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冷冻电镜技术Cryo-EM学号 201912708冷冻电镜技术学号 2019127081目录CONTENTS1冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述什么是Cryo-EM、冷冻电镜的分类2冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展1968Now3冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理样品冷冻、冷冻成像、三维重构4冷冻电镜技术的应用冷冻电镜技术的应用结构生物学、医疗、具体应用场景目CONTENTS1冷冻电镜技术的概述什么是Cryo-EM、2PART1 1冷冻电镜技术的概述PART1冷冻电镜技术的概述31 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述冷冻电镜即冷冻电子显微镜冷冻电镜即冷冻电子显微镜 (cryo-(cryo-electron microscopyelectron microscopy，cryo-EM)cryo-EM)，是将生物大，是将生物大分子快速冷冻后，在低温环境下利用透射电子分子快速冷冻后，在低温环境下利用透射电子显微镜对样品进行成像，再经图像处理和重构显微镜对样品进行成像，再经图像处理和重构计算获得样品的三维结构计算获得样品的三维结构。什么是什么是Cryo-EM1 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜即冷冻电子显微镜 (cry41 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述看清楚分子级别的结构必须用电子显微镜1 冷冻电镜技术的概述看清楚分子级别的结构必须用电子显微镜51 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述理论上电子剂量越高，成像质量越好然而生物分子太脆弱，无法承受法承受高剂量电子的冲击1 冷冻电镜技术的概述理论上电子剂量越高，成像质量越好61 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述用低剂量的电子束配合叠加平均的办法解析生物分子结构的方法成功拍照但要求分子在样品中整齐排列，这个方法普适性比较有限1 冷冻电镜技术的概述用低剂量的电子束配合叠加平均的办法解71 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述通过给成千上万个随机朝向的同一种生物分子照相，得到不同角度的二维图像后再运用计算机软件进行三维重建，得到分子的完整三维结构1 冷冻电镜技术的概述通过给成千上万个随机朝向的同一种生物81 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述使生物分子能够快速冷冻在玻璃态的水中来减轻对分子的破坏电镜底下观察可以得到高分辨率的照片1 冷冻电镜技术的概述使生物分子能够快速冷冻在玻璃态的水中9冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）冷冻透射电镜技术是在普通透射电镜上加装样品冷冻装置，将样品冷却到液氮温度(77 K),用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感样品的一种技术。通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。冷冻扫描电子显微镜（Cryo-SEM）冷冻扫描电镜技术一般是在普通扫描电镜上加装低温冷冻传输系统和冷冻样品台装置，它是在扫描电镜的基础上发展起来的一种技术，可以直接观察液体、半液体的样品，不需要对样品进行干燥处理，最大程度地减少了常规的干燥过程对高度含水样品的影响。冷冻蚀刻电子显微镜（Freeze-etching）冷冻蚀刻电镜技术是一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，可以显示细胞、组织微细结构的立体构像。它具有使微细结构接近于活体状态、能够观察到不同劈裂面的微细结构、能使样品具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存等优点。冷冻电镜的分类1 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）冷冻透射电镜技术是在普10冷冻蚀刻电子显微镜冷冻蚀刻电子显微镜原理是将样品置于干冰或液氮中进行冰冻，用冷刀劈开后，在真空中将温度回升到-100，使断裂面的冰升华，暴露出断面结构，最终得到可以观察的复膜样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构冷冻蚀刻的样品，可以经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存1 冷冻电镜技术的概述冷冻电镜技术的概述红细胞冷冻电镜蚀刻图冷冻蚀刻电子显微镜1 冷冻电镜技术的概述红细胞冷冻电镜蚀刻11PART2 2冷冻电镜技术的发展PART2冷冻电镜技术的发展12197419681975Aaron Klug开创了基于负染的噬菌体病毒的电镜三维重构技术Robert Glaeser首次提出并进行了冷冻含水生物样品的电镜成像。Richard Henderson利用电子显微三维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展 2 1981Joachim Frank完成了单颗粒三维重构算法及软件Spider。1982Jacques Dubochet开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作的不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品1990年Richard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的膜蛋白结构。2013冷冻电镜三维重构技术确定蛋白质TRPV1结构，标志着冷冻电镜跨入“原子分辨率”时代197419681975Aaron Klug开创了基于负染的13冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展 2 19751975年，年，Richard HendersonRichard Henderson（理查德（理查德亨德森）利用电子显微亨德森）利用电子显微三维重构技术首次获得三维重构技术首次获得7 7埃分辨率的细菌视紫红质埃分辨率的细菌视紫红质3D3D结构的历史性突结构的历史性突破。这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。破。这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行观察，借助进行观察，借助表面覆盖的表面覆盖的葡萄糖葡萄糖防止真空干涸防止真空干涸，并采用强度更低的，并采用强度更低的电子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之电子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之后，在前述后，在前述Aron KlugAron Klug等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。亨德森所发展出来的方法也具有其局限性，这是因为他所研究的亨德森所发展出来的方法也具有其局限性，这是因为他所研究的蛋白本身的特性让研究者能够采用所谓蛋白本身的特性让研究者能够采用所谓“冷冻电子断层成像术冷冻电子断层成像术”来测来测定其结构。简单来说，研究人员要转动细胞膜，从不同角度对蛋白拍定其结构。简单来说，研究人员要转动细胞膜，从不同角度对蛋白拍照，最终构建出蛋白的三维结构。照，最终构建出蛋白的三维结构。这种方法只适用于排列有一定规律这种方法只适用于排列有一定规律的蛋白的蛋白如果它们是杂乱无章的，这种方法就难以奏效了。如果它们是杂乱无章的，这种方法就难以奏效了。细菌视紫红质3D结构冷冻电镜技术的发展 2 1975年，Richa14冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展 2 19811981年，年，Joachim FrankJoachim Frank（约阿希姆（约阿希姆弗兰克）完成了单颗粒三维弗兰克）完成了单颗粒三维重构算法及软件重构算法及软件SpiderSpider，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式将图片模式将图片拟合成更加清晰的拟合成更加清晰的2D2D图像图像。在此基础上，通过数学方法，在。在此基础上，通过数学方法，在同一种蛋白质的不同同一种蛋白质的不同2D2D图像之间建立联系，以此为基础图像之间建立联系，以此为基础拟合出拟合出3D3D结构图结构图像像。单颗粒三维重构算法对于实现无需结晶的蛋白质三维结构解析至关。单颗粒三维重构算法对于实现无需结晶的蛋白质三维结构解析至关重要，弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的重要，弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基石基石。冷冻电镜单颗粒三维重构算法冷冻电镜技术的发展 2 1981年，Joach15样品冷冻技术样品冷冻技术在在19801980年代初，年代初，Jacques Jacques DubochetDubochet（雅克（雅克迪波什）用液态乙迪波什）用液态乙烷代替液氮将含水生物样品冷却，成烷代替液氮将含水生物样品冷却，成功将功将水玻璃态化水玻璃态化，（玻璃态的水和冰，（玻璃态的水和冰不一样，它无固定的形状，不存在晶不一样，它无固定的形状，不存在晶体结构，与固态相比，它更像一种极体结构，与固态相比，它更像一种极端黏滞、呈现固态的液体，体积不会端黏滞、呈现固态的液体，体积不会像冰一样膨胀。）在生物样本周围以像冰一样膨胀。）在生物样本周围以液态形式固化，使生物分子即使在真液态形式固化，使生物分子即使在真空中也能维持天然形态。空中也能维持天然形态。19821982年，他年，他领导的小组开发出真正成熟可用的快领导的小组开发出真正成熟可用的快速投入速投入冷冻制样技术冷冻制样技术制作不形成冰晶制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品，随着冷台技体的玻璃态冰包埋样品，随着冷台技术的开发，冷冻电镜技术正式推广开术的开发，冷冻电镜技术正式推广开来。并于来。并于19841984年用玻璃化方法得到了年用玻璃化方法得到了第一张被水包围着的病毒图像。时至第一张被水包围着的病毒图像。时至今日，冷冻电镜领域的研究者仍然应今日，冷冻电镜领域的研究者仍然应用该方法来制备样品。用该方法来制备样品。冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展 2 迪波什迪波什1975亨德森用葡萄糖保护（不能普遍使用）1982迪波什对生物样品进行玻璃化冷冻电镜样品制备问题的解决为冷冻电镜技术的发展提供了先决条件样品冷冻技术冷冻电镜技术的发展 2 迪波什1916冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展 2 原子级分辨率的细菌视紫红质蛋白的三维结构模型原子级分辨率的细菌视紫红质蛋白的三维结构模型1990年，亨德森发表了利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质蛋白原子水平的三维结构模型，这是第一个用冷冻电镜解析出来的膜蛋白结构。他的研究证实了用冷冻电镜技术可以确定分子蛋白的近原子分辨率的三维结构，被视作冷冻电镜发展史上的里程碑。冷冻电镜技术的发展 2 原子级分辨率的细菌视紫17冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展 2 冷冻电镜跨入冷冻电镜跨入“原子分辨率原子分辨率”时代时代20122013 年间，电子直接探测相机(electron direct detection device，DDD)的应用，使冷冻电镜技术突破了技术瓶颈，如虎添翼。DDD相机可以直接探测到高能电子，使信噪比和空间分辨率有了飞跃性的提高。并在2013年，研究者们终于获得了理想的原子级别成像，用以制作生物分子的三维结构图像。冷冻电镜技术的发展 2 冷冻电镜跨入“原子分辨18冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展 2 2013年加州大学旧金山分校（UCSF）程亦凡和David Julius的研究组首次得到膜蛋白TRPV1的3.43.4近原子级别的高分辨率三维结构（Nature上）。TRPV1蛋白的三维结构一种控制昼夜节律的蛋白质复合体（2017年诺贝尔生理及医学奖）自2015年确诊第一例以来，全球范围内超过150万人被感染寨卡（Zika）病毒一种可感知耳中压力变化、使人听到声音的蛋白质 冷冻电镜的发展就像是一场猛烈的革命这项技术将生物化学带入一个崭新时代冷冻电镜技术的发展 2 2013年加州大学旧金19冷冻电镜技术的发展冷冻电镜技术的发展 2 The Nobel Prize in Chemistry 2017Jacques DubochetJoachim FrankRichard Hendersonfor developing cryo-electron microscopy for the high-resolution structure determination of biomolecules in solution.冷冻电镜技术的发展 2 The Nobel P20PART3 3冷冻电镜技术的原理PART3冷冻电镜技术的原理213 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理 样品冷冻样品冷冻 冷冻成像冷冻成像 三维重构三维重构3 冷冻电镜技术的原理22样品冷冻的目标是在低温下使液态样品中的水不结晶而呈玻璃态，这样既能将样品在液相的状态固定，又避免了水结晶引起样品结构的破坏。因此，冷冻固定的关键是要阻止冰晶形成，冷冻固定是否成功，取决于冷冻过程迅速通过一个温度范围，即水开始结晶的温度到开始重结晶的温度区间，此区间受环境压力、样品浓度等因素的影响。常压下的纯水，从273 K开始结晶，因考虑到过冷水的作用，所以从231 K开始结晶，当温度低于重结晶温度165 K（-108）时，结晶过程停止。要使水变为玻璃态，必须急速冷却到165K。样品冷冻原理及操作过程3 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理样品冷冻的目标是在低温下使液态样品中的水不结晶而呈玻璃态，这23冷冻成像技术冷冻成像技术冷冻电镜成像前冷冻的样品要通过专门的设备冷冻输送器转移到电镜的样品室。在成像照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。冷冻电镜基本的成像过程大致相同，从电子源发射的高度相干的电子束穿透被玻璃态水包裹的样品，通过磁透镜系统将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术(minimal exposure technic)。要得到高分辨率的电镜图像，照相时累积的电子剂量不能超过临界剂量1000到2000 e/nm-2;中等分辨率的电镜图像图像不能超过临界剂量10000 e/nm-2。最小曝光技术要求首先在低放大倍数下寻找合适的区域;光学对位和聚焦应在邻近照相的区域进行。一些因素如：辐射损伤、电子束诱导的样品漂移和放电、电子束不均一等都能引起图像质量的下降。冷冻含水生物样品由于没有经过化学固定、染色、金属镀膜，所获得的图像反差小。冷冻含水样品电镜图像的反差取决于样品本身的散射反差、冰的厚度和物镜的欠焦量等因素。3 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理冷冻成像技术冷冻电镜成像前冷冻的样品要通过专门的设备冷冻243 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理三维重构技术-基本原理该基本原理基于数学中的傅立叶变换(Fourier transform，FT)相关的中央截面定理和傅立叶变换性质。中央截面定理可表述为:一个三维函数的投影函数的傅立叶变换等于该三维函数傅立叶变换通过坐标原点，且垂直于投影方向的截面函数。傅立叶变换具有的一个性质:一个函数的傅立叶变换的逆傅立叶变换，等价于原来的函数。该原理所涉及的步骤在数学上是复杂的，将这个原理应用于电镜图像:一个三维物体的电镜图像的傅立叶变换等于该三维物体的傅立叶变换通过物体中心并垂直于摄像方向的截面。一个物体(如蛋白质、病毒、细胞器、细胞)从不同方向所摄取的n个电镜图像做傅立叶变换，这些2D傅立叶变换图像的集合构成傅立叶空间，即该物体三维结构的三维傅立叶变换，对此三维傅立叶变换作逆傅立叶变换就恢复原物体的三维结构。这个原理奠定了电镜解析物体三维结构的基石，所有用电镜解析物体三维结构的方法都是基于这个原理。由于这一奠基性贡献，Aaron Klug 荣获1982 年诺贝尔化学奖。3 冷冻电镜技术的原理三维重构技术-基本原理该基本原理基于25利用电子显微镜对生物大分子在一维、二维以致三维空间形成的高度有序重复排列的结构（晶体）成像或者收集衍射图样，进而解析这些生物大分子的结构，这种方法称为电子晶体学。但是该技术只有在平面形成一层高度有序排列的蛋白质分子样品(在电镜领域称为“二维晶体”two-dimensional crystal)才能应用到冷冻电镜。随着记录电镜图像的电镜硬件和图像处理/三维重构的软件的成熟，该技术在冷冻电镜技术领域才会有更大的普适性。3 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理三维重构技术-电子晶体学利用电子显微镜对生物大分子在一维、二维以致三维空间形成的高度26利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D 结构图像。计算机可以根据细微的差异将图像自动分类，把颗粒分成不同的集群，每个集群代表一个具有特定位置和结构的颗粒的二维投影。在同一集群里不同颗粒被假定为具有足够的相似性，允许进入叠加和平均值的计算，使信噪比得以提高。3 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理三维重构技术-单颗粒技术利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓273 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理roofdoorwindows653421颗粒挑选图像对齐图像分类确定方向三维重构结构分析三维重构技术-单颗粒技术简单演示3 冷冻电镜技术的原理roofdoorwindows653283 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理三维重构技术-电子断层成像技术通过在显微镜内倾转样品从而收集样品多角度的电子显微图像并对这些电子显微图像根据倾转几何关系进行重构的方法称为电子断层扫描成像技术。该方法主要应用于细胞及亚细胞器，以及没有固定结构的生物大分子复合物（分子量范围为800kD），最高分辨率约20。3 冷冻电镜技术的原理三维重构技术-电子断层成像技术通过在293 冷冻电镜技术的原理冷冻电镜技术的原理三维重构技术研究尺度研究尺度研究对象研究对象研究方法研究方法生物大分子二维晶体纤维或管状晶体电子晶体学（周期排列）生物大分子复合体单颗粒生物大分子及复合体、病毒等单颗粒技术（全同粒子）亚细胞水平超分子复合体、细胞器、亚细胞结构电子断层成像技术（单一结构）3 冷冻电镜技术的原理三维重构技术研究尺度研究对象研究方法30PART4 4冷冻电镜技术的应用PART4冷冻电镜技术的应用31冷冻电镜技术的冷冻电镜技术的优点优点冷冻电镜技术的应用冷冻电镜技术的应用 4 不需要对样品进行特殊化处理（如不需要结晶），研究速度大大提高。样品需求量小，可重复性高。更接近生理状态，可获得不同构象或中间物的动态快照。适用研究范围广，可以研究天然的、动态的结构，也可以对不均一样品进行研究。冷冻电镜技术的突破，把结构生物学从“静态结构生物学”变成了“动态结构生物学”，把结构和功能真正对应起来。极大的推动结构生物学和细胞生物学的发展，冷冻电子显微镜技术还将广泛应用于细胞组织的超微结构解析。冷冻电镜技术革命还将开启巨大的潜在医疗价值。冷冻电镜技术方法在时间和精度方面的大幅度提高有时会导致不可预测的重大科学和应用价值。冷冻电镜技术的应用将推进重大疾病药物的研发工作，标靶药物因其副作用小、药效更明显，是未来医药界研究的主流，而靶向研究中最重要的工作就是分析小分子和蛋白质是如何结合在一起的，这就需要冷冻电镜技术。冷冻电镜技术的优点冷冻电镜技术的应用 4 不需32冷冻电镜技术的应用冷冻电镜技术的应用 4 1.研究那些不适合于应用X-射线晶体学和核磁共振波谱学的分子及其聚合物的结构如：Alzheimer疾病(阿尔茨海默病,俗称老年痴呆症)的淀粉状蛋白纤维聚合物的结构2.研究生物大分子处于不同功能状态时的结构如：离子通道开关3.为X-射线晶体学结构解析提供初始分子置换模型及初始相位如：核糖体的三维结构4.研究生物大分子复合物的结构如：病毒-受体复合物的结构5.研究细胞器甚至是活细胞的结构如:生物分子在运动过程中的结构和结构的变化冷冻电镜技术的应用 4 1.研究那些不适合于应33THANKS湘北THANKS湘北34