固定化酶和固定化细胞

固定化酶和固定化细胞固定化酶和固定化细胞固定化酶的定义固定化酶的定义v所谓固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。Company Logov1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象；v1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例；v1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称Immobilized Enzyme；v1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-天冬氨酸。v1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。酶固定化技术发展史酶固定化技术发展史Company Logov从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。发展现状发展现状Company Logo固定化酶的优点固定化酶的优点同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型。Company Logo固定化酶的制备原则固定化酶的制备原则v（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。v（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。v（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。Company Logov（4）固定化酶应有最小的空间位阻。v（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。v（6）固定化酶的成本适中。Company Logo固定化酶（细胞）的制备方法固定化酶（细胞）的制备方法 酶和细胞固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理（细胞）Company LCompany Logo1、吸附法、吸附法v通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。v吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。Company Logov物理吸附法(physical adsorption)是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键。v物理吸附法常用的载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。物理吸附法物理吸附法Company Logov离子吸附法(ion adsorption)是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。v此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。离子吸附法离子吸附法Company Logov离子吸附法常用的载体：v阴离子交换剂：DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素等；v阳离子交换剂有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等。v其吸附容量一般大于物理吸附剂。离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。Company Logo2、包埋法、包埋法v包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。Company Logov（1）凝胶包埋法 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。Company Logov（2）微胶囊包埋法 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。Company Logo3 3、共价键结合法、共价键结合法v共价键结合法(covalent binding）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。Company Logov（1）酶蛋白N末端的-氨基或赖氨酸残基的-氨基。v（2）酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。v（3）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。v（4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲哚基。酶蛋白上可供载体结合的功能基团酶蛋白上可供载体结合的功能基团vv酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。基和羧甲基等。Company Logo载体活化的主要反应载体活化的主要反应v重氮法v叠氮法v溴化氰法v芳香烃化法Company Logov（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。v常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。Company Logov（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。v含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。Company Logov（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。v任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。Company Logov（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。v此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。Company Logov优点：共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。v缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化。Company Logo4 4、交联法、交联法v交联法（cross-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。v常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物等。v戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。Company LCompany Logo5、选择性热变性法、选择性热变性法v专用于细胞固定化。是将细胞在适当的温度下处理使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。Company Logo6、固定化活细胞、固定化活细胞v将活细胞限制或定位于特定空间位置的方法。Company Logov无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；v保持了酶的原始状态，比固定化酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；v细胞本身含多酶系统，可催化一系列反应，且不需添加辅助因子；v细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等。固定化活细胞的优越性固定化活细胞的优越性Company Logov缺点缺点必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。Company Logo制备方法制备方法v固定化活细胞的制备条件比固定化酶更要温和，其制备方法主要有物理吸附法和包埋法两种。Company LogoCompanyLOGO固定化酶的特性固定化酶的特性固定化酶的形状固定化酶的形状v固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒状、纤维状、酶膜和酶管等形状。v其中颗粒占绝大多数，它和纤维状主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应。Company Logo固定化酶的性质固定化酶的性质v酶活力v酶稳定性v酶学特性Company Logo固定化酶的酶活力固定化酶的酶活力v固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合；高级结构和空间构象的改变；空间位阻的影响；内扩散阻力；半透膜的隔离。v个别情况下，酶经固定化后其活力升高。Company Logo固定化酶的稳定性固定化酶的稳定性 v操作稳定性：体内半衰期v贮藏稳定性：低温放置v热稳定性：耐热性提高v对蛋白酶的稳定性：空间位阻v其他：对有机溶剂、pH、酶抑制剂等的稳定性均有提高。Company Logo固定化酶的酶学特性固定化酶的酶学特性v底物特异性：对高分子底物的活性明显下降；v最适pH：最适pH和pH曲线常会发生偏移；v最适温度：多数较游离酶高；v动力学常数：Km均增大，增大幅度视情况而定；v最大反应速度：与游离酶大多数是相同或相近。Company LogoCompanyLOGO酶反应器及其类型酶反应器及其类型酶反应器的定义酶反应器的定义v以酶为催化剂进行反应所需要的设备称之为酶催化反应器，简称酶反应器。Company Logo酶反应器的类型酶反应器的类型v间歇式搅拌罐反应器，BSTRv连续流动搅拌罐反应器，CSTRv填充床反应器，PBRv流化床反应器，FBRv连续搅拌罐-超滤膜反应器，CSTR/UFRv循环式反应器，RCRCompany LogoCompanyLOGO反应器的结构特点反应器的结构特点 v这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料和食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。常用于游离酶。BSTR间歇式搅拌罐反应器，间歇式搅拌罐反应器，BSTRCompany Logov这种反应器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反应器，与此同时，反应液则以同样的流速流出反应器。反应桶内装有搅拌器，使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡。连续流动搅拌罐反应器，连续流动搅拌罐反应器，CSTRCSTRCompany Logo优点：反应液混合良好，各部位的成分相同，并与流出液的组成也一致。CSTR的开放结构使得调换固定化酶比较容易，而且有利于控制温度和调节pH，还能够处理胶态或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用CSTR有较高的转化率。缺点：由搅拌产生的剪切力较大，易打碎磨损固定化酶颗粒。需改良的CSTR。Company Logo填充床反应器，填充床反应器，PBRPBRv又称固定床反应器。可填充多向异性半透性中空纤维制成管状，内部填充酶膜、酶片等。v在填充床反应器内，底物在一定方向上以恒定的速度通过固定化酶柱，以近似活塞式流动反应器（Plug Flow Reactor，PFR）运转。Company Logo流化床反应器，流化床反应器，FBRFBRvFBR种装有较小颗粒的垂直塔式反应器。反应时，底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其混合程度介于CSTR的全混型和PFR的平推流型之间。由于反应器内混合程度高，因此，传热、传质情况良好，可处理粘性大、含有固体颗粒的底物。Company Logo连续搅拌罐连续搅拌罐-超滤膜反应器，超滤膜反应器，CSTR/UFRCSTR/UFRvCSTRUF结构是CSTR与超滤装置联用的酶膜反应器。在CSTR出口处设置一个超滤装置，通过超滤装置，酶可以循环使用。该超滤器中的半透性超滤膜只允许小分子产物通过，不允许大分子酶和底物通过。v该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。Company Logo循环式反应器，循环式反应器，RCR外循环反应器外循环反应器 内循环反应器内循环反应器 循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会，以达到所需的转化率。这种反应器可用于难溶或者不溶性底物的转化反应。Company Logo酶反应器的选择依据酶反应器的选择依据v根据固定化酶的形状：溶液酶：BSTR颗粒状和片状：CSTR、PBR膜状和纤维状：PBR容易变形、易粘结、颗粒细小：FBRv根据底物的物理性质溶解性和浊液性底物：任何类型颗粒状和胶状底物：CSTR、FBR、RCRCompany Logov根据酶反应动力学特性产物对酶活性抑制：PBR底物对酶活性抑制：CSTRv根据外界环境对酶的稳定性的影响改良的CSTRv根据操作要求及反应器费用CSTRCompany LogoCompanyLOGO固定化细胞法生产固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸基本原理基本原理v青霉素G经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6-氨基青霉烷酸，也称无侧链青霉素。6-APA结构式Company Logo工艺路线工艺路线大肠杆菌的培养大肠杆菌固定化固定化大肠杆菌反应堆制备转化反应6-氨基青霉烷酸的提取Company Logo工艺要点工艺要点v大肠杆菌的培养大肠杆菌的培养菌种：大肠杆菌D816斜面培养基：普通肉汤琼脂培养基发酵培养基：蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水发酵条件：通气搅拌培养，28，pHCompany Logov大肠杆菌固定化大肠杆菌固定化取湿菌体 100 kg，置于40反应罐中，在搅拌下加入50L10%戊二醛5 升，在转移至搪瓷盘中，使之成为3-5 cm厚的液层，室温放置2 小时，再转移至4 冷库过夜，待形成固体凝胶后，通过粉碎和过筛，使其成为直径为2 mm左右的颗粒状固定化大肠杆菌细胞，用蒸馏水以pH7.5和0.3mol/L磷酸缓冲液先后充分洗涤，抽干，备用。Company Logov固定化大肠杆菌反应堆制备固定化大肠杆菌反应堆制备将上述充分洗涤后的固定化大肠杆菌细胞装填于带保温夹套的填充式反应器中，即成为固定化大肠杆菌反应堆，反应器规格为直径70160 cm。Company Logov转化反应转化反应v取 20 kg青霉素G钾盐，加入到1000L配料罐中，用0.03 mol/L、pH7.5 的磷酸缓冲液溶解并使青霉素G钾盐浓度为3%，用2 mol/L氢氧化钠溶液调pH 至7.5-7.8，然后将反应器及pH 调节罐中反应液温度到0，维持反应体系的酸度在7.5-7.8 范围内，以70L/min流速使青霉素G钾盐溶液通过固定化大肠杆菌反应堆进行循环转化，直至转化液酸度不变为止。循环时间一般为3-4h，反应结束后，放出转化液，再进入下一批反应。Company Logov6-氨基青霉烷酸的提取上述转化液经过滤澄清后，滤液用薄膜浓缩器减压浓缩至100 L左右，冷却至室温后，于250L搅拌罐中加50L醋酸丁酯充分搅拌提取10-15min，取下层水相，加1%活性炭于70搅拌脱色30min，滤除活性炭，滤液用6mol/L HCl调pH至4 左右，5放置结晶过夜，次日滤取结晶，用少量冷水洗涤，抽干，115烘2-3h得成品6-氨基青霉烷酸，收率为70-80%。Company Logo