足应用的需求，人们特别希望转基因动物能在某些足应用的需求，人们特别希望转基因动物能在某些腺体细胞内产生并被分泌到体外，而哺乳动物的乳腺体细胞内产生并被分泌到体外，而哺乳动物的乳腺就是一个理想的外分泌器官。腺就是一个理想的外分泌器官。l l生物反应器生物反应器生物反应器生物反应器：把目的基因片段在器官或组织中表达把目的基因片段在器官或组织中表达把目的基因片段在器官或组织中表达把目的基因片段在器官或组织中表达的转基因动物的转基因动物的转基因动物的转基因动物。几乎任何有生命的器官、组织都可几乎任何有生命的器官、组织都可几乎任何有生命的器官、组织都可几乎任何有生命的器官、组织都可经过人为驯化为生物反应器。经过人为驯化为生物反应器。经过人为驯化为生物反应器。经过人为驯化为生物反应器。如图如图如图如图l l1987年，美国科学家首先从年，美国科学家首先从转基因基因小鼠的乳小鼠的乳汁中汁中获得了治得了治疗急性心肌梗塞最好的溶血栓急性心肌梗塞最好的溶血栓药物物t-PA。l l十多年来，已有数百种十多年来，已有数百种产品在小鼠乳腺品在小鼠乳腺获得得高效表达，其中数种重要医用高效表达，其中数种重要医用产品已在大品已在大动物乳汁中生物乳汁中生产出来，即将投放市出来，即将投放市场。l l如山羊乳腺表达抗凝血如山羊乳腺表达抗凝血酶酶(AT)、t-PA均达到均达到6g/L，绵羊乳腺表达抗胰蛋白羊乳腺表达抗胰蛋白酶酶达达到到35g/L，家兔乳腺表达葡萄糖苷，家兔乳腺表达葡萄糖苷酶酶达到达到10g/L，猪乳腺表达蛋白达到，猪乳腺表达蛋白达到1g/L，奶牛，奶牛乳腺表达乳乳腺表达乳转铁蛋白达到蛋白达到3.5g/L。生物反应器选择的组织和器官要方便产生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器，动物血由此发展了动物乳腺生物反应器，动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。1、动物血液生物反应器动物血液生物反应器 外源基因在血液中表达的转基因动物叫血外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。液生物反应器。大家畜的血液容量较大，利用动物血液生产某些大家畜的血液容量较大，利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来编码产物可直接从血清中分离出来。2、动物膀胱生物反应器、动物膀胱生物反应器 是指外源基因在膀胱中表达的转基因动物生是指外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器。物反应器。膀胱表达一组膀胱表达一组尿血小板溶素的膜蛋白尿血小板溶素的膜蛋白，这种蛋白，这种蛋白在膀胱中表达具有专一性，而且它的基因是高度保守在膀胱中表达具有专一性，而且它的基因是高度保守的，将外源基因插入的，将外源基因插入5端调控序列中，就可以指导外端调控序列中，就可以指导外源基因在尿中表达。源基因在尿中表达。动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中表达，并从转基因动指导外源基因在乳腺中表达，并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。物的乳液中获取重组蛋白。3、动物乳腺生物反应器、动物乳腺生物反应器乳腺生物反应器的研究乳腺生物反应器的研究1987年，年，Gordon首次报道小鼠乳腺中表达首次报道小鼠乳腺中表达tPA蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成功报道实例已有功报道实例已有10多种，生产出抗胰蛋白酶、多种，生产出抗胰蛋白酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白因子乳铁蛋白、人凝血蛋白因子、蛋白质、蛋白质C等等药用蛋白。药用蛋白。1991年年Wright等在羊的乳腺中表达了人抗胰蛋等在羊的乳腺中表达了人抗胰蛋白酶基因。白酶基因。转基因动物转基因动物乳腺生物反应器的特点：乳腺生物反应器的特点：乳腺是自我封闭系统乳腺是自我封闭系统。表达的蛋白质不回。表达的蛋白质不回流到血液循环系统，避免外源基因表达的流到血液循环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响。蛋白质对动物本身的影响。乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。一头奶牛一年可生产乳蛋白一头奶牛一年可生产乳蛋白250300Kg。如果有百分之一的乳蛋白代换成医用蛋白，如果有百分之一的乳蛋白代换成医用蛋白，产量十分可观。产量十分可观。乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯提纯。表达的蛋白经过充分的修饰加工，。表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性接近天然具有稳定的生物活性。生物活性接近天然产品。产品。在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可可用常规技术繁殖生产群体。用常规技术繁殖生产群体。动物乳腺生物反应器的优点动物乳腺生物反应器的优点u产品质量稳定产品质量稳定u产品成本低产品成本低u研制开发周期短研制开发周期短u无污染无污染u高乳汁营养价值高乳汁营养价值u生产药用蛋白生产药用蛋白 动物乳腺生物反应器的应用动物乳腺生物反应器的应用三、转基因动物的遗传设计三、转基因动物的遗传设计（一）（一）原理原理：把外源目的基因及其相配套的启动子：把外源目的基因及其相配套的启动子按一定方式重组后，再导入受体细胞，并在其染按一定方式重组后，再导入受体细胞，并在其染色体特异位点上进行定向重组、整合与表达。色体特异位点上进行定向重组、整合与表达。（二）设计主要包括：（二）设计主要包括：1、调节系统设计调节系统设计：设计上常采用单基因调节系统：设计上常采用单基因调节系统2、启动子启动子/启动基因选配设计启动基因选配设计启动子启动子/启动基因是外源基因在受体细胞中能否正启动基因是外源基因在受体细胞中能否正确表达的关键。确表达的关键。四、转基因动物研究存在的问题四、转基因动物研究存在的问题n n 转基因动物的低效性转基因动物的低效性转基因动物的低效性转基因动物的低效性n n 转入基因引起完整基因突变转入基因引起完整基因突变转入基因引起完整基因突变转入基因引起完整基因突变n n 转入基因表达混乱转入基因表达混乱转入基因表达混乱转入基因表达混乱n n 病毒转基因对宿主的影响病毒转基因对宿主的影响病毒转基因对宿主的影响病毒转基因对宿主的影响n n 转基因动物模型与预期不符转基因动物模型与预期不符转基因动物模型与预期不符转基因动物模型与预期不符n n 乳腺反应器的完善乳腺反应器的完善乳腺反应器的完善乳腺反应器的完善n n 转基因动物及产品的认可转基因动物及产品的认可转基因动物及产品的认可转基因动物及产品的认可五、动物克隆五、动物克隆n n动物克隆和转基因动物的技术不同，动物克隆和转基因动物的技术不同，动物动物克隆技术是核移植的一种无性繁殖法。克隆技术是核移植的一种无性繁殖法。n n把经过处理的成年动物体细胞（如羊乳腺把经过处理的成年动物体细胞（如羊乳腺细胞）和另一只动物的去核卵细胞（如羊细胞）和另一只动物的去核卵细胞（如羊卵细胞）进行细胞融合，短期培养以后形卵细胞）进行细胞融合，短期培养以后形成胚胎细胞，再植入母体内，使发育成提成胚胎细胞，再植入母体内，使发育成提供体细胞遗传的那只动物的克隆。供体细胞遗传的那只动物的克隆。克隆羊克隆羊n n克隆羊的培育是核移植的无性繁殖，是体克隆羊的培育是核移植的无性繁殖，是体细胞的整套基因导入。细胞的整套基因导入。n n克隆羊只是从供体细胞中获得遗传物质，克隆羊只是从供体细胞中获得遗传物质，因此克隆羊是与供体羊遗传性状完全一模因此克隆羊是与供体羊遗传性状完全一模一样，这种通过无性繁殖方式进行动物克一样，这种通过无性繁殖方式进行动物克隆打破了传统的有性生殖概念。隆打破了传统的有性生殖概念。多利及其代孕母羊多利及其代孕母羊克隆动物研究进展克隆动物研究进展 1997年年2月，英国罗斯月，英国罗斯林研究所的胚胎学家伊恩林研究所的胚胎学家伊恩维尔穆特博士用一只维尔穆特博士用一只6岁母岁母羊的乳腺细胞与去核羊的羊的乳腺细胞与去核羊的卵母细胞融合，这一卵细卵母细胞融合，这一卵细胞经诱导形成胚胎，然后胞经诱导形成胚胎，然后移入母羊子宫内，结果产移入母羊子宫内，结果产下下6岁母羊的复制品岁母羊的复制品“多莉多莉”。“多莉多莉”是世界上首例是世界上首例采用成年哺乳动物的体细采用成年哺乳动物的体细胞作为供体细胞得到的。胞作为供体细胞得到的。在此之前的克隆动物都是在此之前的克隆动物都是用胚胎细胞作为供体细胞。用胚胎细胞作为供体细胞。克隆羊克隆羊“多莉多莉”和它生下的小羊和它生下的小羊克隆动物研究进展克隆动物研究进展 1997年年10月月3日，第一日，第一只体细胞克隆鼠卡缪丽娜出只体细胞克隆鼠卡缪丽娜出生。与克隆羊多利不同的是，生。与克隆羊多利不同的是，来自日本、英国、美国和意来自日本、英国、美国和意大利等国的科学家采用了提大利等国的科学家采用了提高克隆成功率的新技术，培高克隆成功率的新技术，培育出了多只克隆鼠，而且还育出了多只克隆鼠，而且还获得了获得了“克隆的克隆克隆的克隆”的第的第二及第三代克隆鼠。二及第三代克隆鼠。克隆动物研究进展克隆动物研究进展v2000年年1月，美国科学月，美国科学家宣称第一次成功地克家宣称第一次成功地克隆出灵长类动物隆出灵长类动物一一只名为只名为“泰特拉泰特拉”的克的克隆猴。克隆猴采用了胚隆猴。克隆猴采用了胚胎细胞克隆的技术。科胎细胞克隆的技术。科学家反复实验学家反复实验13次，只次，只有有“泰特拉泰特拉”幸运地降幸运地降生。生。可用于研究人员测可用于研究人员测试糖尿病等病症试糖尿病等病症。克隆动物研究进展克隆动物研究进展 猪易于繁殖，而猪易于繁殖，而且其器官在大小和功且其器官在大小和功能上与人体器官较为能上与人体器官较为接近。首批体细胞克接近。首批体细胞克隆猪共隆猪共5只，出生于只，出生于2000年年3月月5日。日。v这只体细胞克隆这只体细胞克隆兔，采用了妊娠兔，采用了妊娠期期20天的胎兔背天的胎兔背部皮肤进行培养，部皮肤进行培养，再将培养出的细再将培养出的细胞胚胎移入胞胚胎移入“代代孕孕”母兔的输卵母兔的输卵管内，在妊娠到管内，在妊娠到期后通过剖腹产期后通过剖腹产获得。获得。左为克隆兔，右为代孕兔左为克隆兔，右为代孕兔。这只名叫科这只名叫科毕的猫于毕的猫于2001年年成功克隆，从此成功克隆，从此开辟了宠物克隆开辟了宠物克隆市场，并最终形市场，并最终形成了克隆宠物的成了克隆宠物的国际性行业。国际性行业。克隆猫科毕克隆猫科毕 早在早在2001年时，年时，北京申办北京申办2008年奥年奥运会获得成功，当运会获得成功，当时他正在法国国立时他正在法国国立农艺研究院工作，农艺研究院工作，他发明的新克隆方他发明的新克隆方法得到了世界第一法得到了世界第一头非多莉羊技术的头非多莉羊技术的中期体细胞克隆牛。中期体细胞克隆牛。为了表示对中国申为了表示对中国申奥成功的祝贺，把奥成功的祝贺，把这头新诞生的克隆这头新诞生的克隆牛起名为牛起名为“奥运奥运2008”。英国英国自然自然杂志在新闻栏目刊登周琪手持火炬的照片杂志在新闻栏目刊登周琪手持火炬的照片 第三节第三节利用遗传改造的微生物生利用遗传改造的微生物生产食品产食品 宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞：常用有大肠杆第一类为原核细胞：常用有大肠杆第一类为原核细胞：常用有大肠杆第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞：常用有酵母、第二类为真核细胞：常用有酵母、第二类为真核细胞：常用有酵母、第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。丝状真菌、哺乳动物细胞等。丝状真菌、哺乳动物细胞等。丝状真菌、哺乳动物细胞等。1.1980年，以质粒和乳糖操纵子为基础建立年，以质粒和乳糖操纵子为基础建立的的E.Coli表达系统。表达系统。2.优点：遗传背景清晰，目标基因表达水平优点：遗传背景清晰，目标基因表达水平高，培养周期短。高，培养周期短。目前仍是基因工程研究目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。中采用最多的原核表达体系。3.缺点：表达目的基因无活性，蛋白质翻译缺点：表达目的基因无活性，蛋白质翻译后加工体系不完善。后加工体系不完善。大肠杆菌的表达产品大肠杆菌的表达产品多为胞内产物，提取困难。多为胞内产物，提取困难。一、大肠杆菌表达系统一、大肠杆菌表达系统基因工程生产胰岛素的原理（示意图）基因工程生产胰岛素的原理（示意图）基因表达的基本概念基因表达的基本概念n n基基因因表表达达是是目目的的基基因因在在导导入入的的细细胞胞内内转转录录成成mRNA，再再以以mRNA指指导导翻翻译译成成蛋蛋白白质。质。n n基基因因的的表表达达依依赖赖于于有有效效的的转转录录和和mRNA的的正正确确翻翻译译以以及及翻翻译译后后的的加加工工处处理理等等各各个个环环节节的的调调节节作作用用，其其中中转转录录最最为为关关键键，原原核核的的基基因因表表达达过过程程和和方方式式与与真真核核细细胞胞有有显显著不同。著不同。基因表达的基本条件基因表达的基本条件1.1.1.1.外源基因插入序列必须保持正确的方向。外源基因插入序列必须保持正确的方向。2.插插入入的的外外源源基基因因必必须须放放在在原原核核的的启启动动子子控控制制之之下下，也也就就是是使使原原核核的的RNA聚聚合合酶酶能能够够识识别插入的基因。别插入的基因。3.外外源源基基因因必必须须能能在在大大肠肠杆杆菌菌中中进进行行有有效效转转录录，并并且且能能有有效效地地进进行行翻翻译译，转转译译的的蛋蛋白白分分子子在在菌体内不受菌体蛋白酶的降解菌体内不受菌体蛋白酶的降解。、基因表达包括哪些过程、基因表达包括哪些过程?:转录和翻译转录和翻译?2、原核生物和真核生物基因表达的调控相同吗、原核生物和真核生物基因表达的调控相同吗温温故故知知新新基因表达的调控基因表达的调控 生物体内每个细胞都含有该物种的生物体内每个细胞都含有该物种的一整套基因一整套基因，但是，这些基因并不是同时都在表达。比如单细胞但是，这些基因并不是同时都在表达。比如单细胞的细菌，就能够根据环境的变化，的细菌，就能够根据环境的变化，开启或关闭某些开启或关闭某些基因基因，以便迅速合成它所需要的蛋白质，停止合成，以便迅速合成它所需要的蛋白质，停止合成它不需要的蛋白质。多细胞生物体内基因的表达更它不需要的蛋白质。多细胞生物体内基因的表达更为复杂。生物体内的基因之所以能够有序地表达，为复杂。生物体内的基因之所以能够有序地表达，是因为是因为细胞内存在着对基因表达的调控机制细胞内存在着对基因表达的调控机制，这种，这种调控机制是生物体所不可缺少的。调控机制是生物体所不可缺少的。、大肠杆菌一般以哪种糖作为碳元素的来源、大肠杆菌一般以哪种糖作为碳元素的来源原原核核生生物物基基因因表表达达的的调调控控?、当大肠杆菌生活的环境中没有葡萄糖而有当大肠杆菌生活的环境中没有葡萄糖而有乳糖时乳糖时，会有何反应，会有何反应?、当从大肠杆菌生活的环境中去除乳糖后又当从大肠杆菌生活的环境中去除乳糖后又 有何反应有何反应?4、为什么乳糖能对半乳糖苷酶基因的表达、为什么乳糖能对半乳糖苷酶基因的表达 起到诱导作用呢起到诱导作用呢?5、注意了解操纵基因对、注意了解操纵基因对 结构基因的结构基因的“开关开关“作用。作用。真真核核生生物物基基因因表表达达的的调调控控真核细胞基因结构和原核细胞基因有真核细胞基因结构和原核细胞基因有哪些异同哪些异同原原核核细细胞胞 真真核核细细胞胞不不 同同 点点编码区是编码区是连续的连续的编码区是间隔的、编码区是间隔的、不连续的不连续的相相 同同 点点都由能够编码蛋白质的编码区和具都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的有调控作用的非编码区组成的?二、二、酵母表达系统酵母表达系统优点：具有完善的翻译后加工系统，可优点：具有完善的翻译后加工系统，可优点：具有完善的翻译后加工系统，可优点：具有完善的翻译后加工系统，可表达出多种用原核微生物无法表达的表达出多种用原核微生物无法表达的表达出多种用原核微生物无法表达的表达出多种用原核微生物无法表达的生物活性蛋白。生物活性蛋白。生物活性蛋白。生物活性蛋白。缺点：有时表达量较低，要达到生产水缺点：有时表达量较低，要达到生产水缺点：有时表达量较低，要达到生产水缺点：有时表达量较低，要达到生产水平还需改进。平还需改进。平还需改进。平还需改进。真真核核生生物物基基因因表表达达的的调调控控真核生物基因表达调控的过程与原核生物真核生物基因表达调控的过程与原核生物有许多有许多共同共同之处。例如，在真核生物结构基之处。例如，在真核生物结构基因的侧翼序列上，同样存在着许多不同的因的侧翼序列上，同样存在着许多不同的调调控序列控序列。真核生物通过特异性蛋白与某些调。真核生物通过特异性蛋白与某些调控序列的结合与否，来调控基因的转录。控序列的结合与否，来调控基因的转录。原核生物基因的转录和翻译有何特点原核生物基因的转录和翻译有何特点原核生物基因的转录和翻译通常是在同原核生物基因的转录和翻译通常是在同一时间同一地点进行的，即一时间同一地点进行的，即在转录未完成之在转录未完成之前翻译便开始进行。前翻译便开始进行。?真真核核生生物物基基因因表表达达的的调调控控转录产生的转录产生的mRNA必须经过加工，将内必须经过加工，将内含子转录部分含子转录部分剪切剪切掉，掉，将外显子转录部分将外显子转录部分拼拼接接起来，才能成为有起来，才能成为有功能的成熟的功能的成熟的mRNA 真核生物基因的真核生物基因的转录转录和翻译和翻译具有时间和空具有时间和空间上的分隔。间上的分隔。第四节第四节 转基因食品生产的工艺流程转基因食品生产的工艺流程一、转基因食品的生产步骤一、转基因食品的生产步骤1.从供体细胞中辨认能体现所期望特征的目从供体细胞中辨认能体现所期望特征的目的基因；的基因；2.目的基因的制取；目的基因的制取；3.基因载体的选择与构建；基因载体的选择与构建；4.目的基因与载体目的基因与载体DNA的拼接；的拼接；5.将重组体导入受体细胞；将重组体导入受体细胞；转基因食品的生产步骤转基因食品的生产步骤6.短时间培养转化细胞，以扩增短时间培养转化细胞，以扩增DNA 重组分重组分子或使其整合到受体细胞基因组中。子或使其整合到受体细胞基因组中。7.筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。效稳定表达的基因工程菌或细胞。8.外源基因的表达和产物的分离纯化。外源基因的表达和产物的分离纯化。按原核表达和真核表达系统分化为发按原核表达和真核表达系统分化为发酵工程、转基因植物、转基因动物、动物酵工程、转基因植物、转基因动物、动物细胞反应器和基因治疗。细胞反应器和基因治疗。二、转基因食品生产工艺图二、转基因食品生产工艺图供体细胞供体细胞外源基因外源基因构建载体构建载体（质粒、噬菌体）（质粒、噬菌体）连接连接DNA重组分子重组分子受体细胞受体细胞转化与扩增转化与扩增重组转化子重组转化子重组转化子重组转化子鉴定与表达鉴定与表达原核细胞表达原核细胞表达真核细胞真核细胞表达表达植物表达植物表达动物表达动物表达发酵工程发酵工程提取产品提取产品转基因植物转基因植物提取产品或提取产品或作物良种作物良种转基因动物转基因动物动物动物良种良种生物反生物反应器应器