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天津医科大学生化教研室天津医科大学生化教研室 解解 用用 虹虹 重组重组DNA技术技术教学要求教学要求1.1.熟悉基因工程（重组熟悉基因工程（重组DNADNA技术）产生的理论技术）产生的理论2.2.和技术基础，以及基因工程开展的积极意和技术基础，以及基因工程开展的积极意义。义。2.2.掌握以质粒为代表的载体的结构特点和实际掌握以质粒为代表的载体的结构特点和实际应用。应用。3.3.掌握以限制性核酸内切酶为重点的一系列工掌握以限制性核酸内切酶为重点的一系列工具酶和宿主细胞的概念，特点和实际应用。具酶和宿主细胞的概念，特点和实际应用。4.4.熟悉完整的基因工程的过程，步骤和原理。熟悉完整的基因工程的过程，步骤和原理。5.5.了解重组了解重组DNADNA技术在医学中的应用和其广泛应技术在医学中的应用和其广泛应用前景。用前景。重组DNA技术第一节第一节 概述概述第二节第二节 重组重组DNA基本原理基本原理第三节第三节 重组重组DNA技术在医学中技术在医学中 的应用的应用第一节 概述一一.基因工程建立和发展的基因工程建立和发展的 基础基础二二.面临新挑战，解决新问面临新挑战，解决新问 题题三三.相关的基本概念相关的基本概念 一一.基因工程建立和发展的基础基因工程建立和发展的基础 1.分子生物学的理论发展 DNA结构和功能的深入认识 遗传信息中心法则的确立2.分子生物学的技术进步 限制性内切酶等工具酶的发现 载体的发现和构建3.分子生物学的发展要求 基因的结构和序列 基因功能和调节 新DNA分子的构建二.面临新挑战 解决新问题1.基因的结构基因的结构2.基因的功能基因的功能3.基因表达调节基因表达调节4.基因工程产品基因工程产品5.构建新基因构建新基因 三三.相关的基本概念相关的基本概念1.1.克隆克隆2.2.目的基因目的基因3.3.载体载体4.4.工具酶工具酶5.5.宿主细胞宿主细胞1.1.克隆（克隆（clone clone）1.克隆是指来自同一始祖的一群相同分子(如DNA)、细菌(如大肠杆菌)、细胞(如杂交瘤细胞)或动物(如羊)的集合。2.这种由单一始祖获取大量副本或拷贝的过程称为克隆化3.分子生物学和分子遗传学所涉及的分子克隆专指DNA克隆2.2.目的基因目的基因(target DNA)(target DNA)1.目的基因就是我们感兴趣，待研 究或应用的基因，目的基因又称 目的DNA.2.目的基因可分为两种类型 基因组DNA cDNA (互补 DNA)3.3.载体载体(vector)(vector)1.载体的概念载体的概念2.载体应具备的特征载体应具备的特征3.常见的基因工程载体常见的基因工程载体.载体的概念载体的概念 载体是指能够容纳目的基因而载体是指能够容纳目的基因而且具有自我复制能力，同时又能携且具有自我复制能力，同时又能携带目的基因进入宿主细胞，并能大带目的基因进入宿主细胞，并能大量扩增目的基因或能表达有意义的量扩增目的基因或能表达有意义的蛋白质的蛋白质的DNA分子。前者称克隆载分子。前者称克隆载体，后者称表达载体。体，后者称表达载体。.理想载体应具备的特征理想载体应具备的特征1.自身含有复制子，具有自主复制的能力2.在宿主细胞能够稳定地遗传3.有合适的分子量，易于操作但又能容纳较大分子的目的基因，同时便于与宿主染色体分离4.具有便于应用的多克隆位点，便于目的基 5.因的插入5.具有一个或多个遗传标致作为筛选标记6.作为表达载体应具有与宿主细胞相适应的7.启动子等调节元件.常用的基因工程载体常用的基因工程载体 质粒 噬菌体 黏粒 病毒 穿梭质粒 其他载体：(BAC和 YAC ).质粒质粒(plasmid)1.质粒是存在于细菌染色体外的，具有在宿主细胞内自主复制能力的环状双链DNA分子。2.工程质粒载体不是天然质粒，是 人工构建的质粒。通过人工构建赋予了质粒许多作为基因载体的特征。质粒质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNADNA分子。大小约为分子。大小约为数数千碱基对。常千碱基对。常有有1 1 3 3个抗药个抗药性性基因，以利于基因，以利于筛筛选。选。质粒载体的基本特征质粒载体的基本特征1.具有复制起始点和自主复制能力具有复制起始点和自主复制能力2.细胞分裂时，能稳定地遗传给子代细胞分裂时，能稳定地遗传给子代3.带有独特的遗传信息（抗药性等）带有独特的遗传信息（抗药性等）4.具有酶切位点（携带外源具有酶切位点（携带外源 DNA）5.分子量远小于染色体（便于分离）分子量远小于染色体（便于分离）6.一般可接受小于一般可接受小于10 Kb的外源基因的外源基因克隆载体克隆载体pUC18/19表达载体表达载体pGEX-3X.噬菌体噬菌体 (bacteriophage)(bacteriophage)1.噬菌体是细菌病毒，它可以感染噬菌体是细菌病毒，它可以感染 细菌。细菌。2.噬菌体由基因组噬菌体由基因组DNA和包装蛋白和包装蛋白质组成。质组成。3.噬菌体噬菌体DNA一般可有双链线状一般可有双链线状DNA（如（如 噬菌体）和单链环状噬菌体）和单链环状DNA（如（如M13）.其它载体其它载体 黏粒 病毒 穿梭质粒 其他载体：(BAC和 YAC )4.4.工具酶工具酶1.工具酶是能对基因进行加工和处理的酶类2.常用的工具酶有 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 逆转录酶 其它的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.定义定义2.分类分类3.命名命名4.酶切位点酶切位点5.酶切末端酶切末端.限制性内切酶限制性内切酶-定义定义1.能识别和切割DNA双链内部特异 核苷酸序列的一类核酸内切酶。2.核酸内切酶是原核细胞识别和破坏外源DNA分子的初级免疫形式。3.原核细胞具有限制性/甲基化系统，通过甲基化保护自身的DNA不被破坏.限制性内切酶分类限制性内切酶分类1.限制性内切酶可分为三类：类，类和类。2.基因重组技术中使用的是类。3.类限制性内切酶的酶切位点多在识别的序列内。.限制性核酸内切酶命限制性核酸内切酶命名名 EcoR E co R 1.核酸内切酶命名一般由四部分组成。2.第一部分一个斜体的大写英文字母表示来源菌的属（Escherichia ）。3.第二部分二个斜体的小写英文字母表示来源菌的种（coli）4.第三部分正写英文字母表示来源菌的株R5.第四部分大写罗马数字表示发现的顺序.酶切位点酶切位点-回文结构回文结构1.类核酸内切酶识别位点或称识别序列多为回文结构2.所谓回文结构即DNA的两条链从5向3 阅读时具有相同的序列3.如 Hin d Bam H .酶切末端酶切末端1.经核酸内切酶切割后可产生二类末端：黏性末端和平端2.黏性末端可分为 5突出黏性末端和 3突出黏性末端限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：钝性末端钝性末端(blunt end)(blunt end)粘性末端粘性末端(sticky end)(sticky end)5-端突出端突出粘性末端粘性末端 3-端突出端突出 限制性核酸内切酶识别序列长度为限制性核酸内切酶识别序列长度为48个个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end），可用连接酶连接。），可用连接酶连接。.DNA聚合酶聚合酶 1.DNA聚合酶是以DNA为模板合成DNA的聚合酶2.DNA聚合酶只能催化DNA 3羟基与 dNTP 5磷酸基间3，5磷酸二酯键的形成，不能催化d NTP间的连接3.TaqDNA聚合酶是从嗜热水生菌分离获得的DNA聚合酶，广泛应用于PCR.DNA连接酶连接酶1.DNA连接酶是催化二个DNA片段之间相连接的酶，是催化一个DNA片段的3羟基和另一个DNA片段的5磷酸基间形成35-磷酸二酯键的酯化连接酶2.DNA连接酶既能连接黏性互补末端，也能连接平端3.基因工程中常用的是T4DNA连接酶.逆转录酶逆转录酶1.逆转录酶是以为RNA模板指导合成 DNA的DNA聚合酶2.逆转录酶广泛应用于cDNA的合成3.基因工程中常用的是从鸟类骨髓瘤母细胞病毒获取的逆转录酶，简称AMV(Avian Myeloblastosis Virus).其它的工具酶其它的工具酶1.碱性磷酸酶2.多核苷酸激酶3.末端转移酶5.5.宿主细胞宿主细胞1.宿主细胞分为原核细胞与真核细胞，由于原核细胞操作简单，遗传背景清楚，故常用的为大肠杆菌等原核细胞。2.宿主细胞特别是宿主菌要安全，不会造成疾病的传播。3.具有限制酶和重组酶缺陷。4.操作简便。5.5.常用的大肠工程菌:E.coli DH5第二节 重组DNA的基本步骤一一.目的基因的获得与修饰目的基因的获得与修饰二二.载体的选择与修饰载体的选择与修饰三三.目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接四四.宿主细胞的选择与处理宿主细胞的选择与处理五五.重组体的导入与筛选和鉴定重组体的导入与筛选和鉴定六六.重组基因的表达重组基因的表达重组重组DNADNA技术基本步骤技术基本步骤一一.目的基因的获得与修饰目的基因的获得与修饰1.目的基因的获得目的基因的获得 .化学合成DNA片段 .基因组DNA的制备 .反转录合成cDNA .PCR扩增DNA片段2.2.目的基因的修饰目的基因的修饰 .选择限制性内切酶并酶切选择限制性内切酶并酶切 .导入适宜的酶切位点导入适宜的酶切位点 .末端修饰加入互补末端末端修饰加入互补末端 目的基因的获取目的基因的获取1.化学合成法化学合成法用于已知序列，或可推导出序列的基因用于已知序列，或可推导出序列的基因2.基因组基因组DNA基因组基因组DNA文库（文库（genomic DNA library）3.cDNAcDNA文库（文库（cDNA library）4.聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）基因组基因组DNADNA文库文库存在于转化细菌内，存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNADNA的集合。的集合。简称简称G G文库。文库。cDNAcDNA文库文库用细胞总用细胞总mRNAmRNA制备全套双链制备全套双链cDNAcDNA后，后，建立的基因文库。简称建立的基因文库。简称c c文库。文库。PCRPCR是根据是根据DNADNA复制的原理，在体外复制的原理，在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组利用酶促反应获得特异序列的基因组DNADNA或或cDNAcDNA的专门技术。的专门技术。PCR PCR的反应体系：模板的反应体系：模板DNADNA、特异、特异性引物、性引物、DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP及含有及含有MgMg2 2的缓冲液。的缓冲液。Exon3 intron3 Exon4PaPbPd PcPCR上游片段上游片段ABABPCR下游片段下游片段CDCDPCR全编码序列全编码序列PaPd外显子拼接法扩增人外显子拼接法扩增人ApoC成熟肽编码基因成熟肽编码基因限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：钝性末端钝性末端(blunt end)(blunt end)粘性末端粘性末端(sticky end)(sticky end)二二.克隆载体的选择与修饰克隆载体的选择与修饰1.克隆载体的选择 .克隆载体或表达载体 .插入片段的大小 .实验室的条件2.克隆载体的修饰 .限制性核酸内切酶的选择与酶切 .配伍末端的形成限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：钝性末端钝性末端(blunt end)(blunt end)粘性末端粘性末端(sticky end)(sticky end)三 外源基因与载体的连接 1.平端末端连接 2.黏性末端连接 3.同聚物加尾连接 4.人工接头连接 5.相关的技术问题 1.平端连接平端连接 限制性内切酶作用产生的平端限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端粘端经特殊酶处理变为平端 -CCCGGG-GGGCCC-Sma -CCC GGG-GGG CCC-BamHBamH3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接由末端转移酶作用，在由末端转移酶作用，在DNA片段末端片段末端 加上同聚物序列，制造出粘性末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。再连接。-ATGCGCTATTTTTT GCTAATGC-TACGCGAT AAAAAACGATTACG-4.人工接头 人工接头人工接头(linker)是含有特定是含有特定限制性核酸内切酶酶切位点的寡限制性核酸内切酶酶切位点的寡核苷酸片段。将人工接头与平端核苷酸片段。将人工接头与平端目的目的DNA片段连接后片段连接后,使用相应使用相应的限制性核酸内切酶酶切可以产的限制性核酸内切酶酶切可以产生黏性末端生黏性末端,便于连接便于连接.5.相关的技术问题 1.目的基因与载体的比例和浓度 2.连接酶的应用 3.重组条件的优化 4.自身连接的问题(双酶切)pUC18 质粒质粒SmaI EcoEcoRR ApoCApoCT4DNA连接酶连接酶EcoEcoRR pUC18/mApoC克隆载体克隆载体pGEX-mApo CpGEX.3X质粒 4952bp从从pUC18-ApoC上回收上回收EcoRI、BamH酶切得酶切得ApoC片段片段T4-DNA连接酶多克隆位点EcoR IBamH ISmaIEcoR I、B amH I 酶切处理回回收酶切片段 pUC18质粒质粒 pUC18 质粒质粒 T4-DNA连接酶连接酶SmaEcoREcoR附图附图1 pUC18-mApoC克隆策略克隆策略pUC18-mApoC小鼠肝组织总小鼠肝组织总RNA的提取的提取RT-PCRApoC T4-DNA连接酶 EcoR I BamH I SmaIpGEX.3X质粒 4952bpEcoR I、BamH I 酶酶切切处处理理 多克隆位点回收酶切片段图图 pGEX-mApoC克隆策略克隆策略ppGEX-mApoCmApoCEcoR I、BamH I 酶切处理四四 宿主细胞的选择与处理宿主细胞的选择与处理 1.受体菌的选择 2.感受态细菌的制备 3.同聚物加尾连接 4.人工接头连接 5.相关的技术问题 1.受体菌的条件受体菌的条件安全宿主菌安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态大肠杆菌多为由大肠杆菌K-12改造 的工程菌，如E Coli DH52.感受态细胞的制备感受态细胞的制备1.宿主细胞经过一定的处理，使其处于容易接受外源DNA的状态，成为感受态细胞2.常用的宿主细胞为大肠杆菌工程菌,如E Coli DH53.大肠杆菌感受态细胞的制备多为使用CaCL2处理，通过处理使细胞膜的结构发生变化，通透性增强，从而增加了摄取外源DNA的能力五五.重组体的导入与筛选鉴定重组体的导入与筛选鉴定1.重组体的导入2.转化3.转染4.感染 2.重组体的筛选3.遗传性状的获得与丢失4.营养缺陷互补1.重组体的导入重组体的导入 依照载体和宿主细胞的特点，重组体依照载体和宿主细胞的特点，重组体的导入有不同的种类。的导入有不同的种类。1.质粒载体重组体导入原核细胞(大肠杆菌)习惯上称为转化（transformation ）2.质粒等非病毒载体重组体导入真核细胞的过程成为转染（transfection）3.病毒载体重组体导入宿主细胞的过程称为感染（infection）2.重组体的筛选重组体的筛选 重组重组DNA导入受体菌，并不是导导入受体菌，并不是导入了所有的受体菌。经过培养使特定入了所有的受体菌。经过培养使特定的受体菌大量繁殖，再通过特定的技的受体菌大量繁殖，再通过特定的技术手段将含有目的基因的菌落与不含术手段将含有目的基因的菌落与不含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程或技术手段即为筛选一过程或技术手段即为筛选（screening）或选择（）或选择（selection）。）。重组细菌（细胞）的筛选重组细菌（细胞）的筛选1.利用宿主细胞遗传学表型的筛选利用宿主细胞遗传学表型的筛选 遗传学性状的获得 遗传学形状的丢失2.利用营养缺陷型互补筛选法利用营养缺陷型互补筛选法 插入互补弥补了原有的基因缺陷 插入失活丧失了原有的基因特征3.利用核酸分子杂交或利用核酸分子杂交或PCR遗传性状的获得遗传性状的获得 抗药性抗药性 复制功能复制功能 抗菌素培养抗菌素培养 -宿主大宿主大 肠杆菌肠杆菌 质质 粒粒 载载 体体 转转 化化 细细 胞胞 遗传性状的丧失遗传性状的丧失 抗药性抗药性 复制能力复制能力 抗菌素培养抗菌素培养 -含含 质质 粒载粒载体体 细细 胞胞 含含 重重 组组体体 细细 胞胞 插入互补筛选法插入互补筛选法 重组体的导入弥补了宿主细胞的原有 缺陷 1.宿主菌缺乏合成组氨酸的能力 2.重组体具有合成组氨酸的基因 3.重组体的导入弥补了宿主菌的基因 缺陷利用缺乏组氨酸的培养基可以 筛选成功导 入重组体的宿主菌 Structure of lac OperonRegulatory RegionsPromoter:site where the RNA polymerase bindsOperator:binding site for the repressor proteinCRP binding site:site where the cAMP receptor protein(CRP)bindsCoding regionsZ:codes for b b-galactosidase,which hydrolyzes lactose into glucose and galactoseY:codes for permease,which allows lactose to enter the cellA:codes for transacetylase,which is not well understoodStructure of lac Operon-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 N-端的端的片段片段1.pUC 系列等载体含有 LacZ的调控序列和片段 基因2.外源基因插入LacZ的N-端片段,使片段不能 合成-半乳糖苷酶无活 性3.空载体的导入不干扰N-端的片段的合成,-半 乳糖苷酶无活性C-端的端的片段片段大肠杆菌宿主菌染色体含有表达LacZ片段的基因插入失活的筛选插入失活的筛选 LacZ 底物(X-gal)为无色物质空载体不干扰LacZ酶的活性,底物经LacZ酶催化下生成不溶性的兰色产物,使菌落显示兰色重组体干扰LacZ酶的活性,底物未经LacZ酶催化不能生成不溶性的兰色产物,菌落显示白色 利用核酸杂交或利用核酸杂交或DNA测序测序1.Southern blot (DNA)2.Northern blot (RNA)3.Western blot (protein)4.DNA sequence第三节第三节 基因重组与分子医学基因重组与分子医学1.基因诊断 镰刀状红细胞贫血 H1N1流感2.基因治疗 ADA缺陷症 今又生1.3.疾病相关基因功能研究 2.基因敲除3.转基因 4.4.基因工程产品5.胰岛素6.基因工程疫苗1.基因诊断基因诊断1.聚合酶链反应限制性酶切片段多态性(PCR-RFLP)2.PCR-RFLP的试验步骤3.3.PCR-RFLP基因诊断镰刀状红细胞贫血 1.PCR-RFLP1.聚合酶链反应-限制酶切片段长度多态性简称PCR-RFLP 2.PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymor-phism)2.PCR-RFLP试验步骤试验步骤1.目的基因的扩增2.扩增片段的酶切3.酶切产物的电泳4.多态性（突变）的确定3.镰刀状贫血的诊断镰刀状贫血的诊断2.基因治疗基因治疗1.腺嘌啉核苷酸的分 解代谢2.腺苷脱氨酶的功能3.腺苷脱氨酶缺乏的 影响4.常染色体隐性遗传5.人类第一个成功基 因治疗的疾病ADA的基因治疗的基因治疗1.克隆具有生物学功能的人ADA基因。2.将ADA基因与基因病毒载体相连接。3.从患儿机体抽取和分离靶细胞淋巴细胞。4.将携带有人ADA基因的病毒感染淋巴细胞，5.完成基因的转移。5.检测和分离具有ADA基因功能的淋巴细胞，并确认其安全可靠。6.将安全可靠并具有功能的淋巴细胞回输到患儿身体。ADA治疗过程治疗过程 在这次基因治疗中，科学家从Ashanthi身上抽取血液并分离得到少量 白细胞，进行体外培养扩增。然后，他们利用改造后的逆转录病毒将正常的人ADA基因转移到靶细胞里，使白细胞代偿性地表达了ADA蛋 白。十天以后，这种经过“修饰”的白细胞通过静脉缓缓地输回到女孩体中。通过这种治疗方式，Ashanthi的免疫系统功能提高了40%以上。P53 的治疗价值的治疗价值今又生今又生通用名通用名：重组人p53腺病毒注射液英文名英文名：Recombinant Human Ad-p53 Injection汉语拼音汉语拼音：Chongzuren p53 Xianbingdu Zhusheye注册商标注册商标：今又生（Gendicine）主要组成成分主要组成成分：重组腺病毒-p53基因颗粒 性状性状 本品为淡白色澄明液体3.疾病相关基因功能研究疾病相关基因功能研究1.转基因动物2.参见21章第四节转基因动物2.基因剔除3.参见21章第四节基因剔除技4.术4.基因工程产品基因工程产品1.胰岛素胰岛素2.2.工程疫苗工程疫苗再见END
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