第十章-电泳-1课件

电泳电泳电泳（电泳（electrophoresis）本章提要：本章提要：基本原理基本原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 高效毛细管电泳高效毛细管电泳 双向电泳（二维电泳）双向电泳（二维电泳）电泳电泳电泳：电泳：定义：带电颗粒在电场作用下，向相反电极移动的现定义：带电颗粒在电场作用下，向相反电极移动的现象，称为象，称为电泳电泳。电泳电泳第一节第一节 基本原理基本原理 q E 6r 电泳电泳 q E 6r 带电粒子在电场中的泳动速度：带电粒子在电场中的泳动速度：与电场强度与电场强度E和带电量和带电量q成正比；成正比；与粒子半径及介质粘度成反比。与粒子半径及介质粘度成反比。电泳电泳泳动度泳动度泳动度（泳动度（m）或迁移率：单位电场中的泳动速度或迁移率：单位电场中的泳动速度 d/t d Lm =(m2/V Vs)E V/L V t电泳电泳影响迁移速度的因素影响迁移速度的因素1、颗粒性质：颗粒性质：颗粒直径、形状、所带电量颗粒直径、形状、所带电量 2 2、电场强度电场强度E E：E E越大，则泳动速度越快越大，则泳动速度越快 电泳电泳3 3、溶液性质：溶液性质：pH pH：离子强度：在离子强度：在0.020.020.20.2之间较为适宜之间较为适宜 粘度：迁移速度与介质粘度：迁移速度与介质粘度成反比粘度成反比电泳电泳4、电渗：、电渗：因支持物上存在离子基团，它会吸引溶液中的离子。在因支持物上存在离子基团，它会吸引溶液中的离子。在电场中，溶液层相对于固定固体有相对移动，这种现电场中，溶液层相对于固定固体有相对移动，这种现象称为象称为电渗电渗即：溶液层的泳动现象。即：溶液层的泳动现象。电泳电泳 当颗粒泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒泳动速度；当颗粒泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒泳动速度；当颗粒泳动方向与电渗方向相反时，降低颗粒泳动速度；当颗粒泳动方向与电渗方向相反时，降低颗粒泳动速度；当电场力电渗力时，颗粒泳动速度为零。当电场力电渗力时，颗粒泳动速度为零。电泳电泳5、焦耳热、焦耳热QI2 R*t -电泳过程中放出的热量电泳过程中放出的热量电泳电泳6、筛孔、筛孔支持物筛孔会影响泳动速度，筛孔过小支持物筛孔会影响泳动速度，筛孔过小 电泳电泳第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳:polyacrylamide gel electrophoresis,简称：简称：PAGE 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物；以聚丙烯酰胺凝胶为支持物；是目前研究蛋白质、核酸等大分子的重要工具。是目前研究蛋白质、核酸等大分子的重要工具。电泳电泳PAGE的优点的优点 孔径大小可调节：具有筛分效应；孔径大小可调节：具有筛分效应；PAG凝胶机械强度好，弹性大，非离子型，电渗力低，凝胶机械强度好，弹性大，非离子型，电渗力低，分辨率高，重复性好；分辨率高，重复性好；应用广。应用广。电泳电泳2.1 聚丙烯酰胺凝胶的合成聚丙烯酰胺凝胶的合成2.1.1 聚合反应聚合反应聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体：丙烯酰胺（单体：丙烯酰胺（Acr）交联剂：亚甲基双丙烯酰胺（交联剂：亚甲基双丙烯酰胺（Bis）电泳电泳2.1.2 催化系统催化系统（1）化学催化系统）化学催化系统引发剂：过硫酸铵引发剂：过硫酸铵（NH4）2S2O8，简称简称AP加速剂：四甲基乙二胺，简称加速剂：四甲基乙二胺，简称TEMED电泳电泳（2）光催化系统）光催化系统引发剂：核黄素引发剂：核黄素Vb2（光激发）光激发）电泳电泳 交联度交联度C：a/b值对凝胶筛孔、透明度、机械强度有影响值对凝胶筛孔、透明度、机械强度有影响电泳电泳2.2 PAGE的分离原理的分离原理2.2.1 盘状电泳的装置（不连续垂直柱状凝胶电泳）盘状电泳的装置（不连续垂直柱状凝胶电泳）电泳电泳系统由系统由3种不连续的凝胶组成：种不连续的凝胶组成：样品胶浓缩胶分离胶电泳电泳Tris(+)Gly(-)电泳电泳2.2.2 作用原理作用原理（以分离酸性蛋白质的碱性（以分离酸性蛋白质的碱性（高（高pH）系统为例）系统为例）在盘状电泳过程中，有三种物理效应：在盘状电泳过程中，有三种物理效应：（1）样品的浓缩效应发生于浓缩胶中）样品的浓缩效应发生于浓缩胶中（2）凝胶的分子筛效应发生于分离胶中）凝胶的分子筛效应发生于分离胶中（3）电泳的电荷效应浓缩胶、分离胶中）电泳的电荷效应浓缩胶、分离胶中电泳电泳第一个效应：样品的浓度效应（发生于浓缩胶中）第一个效应：样品的浓度效应（发生于浓缩胶中）基于电泳基质的基于电泳基质的4个不连续性：个不连续性：1、凝胶层的不连续性：、凝胶层的不连续性：3层不同的凝胶层不同的凝胶 样品胶：样品胶：浓缩胶：浓缩胶：分离胶：分离胶：电泳电泳2、缓冲液离子成份的不连续性、缓冲液离子成份的不连续性 快离子（先行离子）：快离子（先行离子）：慢离子（随后离子）：慢离子（随后离子）：缓冲配对离子：缓冲配对离子：电泳电泳缓冲液：缓冲液：电极缓冲液：电极缓冲液：pH8.3，Tris/甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液样品胶、浓缩胶：样品胶、浓缩胶：pH6.7，Tris/HCl缓冲液缓冲液分离胶：分离胶：pH8.9，Tris/HCl缓冲液缓冲液电泳电泳浓缩效应：浓缩效应：样品胶、浓缩胶：样品胶、浓缩胶：pH6.7 Tris/HCl缓冲液缓冲液Gly：少量少量COOH电离，（电离，（pI甘甘6.0）有效泳动率：有效泳动率：mCL Clm蛋蛋 m甘 甘电泳电泳3、电场强度的不连续性、电场强度的不连续性 电泳开始时：电泳开始时：快离子（快离子（Cl）泳动率最大，很快超过蛋白质泳动率最大，很快超过蛋白质，在快离子在快离子后形成后形成低离子强度区低离子强度区，即，即低电导区低电导区；低电导区产生高电场（低电导区产生高电场（E=I/，为电导率）；为电导率）；使蛋白质、慢离子加速移动（使蛋白质、慢离子加速移动（v=mE）电泳电泳当三者（当三者（Cl、蛋白质蛋白质、甘、甘）移动速度相等时，建）移动速度相等时，建立立稳定状态稳定状态：在快、慢离子之间形成在快、慢离子之间形成稳定而又不断向阳极移动的界面稳定而又不断向阳极移动的界面。蛋白质被浓缩为一个蛋白质被浓缩为一个狭窄狭窄的中间层。的中间层。电泳电泳第二个效应：分子筛效应发生于分离胶中第二个效应：分子筛效应发生于分离胶中分子量不同、分子构型不同分子量不同、分子构型不同的蛋白质样品通过一定孔径的蛋白质样品通过一定孔径的小孔径分离胶时，受到的的小孔径分离胶时，受到的阻滞程度阻滞程度不同，表现出不同不同，表现出不同的泳动率的泳动率这就是这就是分子筛效应分子筛效应电泳电泳第三个效应：电荷效应第三个效应：电荷效应不同的蛋白质所带的电荷不同，故迁移率不同，形成不同不同的蛋白质所带的电荷不同，故迁移率不同，形成不同的区带。这就是的区带。这就是电荷效应。电荷效应。电泳电泳2.3 PAGE的一般操作的一般操作2.3.1 装置装置由电泳槽、玻璃管、电泳仪三部分构成由电泳槽、玻璃管、电泳仪三部分构成电泳电泳2.3.2 制胶制胶1、制备分离胶：、制备分离胶：聚合反应：聚合反应：0.50.51.01.0hrhr电泳电泳2、预电泳、预电泳 目的：除去残留的过硫酸铵目的：除去残留的过硫酸铵AP 操作：去除上层缓冲液操作：去除上层缓冲液以制备分离胶的缓冲液以制备分离胶的缓冲液作电极作电极溶液，溶液，3 3mA/mA/管，电泳管，电泳0.50.52.02.0hrhr 注意：注意：预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，会使浓缩胶失效缓冲液进行，会使浓缩胶失效电泳电泳3、制备浓缩胶、制备浓缩胶用少许浓缩胶液漂洗分离胶顶端用少许浓缩胶液漂洗分离胶顶端加浓缩胶液（加浓缩胶液（0.50.51 1cmcm高）高）盖一层浓缩胶缓冲液盖一层浓缩胶缓冲液室温聚合室温聚合电泳电泳2.3.3 样品的准备样品的准备样品：样品：1mg/ml，加样加样10200ul电泳电泳2.3.4 电泳电泳 电泳槽中注满缓冲液，打开电源，电泳槽中注满缓冲液，打开电源，12mA/管管 样品进入分离胶时样品进入分离胶时升高电流升高电流3 35 5mA/mA/管管电泳电泳2.3.5 2.3.5 取胶取胶 用注射器，旋转，轻推用注射器，旋转，轻推 一般剥胶方向从浓缩胶端开始一般剥胶方向从浓缩胶端开始电泳电泳2.3.6 固定固定剥出的凝胶柱侵入剥出的凝胶柱侵入7乙酸或乙酸或12.5的三氯乙酸中，几的三氯乙酸中，几分钟即可分钟即可电泳电泳2.3.7 染色及脱色染色及脱色谱带染色通常用三种方法：谱带染色通常用三种方法：（1）化学染料染色法）化学染料染色法（2）荧光探针法）荧光探针法（3)特殊试剂染色法特殊试剂染色法电泳电泳（2）荧光探针法检测）荧光探针法检测（a）protein荧光试剂荧光试剂发荧光的复合物发荧光的复合物电泳电泳紫外紫外灯（灯（360360nmnm）下出现荧光谱带下出现荧光谱带电泳电泳（b b）proteinprotein电泳电泳胶移入荧光试剂中胶移入荧光试剂中荧光谱带荧光谱带电泳电泳(3)特殊试剂染色法特殊试剂染色法用于检测某些酶类用于检测某些酶类原理；不同的酶催化不同的底物原理；不同的酶催化不同的底物电泳电泳脱色：脱色：将染色液除去，凝胶浸洗于将染色液除去，凝胶浸洗于7乙酸中，经常更换，直至乙酸中，经常更换，直至染料不再洗出为止，约需染料不再洗出为止，约需23天。天。电泳电泳本课件可任意编辑，请在下载后根据实际需求进行修改。This courseware can be edited freely,please modify according to the actual needs after downloading.