第二章3目基因获得915课件

第二章第二章第二章第二章 基因工程的基本条件基因工程的基本条件基因工程的基本条件基因工程的基本条件一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶二、基因克隆载体二、基因克隆载体二、基因克隆载体二、基因克隆载体三、目的基因的获得三、目的基因的获得三、目的基因的获得三、目的基因的获得四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞 三、目的基因的获得三、目的基因的获得三、目的基因的获得三、目的基因的获得限制酶酶切直接分离法限制酶酶切直接分离法限制酶酶切直接分离法限制酶酶切直接分离法PCRPCR扩增法扩增法扩增法扩增法从从从从mRNAmRNA合成合成合成合成cDNAcDNA化学合成法化学合成法化学合成法化学合成法通过构建基因文库分离法通过构建基因文库分离法通过构建基因文库分离法通过构建基因文库分离法 对对对对已已已已克克克克隆隆隆隆在在在在载载载载体体体体中中中中的的的的目目目目的的的的基基基基因因因因，可可可可根根根根据据据据目目目目的的的的基基基基因因因因两两两两侧侧侧侧的的的的限限限限制制制制酶酶酶酶识识识识别别别别序序序序列列列列，选选选选择择择择适适适适当当当当的限制酶酶切，获得目的基因。的限制酶酶切，获得目的基因。的限制酶酶切，获得目的基因。的限制酶酶切，获得目的基因。（一）限制酶酶切直接分离法（一）限制酶酶切直接分离法（一）限制酶酶切直接分离法（一）限制酶酶切直接分离法注意：注意：目目的的基基因因内内部部不不能能有有该该限限制制酶酶的的切切点点，否则目的基因会被切成碎片！否则目的基因会被切成碎片！Ampr5AOX1HIS4Kanr3AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF165EcoR INot IBgl IIhVEGF165Bgl II9.8 KbTTSAmpr5 AOX1HIS4Kanr3 AOX1ColE1 pPIC9K 9.3 KbBgl IIBgl IISnaB IEcoR IAvr IINot ISTTf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5 Kb （二）（二）（二）（二）PCRPCR法扩增目的基因法扩增目的基因法扩增目的基因法扩增目的基因 利利用用耐耐热热DNA聚聚合合酶酶的的反反复复作作用用，通通过过变变性性-退退火火-延延伸伸的的循循环环操操作作，在在体体外外迅迅速将速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。模板扩增数百万倍的操作技术。PCRPCR(p polymeraseolymerase c chain hain r reaction)eaction)：以以目目的的基基因因为为模模板板，合合成成互互补补的的新新DNA链。链。双双链链DNA解解链链为为单单链链DNA；引引物物与与模模板板单单链链DNA的的特特定定互互补补部部位配对、结合；位配对、结合；退火：退火：变性：变性：延伸：延伸：变性变性退火退火延伸延伸 30th cycle？由由于于每每一一循循环环所所产产生生的的DNA片片段段均均能能成成为为下下一一次次循循环环的的模模板板，故故PCR产产物物以以指指数数方方式式增增加，即加，即Y=2n(n为循环次数为循环次数)。230(109)copiesPCR技术的发明技术的发明-DNA操作技术的革命操作技术的革命发明人：美国生化学家发明人：美国生化学家Kary B.MullisThe Nobel Prize in Chemistry 1993 Mullis KB.The unusual origin of the polymerase chain reaction.Scientific American.1990,262(4):56-61,64-5.1990.04Mullis KB.Dancing naked in the mind fields.1998.041983.03 开汽车时的联想开汽车时的联想：蜿蜒崎岖的山路蜿蜒崎岖的山路-DNA双螺旋双螺旋 行驶的汽车行驶的汽车-一小段一小段DNA引物引物1972 在加州大学伯克利分校获得博士学位在加州大学伯克利分校获得博士学位1979 进入私人生物技术公司进入私人生物技术公司Cetus 1983.08 正式做有关正式做有关PCR原理的报告原理的报告1983.09 Mullis开始动手做实验开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果首次取得可信结果1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑加入，结果毋庸置疑 1985.03 Cetus公司申请专利公司申请专利 1985.12 Saiki RK,Scharf SJ,Faloona FA,Mullis KB,Horn GT,Erlich HA,Arnheim N.Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science.1985,230(4732):1350-4.1986.05 冷泉港冷泉港“人类分子生物学人类分子生物学”专题研讨会专题研讨会 1987.01 Mullis KB,Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction.Methods in Enzymology.1987,155:335-50.1991.12 Cetus以以$3亿亿将专利卖给将专利卖给Hoffmann-La Roche公司公司 1986.06 Saiki等将耐热等将耐热DNA聚合酶聚合酶-Taq酶酶引入引入PCR技术。技术。Saiki RK,Gelfand DH,Stoffel S,Scharf SJ,Higuchi R,Horn GT,Mullis KB,Erlich HA.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science.1988,239(4839):487-91.1988.011989 Science杂志将杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，列为十余项重大科学发明之首，比喻比喻1989年为年为PCR爆炸年爆炸年。1986.09 Mullis离开离开Cetus公司公司Eppendorf Bio-rad ABIPCRPCR法扩增目的基因的前提：法扩增目的基因的前提：法扩增目的基因的前提：法扩增目的基因的前提：已知目的基因全序列或其两侧序列，已知目的基因全序列或其两侧序列，已知目的基因全序列或其两侧序列，已知目的基因全序列或其两侧序列，化学合成与模板互补的上、下游引物。化学合成与模板互补的上、下游引物。化学合成与模板互补的上、下游引物。化学合成与模板互补的上、下游引物。TaqTaq酶酶酶酶无无无无3355外外外外切切切切酶酶酶酶活活活活性性性性，无无无无阅阅阅阅读读读读校校校校正正正正功功功功能能能能，在在在在扩扩扩扩增增增增过过过过程程程程中中中中会会会会引引引引起起起起错错错错配配配配，3030次次次次循环循环循环循环TaqTaq酶错配率约酶错配率约酶错配率约酶错配率约0.250.25。措施：措施：问题：问题：问题：问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。可能造成目的基因碱基序列的改变。可能造成目的基因碱基序列的改变。可能造成目的基因碱基序列的改变。原因：原因：选择高保真选择高保真Taq酶，如酶，如Pfu。因因因因TaqTaq酶对酶对酶对酶对dATPdATP具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。55AAAAPCRPCR扩增产物扩增产物扩增产物扩增产物55 由由由由TaqTaq酶酶酶酶扩扩扩扩增增增增的的的的PCRPCR产产产产物物物物，33末末末末端端端端总总总总是是是是带带带带有有有有一一一一个个个个非非非非模模模模板板板板依依依依赖赖赖赖型型型型的的的的突突突突出出出出碱碱碱碱基基基基，而而而而这这这这个个个个碱碱碱碱基基基基几几几几乎乎乎乎总总总总是是是是A A，TT载体载体载体载体TTTT5555T7T7lacZlacZMCSMCSorioriAmpAmprr可用可用T载体克隆。载体克隆。（三）从（三）从（三）从（三）从mRNAmRNA合成合成合成合成cDNAcDNA 以以目目的的基基因因的的mRNA为为模模板板，在在逆逆转转录录酶酶作作用用下下合合成成cDNA第第一一链链，然然后后在在Klenow酶作用下合成双链酶作用下合成双链cDNA。此此法法适适用用于于mRNA丰丰度度极极高高的的目目的的基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。哺哺乳乳动动物物的的网网织织红红细细胞胞中中珠珠蛋蛋白白mRNA的比例占总的比例占总mRNA的的90%以上。以上。目目的的mRNA在在细细胞胞中中的的含含量量占占细细胞胞质质总总mRNA量的量的0.5%以下。以下。目目的的mRNA在在细细胞胞中中的的含含量量占占细细胞胞质质总总mRNA量的量的50-90%。高丰度高丰度mRNA：低丰度低丰度mRNA：步骤：步骤：dNTPdNTP 逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶primerprimer逆转录酶催化合成逆转录酶催化合成cDNA第一链第一链 mRNA mRNA cDNAcDNA钓取目的基因的钓取目的基因的mRNA mRNA mRNA逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶去除逆转录酶去除mRNA-cDNA杂交链中的杂交链中的mRNA链链 cDNAcDNAKlenowKlenow酶酶酶酶dNTPdNTP Klenow酶合成酶合成cDNA第二链第二链 cDNAcDNA cDNAcDNA钓取目的基因的钓取目的基因的mRNA：与与oligo(dT)碱基互补的碱基互补的mRNA结合到柱上，结合到柱上，非非mRNA(tRNA、rRNA）流走。）流走。总总mRNAoligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤纤维维素素柱柱oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤纤维维素素柱柱总总RNA1 1）提提提提 取取取取 特特特特 定定定定 组组组组 织织织织 或或或或 细细细细 胞胞胞胞 的的的的 总总总总 RNARNA，用用用用oligo(dToligo(dT)纤纤纤纤维素柱分离总维素柱分离总维素柱分离总维素柱分离总mRNAmRNA。2）根根据据已已知知基基因因序序列列合合成成DNA探探针针，结结合合到纤维素柱上，用来分离纯化特定到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。与与探探针针碱碱基基互互补补的的mRNA结结合合到到柱柱上上，其其它它mRNA流走。流走。特定特定mRNA 探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA纤纤维维素素柱柱探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA纤纤维维素素柱柱总总mRNA克隆平端双链克隆平端双链克隆平端双链克隆平端双链cDNAcDNA的方法：的方法：的方法：的方法：平端直接与载体连接；平端直接与载体连接；平端直接与载体连接；平端直接与载体连接；平端接同聚尾；平端接同聚尾；平端接同聚尾；平端接同聚尾；加装人工接头加装人工接头加装人工接头加装人工接头(adapter)(adapter)；加装衔接物加装衔接物加装衔接物加装衔接物(linker)(linker)。加装同聚物尾：加装同聚物尾：加装同聚物尾：加装同聚物尾：利用利用TdT，在双链在双链cDNA和载体和载体3端加互补的同聚端加互补的同聚物尾，退火连接成重组分子。物尾，退火连接成重组分子。1972年，斯坦福大学年，斯坦福大学P.Labban和和P.Kaiser发明。发明。CCCCCCCCCCCCdCTPTdT cDNA53载体载体53GGGGGGGGGGGGdGTPTdTCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGT4 DNA ligase加装人工接头加装人工接头(adapter)1978年，康奈尔大学吴瑞发明。年，康奈尔大学吴瑞发明。adapter是是人人工工合合成成的的一一头头具具有有某某种种限限制制酶酶的的粘粘性性末末端端，另另一一头头为为平平末末端端的的特特殊殊的的双双链链寡核苷酸短片断。寡核苷酸短片断。GTCG CAGCTTAA53EcoR I adapter注意：注意：adapter易通过粘端碱基配对形成二聚体。易通过粘端碱基配对形成二聚体。GTCG CAGCTTAA53 AATTCGAC GCTG35 AATTCGAC GCTGGTCGCAGCTTAA 5335T4 DNA ligase 将将adapter连连接接到到双双链链cDNA的的两两端端，直直接接成为人工粘端。成为人工粘端。CIP去除去除adapter的的5-P，使，使5-P成为成为5-OH。5 P-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-P533CIP5OH-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-OH533措施：措施：加装衔接物加装衔接物(linker):linker是是人人工工合合成成的的一一段段由由10-12个个核核苷苷酸酸组组成成、具具有有一一个个或或多多个个限限制制酶酶识识别别序序列列的平末端双链寡核苷酸短片段。的平末端双链寡核苷酸短片段。EcoR I linker5TGGAATTCCAACCTTAAGGT533 将将双双链链cDNA与与linker连连接接，再再用用限限制制酶酶酶酶切切，可产生粘性末端。可产生粘性末端。（四）化学合成法（四）化学合成法（四）化学合成法（四）化学合成法19791979年，成功合成年，成功合成年，成功合成年，成功合成E.coliE.coli酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸tRNAtRNA基因。基因。基因。基因。-ScienceScience1976年，年，H.G.Khorana提出用化学方法合成提出用化学方法合成 基因的设想；基因的设想；已知目的基因的已知目的基因的DNA序列。序列。化学合成法的前提：化学合成法的前提：小片段粘接法小片段粘接法小片段粘接法小片段粘接法补钉延长法补钉延长法补钉延长法补钉延长法大片段酶促法大片段酶促法大片段酶促法大片段酶促法 战略：战略：战略：战略：化学合成的化学合成的DNA片断一般局限在片断一般局限在200bp以内。以内。1 1）小片段粘接法：）小片段粘接法：）小片段粘接法：）小片段粘接法：分别合成分别合成分别合成分别合成12-1512-15bpbp的单链的单链的单链的单链DNADNA小片段。小片段。小片段。小片段。混合退火混合退火混合退火混合退火T4 DNA T4 DNA ligaseligase 片片断断之之间间有有互互补补区区，混混合合退退火火形形成成有有断断点点的的双链，再由双链，再由T4 DNA ligase连接成完整连接成完整双链。双链。2 2）补钉延长法：）补钉延长法：）补钉延长法：）补钉延长法：混合退火混合退火混合退火混合退火 片片片片断断断断之之之之间间间间有有有有局局局局部部部部互互互互补补补补区区区区，可可可可相相相相互互互互作作作作为为为为另另另另一一一一个个个个片断延长的引物，用片断延长的引物，用片断延长的引物，用片断延长的引物，用KlenowKlenow酶酶酶酶延伸成完整双链。延伸成完整双链。延伸成完整双链。延伸成完整双链。T4 DNAT4 DNA ligaseligase KlenowKlenow 分分分分 别别别别 合合合合 成成成成 12-1512-15bpbp的的的的 单单单单 链链链链 DNADNA小小小小 片片片片 段段段段 及及及及 20-20-3030bpbp的单链的单链的单链的单链DNADNA中片段。中片段。中片段。中片段。3 3）大片段酶促法：）大片段酶促法：）大片段酶促法：）大片段酶促法：分别合成分别合成分别合成分别合成40-5040-50bpbp的单链的单链的单链的单链DNADNA大片段。大片段。大片段。大片段。混合退火混合退火混合退火混合退火T4 DNAT4 DNA ligaseligase KlenowKlenow 片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用断延长的引物，用Klenow酶酶延伸成完整双链。延伸成完整双链。化学合成的份额较大，成本较高。化学合成的份额较大，成本较高。化学合成的份额较大，成本较高。化学合成的份额较大，成本较高。大大片片段段化化学学合合成成的的收收率率极极低低，如如合合成成50bp的的DNA单链大片段的总收率仅单链大片段的总收率仅7.7%。三种方法各有利弊：三种方法各有利弊：三种方法各有利弊：三种方法各有利弊：小片段粘接法：小片段粘接法：小片段粘接法：小片段粘接法：大片段酶促法：大片段酶促法：化学合成化学合成化学合成化学合成DNADNA的单链片段愈短，收率愈高；的单链片段愈短，收率愈高；的单链片段愈短，收率愈高；的单链片段愈短，收率愈高；化学合成的份额较小，成本较低；化学合成的份额较小，成本较低；化化学学合合成成DNA的的实实质质是是按按照照序序列列要要求求将将脱脱氧氧核核苷苷酸酸单单体体一一个个个个接接上上去去，每每接接一一个个单单体体就就是是一一个个循循环环反反应应，包包括括：基基团团保保护护、分分离离、缩缩合合、分分离离、去去保保护护五五大大操操作作单元。单元。DNA合合成成仪仪是是根根据据固固相相亚亚磷磷酰酰胺胺三三酯酯法法原理设计的。原理设计的。从从反反应应机机理理上上来来讲讲，DNA化化学学合合成成有有磷磷酸酸二二酯酯法法、磷磷酸酸三三酯酯法法、亚亚磷磷酰酰胺胺三三酯酯法法；具具体体操操作作过过程程又又有有液液相相合合成成和和固固相相合合成两种形式。成两种形式。DNA合成仪合成仪 基因合成一般都是自己设计序列，交给基因合成一般都是自己设计序列，交给商业公司合成。商业公司合成。DNADNA化学合成的用途：化学合成的用途：化学合成的用途：化学合成的用途：合成天然基因合成天然基因修饰改造基因修饰改造基因设计新型基因设计新型基因合成测序或合成测序或PCR引物引物制备寡核苷酸探针制备寡核苷酸探针制备人工接头制备人工接头(adaptor)和衔接物和衔接物(linker)合成天然基因：合成天然基因：合成天然基因：合成天然基因：有些组织特异性有些组织特异性有些组织特异性有些组织特异性mRNAmRNA含量很低，很难用含量很低，很难用含量很低，很难用含量很低，很难用cDNAcDNA法克隆。法克隆。法克隆。法克隆。有些基因比较短，化学合成费用较低。有些基因比较短，化学合成费用较低。有些基因比较短，化学合成费用较低。有些基因比较短，化学合成费用较低。如：如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。合成寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针(oligonucleotideoligonucleotide probe)probe)：根根据据已已知知核核酸酸序序列列，用用DNA合合成成仪仪合合成成一定长度的寡核苷酸片段，作为探针使用。一定长度的寡核苷酸片段，作为探针使用。若若未未知知核核酸酸序序列列，可可根根据据蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸序列酸序列倒推倒推出出核酸序列，但需考虑核酸序列，但需考虑 密码子的密码子的简并性简并性。大多数氨基酸拥有大多数氨基酸拥有简并密码子简并密码子。某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列:Cys Met Asp Glu Met Lys可能的可能的DNA序列序列:TGTATGGACGAAATGAAA C T G G 设计系列探针设计系列探针:TGTATGGACGAAATGAAATGTATGGACGAGATGAAATGTATGGATGAAATGAAATGTATGGATGAGATGAAATGTATGGACGAAATGAAGTGTATGGACGAGATGAAGTGTATGGATGAAATGAAGTGTATGGATGAGATGAAGTGCATGGACGAAATGAAATGCATGGACGAGATGAAATGCATGGATGAAATGAAATGCATGGATGAGATGAAATGCATGGACGAAATGAAGTGCATGGACGAGATGAAGTGCATGGATGAAATGAAGTGCATGGATGAGATGAAG （五）通过构建基因文库分离目的基因五）通过构建基因文库分离目的基因五）通过构建基因文库分离目的基因五）通过构建基因文库分离目的基因基因库基因库基因库基因库 (gene pool)gene pool)基因文库基因文库基因文库基因文库 (gene library or gene bank)(gene library or gene bank)基本概念基本概念基本概念基本概念:是特定生物体全基因组的集合是特定生物体全基因组的集合是特定生物体全基因组的集合是特定生物体全基因组的集合（天然存在天然存在天然存在天然存在）。）。）。）。基因库基因库基因库基因库 ：是从特定生物个体中分离的全部基因，这是从特定生物个体中分离的全部基因，这是从特定生物个体中分离的全部基因，这是从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆形式存在些基因以克隆形式存在些基因以克隆形式存在些基因以克隆形式存在（人工构建人工构建人工构建人工构建）。）。）。）。基因文库：基因文库：基因文库：基因文库：根据构建方法的不同，根据构建方法的不同，基因文库基因文库分为：分为：基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 (genomic DNA library)(genomic DNA library)cDNAcDNA文库文库文库文库 (cDNAcDNA library)library)基因组文库：基因组文库：基因组文库：基因组文库：cDNAcDNA文库：文库：文库：文库：含全部基因含全部基因含全部基因含全部基因。含全部蛋白质编码的结构基因。含全部蛋白质编码的结构基因。含全部蛋白质编码的结构基因。含全部蛋白质编码的结构基因。鸟枪法构建；鸟枪法构建；鸟枪法构建；鸟枪法构建；材料来自染色体材料来自染色体材料来自染色体材料来自染色体DNADNA；cDNAcDNA法构建；法构建；法构建；法构建；材料来自材料来自材料来自材料来自mRNAmRNA；1、基因组文库、基因组文库 将将将将某某某某种种种种生生生生物物物物基基基基因因因因组组组组DNADNA经经经经超超超超声声声声波波波波或或或或限限限限制制制制酶酶酶酶部部部部分分分分酶酶酶酶切切切切处处处处理理理理后后后后，与与与与载载载载体体体体连连连连接接接接，转转转转化化化化宿宿宿宿主主主主细胞，得到细胞，得到细胞，得到细胞，得到含全部基因含全部基因含全部基因含全部基因的克隆群体。的克隆群体。的克隆群体。的克隆群体。1 1、基因组、基因组、基因组、基因组DNADNA的制备：的制备：的制备：的制备：制制制制备备备备的的的的DNADNA分分分分子子子子量量量量越越越越大大大大，切切切切割割割割后后后后含含含含不不不不规规规规则则则则末末末末端端端端DNADNA片片片片段段段段的的的的比比比比率率率率越越越越低低低低，重重重重组组组组率率率率和和和和完完完完备备备备性越高。性越高。性越高。性越高。基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建 为为为为最最最最大大大大限限限限度度度度保保保保证证证证基基基基因因因因的的的的完完完完整整整整性性性性，基基基基因因因因组组组组DNADNA在分离纯化操作中应在分离纯化操作中应在分离纯化操作中应在分离纯化操作中应避免过度断裂避免过度断裂避免过度断裂避免过度断裂。常常规规方方法法制制备备的的染染色色体体DNA长长度度一一般般100kb，如如先先将将细细胞胞固固定定在在低低熔熔点点琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶，再再置置于于含含SDS、蛋蛋白白酶酶K、RNase的的缓缓冲液中浸泡，可获得冲液中浸泡，可获得1,000kb的的DNA片段。片段。一般采用一般采用一般采用一般采用超声波超声波超声波超声波和和和和限制酶部分酶切限制酶部分酶切限制酶部分酶切限制酶部分酶切法。法。法。法。保证保证保证保证DNADNA片段大小均一。片段大小均一。片段大小均一。片段大小均一。2 2、基因组、基因组、基因组、基因组DNADNA的切割：的切割：的切割：的切割：目的：目的：目的：目的：保证保证保证保证DNADNA片段之间存在部分重叠区；片段之间存在部分重叠区；片段之间存在部分重叠区；片段之间存在部分重叠区；超声波处理：超声波处理：超声波处理：超声波处理：处理后处理后处理后处理后的的的的DNADNA片段呈平末端，片段呈平末端，片段呈平末端，片段呈平末端，需加装人工接头。需加装人工接头。需加装人工接头。需加装人工接头。产产产产生生生生粘粘粘粘性性性性末末末末端端端端，可可可可与与与与常常常常用用用用克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点（如如如如BamBamHH I I、BglBgl IIII）连接连接连接连接。部分酶切法：部分酶切法：部分酶切法：部分酶切法：部部部部分分分分酶酶酶酶切切切切片片片片段段段段大大大大小小小小可可可可控控控控，可可可可得得得得到到到到15-45kb15-45kb的随机片断；的随机片断；的随机片断；的随机片断；选用选用选用选用4 4bpbp识别序列的限制酶，如识别序列的限制酶，如识别序列的限制酶，如识别序列的限制酶，如SauSau3A3A。3 3、载体和受体的选择、载体和受体的选择、载体和受体的选择、载体和受体的选择构建大型基因组文库（动植物和人类），选构建大型基因组文库（动植物和人类），选构建大型基因组文库（动植物和人类），选构建大型基因组文库（动植物和人类），选择择择择BACBAC或或或或YACYAC。根据载体，选择根据载体，选择E.coli、Yeast。常选常选常选常选 -DNA-DNA或或或或CosmidCosmid；受体：受体：载体：载体：载体：载体：在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：尽量提高载体与外源尽量提高载体与外源尽量提高载体与外源尽量提高载体与外源DNADNA片段的连接效率！片段的连接效率！片段的连接效率！片段的连接效率！根据载体的装载量，将根据载体的装载量，将根据载体的装载量，将根据载体的装载量，将DNADNA片段片段片段片段分级分离分级分离分级分离分级分离；利用利用利用利用CIPCIP，去除载体的，去除载体的，去除载体的，去除载体的5-P5-P；利用利用利用利用TdTTdT，在，在，在，在DNADNA片段的片段的片段的片段的3-OH3-OH加同聚尾。加同聚尾。加同聚尾。加同聚尾。措施：措施：措施：措施：基因文库的完备性：基因文库的完备性：基因文库的完备性：基因文库的完备性：是指在构建的基因文库中任一基因存在的是指在构建的基因文库中任一基因存在的是指在构建的基因文库中任一基因存在的是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率概率概率概率P P，与基因文库最低所含克隆数，与基因文库最低所含克隆数，与基因文库最低所含克隆数，与基因文库最低所含克隆数N N的关系：的关系：的关系：的关系：N N=ln(1=ln(1P P)/ln(1)/ln(1f f)P P=基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率）基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率）基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率）基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率）f f=克隆片段平均大小克隆片段平均大小克隆片段平均大小克隆片段平均大小/生物基因组大小生物基因组大小生物基因组大小生物基因组大小 N N=ln(1=ln(1P P)/ln(1)/ln(1f f)如如如如：人人人人单单单单倍倍倍倍体体体体DNADNA长长长长2.92.9 101066kbkb，克克克克隆隆隆隆片片片片段段段段平平平平均均均均大大大大小小小小1515kbkb，构构构构建建建建完完完完备备备备性性性性0.90.9的的的的基基基基因因因因文文文文库库库库，至至至至少少少少需需需需4545万万万万个个个个克克克克隆隆隆隆；当当当当完完完完备备备备性性性性提提提提高高高高至至至至0.99990.9999时时时时，至至至至少少少少需需需需180180万万万万个克隆。个克隆。个克隆。个克隆。即即即即：为为为为保保保保证证证证某某某某一一一一基基基基因因因因以以以以99.99%99.99%的的的的机机机机率率率率至至至至少少少少被被被被克克克克隆隆隆隆1 1次次次次，需需需需构构构构建建建建含含含含180180万万万万个个个个不不不不同同同同重重重重组组组组克克克克隆隆隆隆的的的的基基基基因因因因文文文文库，这时克隆片段总和为整个基因组的库，这时克隆片段总和为整个基因组的库，这时克隆片段总和为整个基因组的库，这时克隆片段总和为整个基因组的 倍。倍。倍。倍。9.3即即：为为保保证证某某一一基基因因以以99.99%的的机机率率至至少少被被克克隆隆1次次，需需构构建建含含180万万个个不不同同重重组组克克隆隆的的基基因因文文库库，若若1个个基基因因文文库库的的插插入入片片段段总总和和为为整整个个基基因因组组的的10倍倍以以上上，就就能能从从基基因因文文库库中中调出任何一段调出任何一段DNA序列。序列。基因文库的质量标准：基因文库的质量标准：基因文库的质量标准：基因文库的质量标准：除除除除尽可能高的完备性尽可能高的完备性尽可能高的完备性尽可能高的完备性外，理想的基因文库还应具备：外，理想的基因文库还应具备：外，理想的基因文库还应具备：外，理想的基因文库还应具备：重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。克隆总数不宜过大，克隆总数不宜过大，克隆总数不宜过大，克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；以减轻筛选工作的压力；以减轻筛选工作的压力；以减轻筛选工作的压力；载体的装载量必须大于基因的长度；载体的装载量必须大于基因的长度；载体的装载量必须大于基因的长度；载体的装载量必须大于基因的长度；含有相邻含有相邻含有相邻含有相邻DNADNA片段的重组克隆之间，需存在足够片段的重组克隆之间，需存在足够片段的重组克隆之间，需存在足够片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，长度的重叠区，长度的重叠区，长度的重叠区，以利于克隆排序；以利于克隆排序；以利于克隆排序；以利于克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；基因组文库的保存基因组文库的保存基因组文库的保存基因组文库的保存影印滤膜保存法影印滤膜保存法影印滤膜保存法影印滤膜保存法保存文库于液体培养基中保存文库于液体培养基中保存文库于液体培养基中保存文库于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中1 1）影印滤膜保存法：）影印滤膜保存法：）影印滤膜保存法：）影印滤膜保存法：2 2）保存文库于液体培养基中）保存文库于液体培养基中）保存文库于液体培养基中）保存文库于液体培养基中 从从平平板板上上挑挑取取全全部部克克隆隆，接接种种于于含含适适当当抗抗生生素素的的液液体体培培养养基基中中，混混合合的的细细菌菌生生长长数数代后，加入终浓度代后，加入终浓度25%的甘油，的甘油，-70保存。保存。缺缺点点：由由于于文文库库菌菌落落生生长长的的不不均均匀匀性性，可可能能导致文库中某些特定序列过多或过少。导致文库中某些特定序列过多或过少。3 3）保存单个克隆子于液体培养基中）保存单个克隆子于液体培养基中）保存单个克隆子于液体培养基中）保存单个克隆子于液体培养基中 从从平平板板上上挑挑选选单单个个克克隆隆，接接种种于于含含适适当当抗抗生生素素的的液液体体培培养养基基中中，菌菌体体生生长长至至一一定定浓浓度时，加入终浓度度时，加入终浓度25%的甘油，的甘油，-70保存。保存。缺点：缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。需保存的克隆子数过多，工作量大。从从从从基因组基因组基因组基因组文库中筛选目的基因文库中筛选目的基因文库中筛选目的基因文库中筛选目的基因 大大型型基基因因组组文文库库由由数数十十万万甚甚至至上上百百万万个个重重组组克克隆隆组组成成，除除一一些些具具特特殊殊功功能能的的蛋蛋白白质质编编码码基基因因（如如抗抗药药性性基基因因）可可用用特特殊殊的的正正选选择择筛筛选选程程序序（如如抗抗药药性性筛筛选选）直直接接筛筛选选外外，一般均需一般均需多轮多轮操作步骤。操作步骤。密集铺板（密集铺板（密集铺板（密集铺板（1-101-10万）万）万）万）杂杂杂杂交交交交挖挖挖挖取取取取铺铺铺铺板板板板目的重组克隆目的重组克隆目的重组克隆目的重组克隆铺铺铺铺板板板板根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选通过构建通过构建基因组文库基因组文库获取目的基因的问题：获取目的基因的问题：该方法仅适用于该方法仅适用于原核基因原核基因的分离，较少采用。的分离，较少采用。不能除去真核生物目的基因的内含子结构。不能除去真核生物目的基因的内含子结构。工作量大，需了解目的基因的背景知识；工作量大，需了解目的基因的背景知识；不能获得最小长度的目的基因；不能获得最小长度的目的基因；“鸟鸟枪枪法法(shotgun)”：又又称称“散散弹弹法法”用限制酶部分酶切染色体用限制酶部分酶切染色体DNA将酶切片段克隆入载体将酶切片段克隆入载体转化受体细胞并扩增转化受体细胞并扩增分离带有目的基因的分离带有目的基因的DNA片段片段筛选目的重组子筛选目的重组子用用“鸟枪法鸟枪法”获取目的基因：获取目的基因：缺点缺点：操作简便。操作简便。工作量大；工作量大；具有一定的盲目性。具有一定的盲目性。优点优点：优点：优点：保证目的基因的完整性，提高目的重组子保证目的基因的完整性，提高目的重组子 的出现频率，简化操作。的出现频率，简化操作。鸟枪法操作的改进：鸟枪法操作的改进：-使用特定限制酶使用特定限制酶完全酶切完全酶切染色体染色体DNA。前提：前提：已知目的基因的酶切图谱。已知目的基因的酶切图谱。策略：策略：用目的基因两端的限制酶用目的基因两端的限制酶完全酶切完全酶切染色体染色体 DNA，然后与载体拼接。然后与载体拼接。2.0 kb1.6 kb1.8 kb如：如：如：如：已已已已 知知知知 目目目目 的的的的 基基基基 因因因因 位位位位 于于于于1.81.8kbkb的的的的Sal Sal I I片片片片段段段段中中中中，将将将将染染染染色色色色体体体体DNADNA用用用用Sal Sal I I切切切切开开开开，琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳分分分分离离离离，切切切切下下下下1.6-2.0kb1.6-2.0kb区区区区域域域域内内内内的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶块块块块，从从从从此此此此凝凝凝凝胶胶胶胶中中中中回回回回收收收收DNADNA片段，与载体连接。片段，与载体连接。片段，与载体连接。片段，与载体连接。基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 构构构构建建建建大大大大型型型型基基基基因因因因组组组组文文文文库库库库技技技技术术术术上上上上并并并并不不不不困困困困难难难难，若若若若文文文文库库库库插插插插入入入入片片片片段段段段总总总总和和和和为为为为基基基基因因因因组组组组的的的的1010倍倍倍倍以以以以上上上上，就就就就能能能能从其中调出任何一段从其中调出任何一段从其中调出任何一段从其中调出任何一段DNADNA序列。序列。序列。序列。然然然然而而而而基基基基因因因因文文文文库库库库的的的的克克克克隆隆隆隆是是是是随随随随机机机机序序序序列列列列，必必必必须须须须将将将将所所所所有有有有克克克克隆隆隆隆排排排排列列列列成成成成一一一一个个个个像像像像天天天天然然然然染染染染色色色色体体体体DNADNA上上上上所所所所表表表表现出的信息顺序。现出的信息顺序。现出的信息顺序。现出的信息顺序。-这项工作的工作量远大于文库构建。这项工作的工作量远大于文库构建。这项工作的工作量远大于文库构建。这项工作的工作量远大于文库构建。酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法随机探针联合杂交法随机探针联合杂交法随机探针联合杂交法随机探针联合杂交法染色体走读法染色体走读法染色体走读法染色体走读法基因组文库重组克隆的排序方法：基因组文库重组克隆的排序方法：酶切片段末端标记法：酶切片段末端标记法：酶切片段末端标记法：酶切片段末端标记法：1 1、将将将将单单单单一一一一YACYAC克克克克隆隆隆隆插插插插入入入入DNADNA片片片片段段段段用用用用限限限限制制制制酶酶酶酶均均均均匀匀匀匀地水解成若干片段，末端标记同位素。地水解成若干片段，末端标记同位素。地水解成若干片段，末端标记同位素。地水解成若干片段，末端标记同位素。HHHH载体载体载体载体DNADNA克隆克隆克隆克隆DNADNA2 2、然然然然后后后后用用用用SauSau3A3A将将将将末末末末端端端端标标标标记记记记的的的的DNADNA片片片片段段段段降降降降解解解解成成成成碎碎碎碎片片片片，PAGEPAGE电电电电泳泳泳泳，每每每每1010个个个个YACYAC克克克克隆隆隆隆走走走走在在在在一一一一块块块块板板板板上上上上，形成形成形成形成1010个克隆的特征性个克隆的特征性个克隆的特征性个克隆的特征性DNADNA指纹图谱。指纹图谱。指纹图谱。指纹图谱。S S SSSSSSSSSSSSS SSSS1010克隆指纹图谱克隆指纹图谱克隆指纹图谱克隆指纹图谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 103 3、电电电电脑脑脑脑分分分分析析析析指指指指纹纹纹纹图图图图谱谱谱谱，如如如如发发发发现现现现任任任任何何何何两两两两个个个个克克克克隆隆隆隆DNADNA的的的的指指指指纹纹纹纹图图图图谱谱谱谱有有有有部部部部分分分分相相相相同同同同，二二二二者者者者就就就就有有有有互互互互相相相相重重重重叠叠叠叠的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。1010克隆指纹图谱克隆指纹图谱克隆指纹图谱克隆指纹图谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 10随机探针联合杂交法：随机探针联合杂交法：随机探针联合杂交法：随机探针联合杂交法：1 1、将将将将若若若若干干干干YACYAC克克克克隆隆隆隆固固固固定定定定在在在在薄薄薄薄膜膜膜膜上上上上，复复复复制制制制2020份份份份薄薄薄薄膜膜膜膜；合成合成合成合成2020种不同序列的短探针（序列随机）。种不同序列的短探针（序列随机）。种不同序列的短探针（序列随机）。种不同序列的短探针（序列随机）。0101 02 02 03 03 04 04 05 05 06 06 07 07 08 08 09 09 10 101111121213131414151516161717181819192020AA BB C C DD EE FFGG2 2、用用用用2020种种种种探探探探针针针针随随随随机机机机定定定定位位位位杂杂杂杂交交交交（1 1对对对对1 1）2020份份份份YACYAC克克克克隆隆隆隆薄薄薄薄膜膜膜膜。若若若若某某某某2 2个个个个克克克克隆隆隆隆同同同同时时时时对对对对同同同同一一一一种种种种探探探探针针针针呈呈呈呈现现现现杂交阳性反应，则这杂交阳性反应，则这杂交阳性反应，则这杂交阳性反应，则这2 2个克隆有可能相互重叠。个克隆有可能相互重叠。个克隆有可能相互重叠。个克隆有可能相互重叠。01 01 02 02 03 03 04 04 05 05 06 06 07 0708080909 10 101111121213131414151516161717181819192020AA BB C C DD EE FFGG20个随机探针个随机探针3 3、若若若若将将将将杂杂杂杂交交交交阳阳阳阳性性性性结结结结果果果果记记记记为为为为“1”“1”，可可可可清清清清晰晰晰晰地地地地列列列列成成成成一一一一张表，最终排出上述张表，最终排出上述张表，最终排出上述张表，最终排出上述YACYAC克隆的排列顺序。克隆的排列顺序。克隆的排列顺序。克隆的排列顺序。0101 0202 0303 0404 0505 0606 0707 0808 0909 1010 1111 1212 1313 1414 1515 1616 1717 1818 1919 2020DDAAB BCCE EF FGG1 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 101010404121206061313141402021414070719191111151505050808161603031010090920201818DDAABBCCEEFFGG111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111FFCCAADDGGEEBB1 1、从从从从基基基基因因因因文文文文库库库库中中中中任任任任取取取取1 1个个个个克克克克隆隆隆隆作作作作为为为为染染染染色色色色体体体体走走走走读读读读的的的的起起起起点点点点，将将将将其其其其两两两两端端端端序序序序列列列列分分分分别别别别亚亚亚亚克克克克隆隆隆隆，亚亚亚亚克克克克隆隆隆隆片片片片段在段在段在段在0.50.5-2.0kb-2.0kb范围内。范围内。范围内。范围内。染色体走读法染色体走读法染色体走读法染色体走读法(chromosome walking)(chromosome walking)：走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列2 2、以以以以亚亚亚亚克克克克隆隆隆隆DNADNA片片片片段段段段为为为为探探探探针针针针，与与与与基基基基因因因因文文文文库库库库杂杂杂杂交交交交，阳阳阳阳性性性性克克克克隆隆隆隆中中中中的的的的插插插插入入入入DNADNA片片片片段段段段必必必必定定定定与与与与起起起起点点点点克克克克隆隆隆隆所所所所含含含含的的的的DNADNA片段连锁在一起。片段连锁在一起。片段连锁在一起。片段连锁在一起。走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列 探针标记探针标记探针标记探针标记第一轮杂交第一轮杂交第一轮杂交第一轮杂交阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆3 3、再再再再以以以以阳阳阳阳性性性性克克克克隆隆隆隆片片片片段段段段的的的的两两两两端端端端序序序序列列列列为为为为探探探探针针针针，进进进进行行行行第二步走读，直至线型染色体第二步走读，直至线型染色体第二步走读，直至线型染色体第二步走读，直至线型染色体DNADNA的端点。的端点。的端点。的端点。阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段 将将某某种种生生物物基基因因组组转转录录的的全全部部mRNA通通过过反反转转录录合合成成cDNA，与与载载体体连连接接，转转化化宿宿主主细细胞胞，得得到到含含全全部部表表达达基因基因的克隆群体。的克隆群体。2、cDNA文库文库信息量远小于基因组文库，容易构建；信息量远小于基因组文库，容易构建；具有具有时空性时空性和和组织细胞特异性组织细胞特异性。cDNA文库的特点：文库的特点：不含内含子序列不含内含子序列；可以在细菌中直接表达；可以在细菌中直接表达；包含该生物全部蛋白质编码的结构基因；包含该生物全部蛋白质编码的结构基因；在在高高度度分分化化的的生生物物体体中中，不不同同组组织织或或细细胞胞在在相相同同时时段段、相相同同环环境境背背景景下下，mRNA种种类、表达水平也不同。类、表达水平也不同。同同一一组组织织或或细细胞胞在在不不同同时时段段、不不同同环环境境背景下，背景下，mRNA种类、表达水平不同。种类、表达水平不同。具有具有时空性时空性和和组织细胞特异性组织细胞特异性：cDNA文文库库特特异异地地反反映映某某种种组组织织或或细细胞胞中中，在在特特定定发发育育阶阶段段表表达达的的蛋蛋白白质质的的编编码码基基因因，因因此此具具有有时时空空性性和和组组织织细细胞胞特异性特异性。cDNA文库的构建文库的构建总总RNA提取提取mRNA的分离纯化的分离纯化cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成第一链的合成第一链的合成cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成1）总总RNA提取：提取：商业化试剂盒。商业化试剂盒。利利用用mRNA含含polyA尾尾，将将其其从从总总RNA中分离纯化，中分离纯化，mRNA只占总只占总RNA的的1-2%。2）mRNA的分离纯化：的分离纯化：商业化商业化oligo(dT)纤维素柱。纤维素柱。哺哺乳乳动动物物mRNA长长度度为为0.5-8.0kb，大大部部分为分为1.5-2.0kb。3 3）cDNAcDNA第一链的合成：第一链的合成：第一链的合成：第一链的合成：cDNAcDNA第一链第一链第一链第一链mRNAmRNAAAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3TTTTTTTTTTTTTTT 5TTTTTTTTTTTTTTT 5AAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3TTTTTTTTTTTTTTT 5TTTTTTTTTTTTTTT 5引物引物引物引物退火退火退火退火逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPs55pppppp55GG55pppppp55GG55pppppp55GG4 4）cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成 自身引导法自身引导法自身引导法自身引导法置换合成法置换合成法置换合成法置换合成法引导合成法引导合成法自身引导法：自身引导法：自身引导法：自身引导法：AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA 33TTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTT 55S1S1KlenowKlenowdNTPsdNTPsTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55AAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3NaOHNaOHTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55OHOH 33AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5555pppppp55GG获得的双链获得的双链获得的双链获得的双链cDNAcDNA 55端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。置换合成法：置换合成法：置换合成法：置换合成法：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55DNA DNA polpol I IRNaseHRNaseH55 AAAA AAAA 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55AAAAAAAA