实验大肠杆菌的培养和分离培训ppt课件

实验大肠杆菌的培养和分离实验大肠杆菌的培养和分离1 细菌细胞由外向细菌细胞由外向里依次有里依次有:鞭毛和菌（纤）毛鞭毛和菌（纤）毛荚膜荚膜细胞壁细胞壁细胞膜细胞膜细胞质细胞质拟核区拟核区(类核区类核区)1 1、细菌的构造、细菌的构造图图图图1-3 1-3 细菌的结构细菌的结构细菌的结构细菌的结构繁殖方式：分裂繁殖（繁殖方式：分裂繁殖（20min分裂一次）分裂一次）实验大肠杆菌的培养和分离2 细菌细胞由外向里依次有:1、细菌的构造图1-3 2、菌落：n单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做的子细胞群体，叫做菌落菌落。n菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。实验大肠杆菌的培养和分离32、菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一菌落细菌的菌落特征细菌的菌落特征因种而异因种而异 实验大肠杆菌的培养和分离4菌落细菌的菌落特征因种而异 实验大肠杆菌的培养和分离4n碳源碳源n氮源氮源n生长因子生长因子n无机盐无机盐n水水微生物需要的五大类营养要素物质微生物需要的五大类营养要素物质3 3、培养基、培养基 培养基（培养液）是培养基（培养液）是人工方法配制而成的，人工方法配制而成的，是微生物生存的环境和营养物质是微生物生存的环境和营养物质。实验大肠杆菌的培养和分离5碳源微生物需要的五大类营养要素物质3、培养基 1 1）培养基的成分）培养基的成分（a a）细菌培养基：）细菌培养基：特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠 酸碱度：中性偏碱酸碱度：中性偏碱（b b）霉菌培养基：）霉菌培养基：特殊成分：无机物或添加蔗糖的豆芽汁特殊成分：无机物或添加蔗糖的豆芽汁 酸碱度：中性偏酸酸碱度：中性偏酸实验大肠杆菌的培养和分离61）培养基的成分（a）细菌培养基：实验大肠杆菌的培养和分离62 2）培养基的种类）培养基的种类（1 1）按物理性质分）按物理性质分:a.a.固体培养基固体培养基 通常加通常加琼脂琼脂，作为凝固剂，作为凝固剂 （凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基（凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基固化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收）固化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收）作用：作用：分离（纯化）细菌、计数、保留菌种分离（纯化）细菌、计数、保留菌种等等 b.b.液体培养基液体培养基 不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同 作用：作用：培养细菌培养细菌实验大肠杆菌的培养和分离72）培养基的种类（1）按物理性质分:实验大肠杆菌的培养和分离液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长实验大肠杆菌的培养和分离8液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长实验大肠杆菌的培养和固体培养基：菌落固体培养基：菌落实验大肠杆菌的培养和分离9固体培养基：菌落实验大肠杆菌的培养和分离9（2 2）根据）根据化学成分化学成分分分n合成培养基合成培养基成分明确成分明确n天然培养基天然培养基成分不明确成分不明确实验大肠杆菌的培养和分离10（2）根据化学成分分实验大肠杆菌的培养和分离10（3 3）按培养基的用途分类）按培养基的用途分类 na a基础培养基（基础培养基（LBLB培养基）培养基）:含有一般细菌生长含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培基是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。养基。nb b营养培养基（加富培养基）营养培养基（加富培养基）:在基础培养基中在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液、血清或生长因加入某些特殊营养物质，如血液、血清或生长因子等。用以培养对营养要求高的微生物。子等。用以培养对营养要求高的微生物。实验大肠杆菌的培养和分离11（3）按培养基的用途分类 a基础培养基（LB培养基）:含有c c c c、选择培养基、选择培养基、选择培养基、选择培养基在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物质质质质,以以以以抑制不需要的微生物的生长抑制不需要的微生物的生长抑制不需要的微生物的生长抑制不需要的微生物的生长,促进所需要促进所需要促进所需要促进所需要的微生物的生长的微生物的生长的微生物的生长的微生物的生长,如如如如n n尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微生物。生物。生物。生物。d d d d、鉴别培养基、鉴别培养基、鉴别培养基、鉴别培养基在培养基中加入某种指示剂在培养基中加入某种指示剂在培养基中加入某种指示剂在培养基中加入某种指示剂或化学药品或化学药品或化学药品或化学药品,用以用以用以用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类的微生物,如如如如n n伊红和美蓝伊红和美蓝伊红和美蓝伊红和美蓝,和大肠杆菌的代谢产物结合和大肠杆菌的代谢产物结合和大肠杆菌的代谢产物结合和大肠杆菌的代谢产物结合,使使使使菌落呈深紫色菌落呈深紫色菌落呈深紫色菌落呈深紫色,并带有金属光泽并带有金属光泽并带有金属光泽并带有金属光泽,可以用来鉴可以用来鉴可以用来鉴可以用来鉴别大肠杆菌别大肠杆菌别大肠杆菌别大肠杆菌实验大肠杆菌的培养和分离12实验大肠杆菌的培养和分离12二、无菌操作技术二、无菌操作技术1 1、概念、概念 无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所在培养微生物的操作中，所有有防止杂菌污染防止杂菌污染的方法。的方法。无论是随后将要学到无论是随后将要学到的的倒平板倒平板、平板划线平板划线操作，还是操作，还是平板稀释涂布平板稀释涂布法法，其操作中的每一步都需要做到，其操作中的每一步都需要做到“无菌无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。操作，才可能成功地培养微生物。实验大肠杆菌的培养和分离13二、无菌操作技术1、概念 无菌操作泛指在培养微生物的2 2、无菌技术包括：、无菌技术包括：（1 1）对实验操作空间、操作者的衣着）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行和手进行 清洁和消毒清洁和消毒 ；（2 2）将培养器皿、接种用具和培养基）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行等器具进行 灭菌灭菌 ；（3 3）为避免周围微生物污染，实验操）为避免周围微生物污染，实验操作应在作应在 酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近 进行；进行；（4 4）避免已灭菌处理的材料用具）避免已灭菌处理的材料用具与与 周围物品周围物品 相接触。相接触。实验大肠杆菌的培养和分离142、无菌技术包括：实验大肠杆菌的培养和分离14（1 1）消毒定义：消毒定义：利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理方法，杀死大部份大部份致病微生物致病微生物的过程。的过程。3 3、消毒与灭菌的概念及两者的区别、消毒与灭菌的概念及两者的区别 （2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：以化学或物理方法消灭以化学或物理方法消灭所有微生物所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到毒，而达到完全无菌完全无菌的过程。的过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。最普通也是最重要的技术。实验大肠杆菌的培养和分离15（1）消毒定义：3、消毒与灭菌的概念及两者的区别 （2（3 3）具体无菌处理方法）具体无菌处理方法：（a a）消毒：）消毒：1 1 1 1）对接种室、接种箱或超净工作台先用）对接种室、接种箱或超净工作台先用）对接种室、接种箱或超净工作台先用）对接种室、接种箱或超净工作台先用 紫外线紫外线 进行物理消毒，然后用进行物理消毒，然后用进行物理消毒，然后用进行物理消毒，然后用 酒精酒精 增强消毒效果。增强消毒效果。增强消毒效果。增强消毒效果。2 2 2 2）实验操作者的双手使用）实验操作者的双手使用）实验操作者的双手使用）实验操作者的双手使用 酒精酒精 进行消毒。进行消毒。进行消毒。进行消毒。3 3 3 3）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。4 4 4 4）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。实验大肠杆菌的培养和分离16（3）具体无菌处理方法：1）对接种室、接种箱或超净工作台先用 巴氏消毒法是法国科学家巴斯德创建的一巴氏消毒法是法国科学家巴斯德创建的一种食品保鲜方法，最早是为了延长法国葡萄酒种食品保鲜方法，最早是为了延长法国葡萄酒的保质期。这是一种能将绝大多数的细菌杀死的保质期。这是一种能将绝大多数的细菌杀死的低温消毒方法。的低温消毒方法。牛奶消毒也用巴氏消毒法。牛奶消毒也用巴氏消毒法。具体措施：牛奶在具体措施：牛奶在62.862.8摄氏度下摄氏度下3030分钟。分钟。优点：最大限度地保持了牛奶的品质，颜优点：最大限度地保持了牛奶的品质，颜色，味道和营养。色，味道和营养。实验大肠杆菌的培养和分离17 巴氏消毒法是法国科学家巴斯德创建的一种食品保鲜方法，(b)(b)灭菌：灭菌：1 1）灼烧灭菌）灼烧灭菌 接种环、玻璃刮刀接种环、玻璃刮刀 试管口试管口2 2）高压蒸气灭菌：）高压蒸气灭菌：1kg/cm1kg/cm2 2压力、压力、121121、15min15min培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、三角刮刀、接种环、三角刮刀、接种环、镊子、无菌水、培养基镊子、无菌水、培养基高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分。高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分。实验大肠杆菌的培养和分离18(b)灭菌：1）灼烧灭菌培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移三、分离细菌方法三、分离细菌方法1 1、划线分离法（、划线分离法（P20P20）（视频）（视频）1 1）灼烧接种环；）灼烧接种环；2 2）接种环接种环冷却后，蘸取带菌培养物冷却后，蘸取带菌培养物 3 3）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养 基上划线。基上划线。划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。成单个菌落。实验大肠杆菌的培养和分离19三、分离细菌方法1、划线分离法（P20）（视频）实验大肠杆菌的培养和分离20实验大肠杆菌的培养和分离20实验大肠杆菌的培养和分离培训ppt课件212 2、涂布分离法、涂布分离法1)1)稀释菌液稀释菌液 （10-5 10-7倍）倍）用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取1ml1ml1ml1ml细菌培养液加入另一个盛有细菌培养液加入另一个盛有细菌培养液加入另一个盛有细菌培养液加入另一个盛有9ml9ml9ml9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成无菌水的试管中，混合均匀，以此制成无菌水的试管中，混合均匀，以此制成无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10101010-1-1-1-1倍的倍的倍的倍的稀释液。稀释液。稀释液。稀释液。3)3)涂布涂布 用无菌吸管取用无菌吸管取用无菌吸管取用无菌吸管取0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml稀释度不同的菌液，加在培稀释度不同的菌液，加在培稀释度不同的菌液，加在培稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将养皿的固体培养基上。再将养皿的固体培养基上。再将养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀玻璃刮刀玻璃刮刀玻璃刮刀放在酒精灯火放在酒精灯火放在酒精灯火放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。将菌液涂布到整个平面上。将菌液涂布到整个平面上。将菌液涂布到整个平面上。4)4)培养培养 将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在37373737恒温箱中培养恒温箱中培养恒温箱中培养恒温箱中培养2448h2448h。实验大肠杆菌的培养和分离222、涂布分离法1)稀释菌液（10-5 10-7倍）实实验大肠杆菌的培养和分离23实验大肠杆菌的培养和分离23实验大肠杆菌的培养和分离24实验大肠杆菌的培养和分离241.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒）需要消毒。实验大肠杆菌的培养和分离251.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外四、大肠杆菌的培养和分离四、大肠杆菌的培养和分离1 1、大肠杆菌、大肠杆菌（1 1）特性：）特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2 2）用途：）用途：基因工程技术中被广泛采用的工具基因工程技术中被广泛采用的工具2 2、培养：、培养：LB LB液体培养基液体培养基 扩大培养扩大培养 LBLB固体培养基固体培养基 分离分离实验大肠杆菌的培养和分离26四、大肠杆菌的培养和分离实验大肠杆菌的培养和分离263 3、分离、分离培养基灭菌培养基灭菌制作平板制作平板扩大培养扩大培养划线分离划线分离菌种保存菌种保存将将LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌汽灭菌将灭菌后冷却到将灭菌后冷却到60的的LB固体培养基倒固体培养基倒入灭菌过的培养皿中，制作平面培养基入灭菌过的培养皿中，制作平面培养基.将大肠杆菌从斜面接种到将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基液体培养基中，然后在中，然后在37摇床中震荡培养摇床中震荡培养12h。用接种环取震荡培养后的菌液，并在用接种环取震荡培养后的菌液，并在固固体培养基体培养基上划线，然后将划线后的培养上划线，然后将划线后的培养皿皿倒置倒置与与37的恒温培养箱中培养的恒温培养箱中培养1224h，观察划线末端的菌落生长情况，观察划线末端的菌落生长情况.用接种环取单菌落，用划线法接种于斜用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在面上，在37的恒温培养箱中培养的恒温培养箱中培养24h，再放入，再放入4的冰箱中保存的冰箱中保存。实验大肠杆菌的培养和分离273、分离培养基灭菌制作平板扩大培养划线分离菌种保存将LB液体倒平板技术倒平板技术倒平板技术倒平板技术实验大肠杆菌的培养和分离28倒平板技术实验大肠杆菌的培养和分离28微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养实验大肠杆菌的培养和分离29微生物的恒温培养微生物的恒温培养实验大肠杆菌的培养和分离29微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养实验大肠杆菌的培养和分离30微生物的恒温培养实验大肠杆菌的培养和分离30菌种的保存菌种的保存接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。实验大肠杆菌的培养和分离31菌种的保存实验大肠杆菌的培养和分离31 1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到60 60 左右时，才能左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可进行倒平板了。的温度下降到刚刚不烫手时，就可进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。实验大肠杆菌的培养和分离32 1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平3.3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。实验大肠杆菌的培养和分离333.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。感染操作者。实验大肠杆菌的培养和分离34问题讨论 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。实验大肠杆菌的培养和分离35 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划