《核酸的研究方法》PPT课件

第 十 五 章 核 酸 的 研 究 方 法 1、 核 酸 的 分 离 、 提 纯 和 定 量 测 定 DNA的 分 离 RNA的 分 离 核 酸 的 定 量 Isolation of Nucleic AcidsGoals: removal of proteins DNA vs RNA isolation of a specific type of nucleic acid Types of Methods: differential solubility adsorption methods density gradient centrifugationTypes of DNA: genomic (chromosomal) organellar (satellite) plasmid (extra-chromosomal) phage/viral (ds or ss) complementary (mRNA) General Features: denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic) enzyme treatments protease RNase (DNase-free) DNase (RNase-free) Collection of cellsUse soft brushes to dislodge epithelial cells lining the mouth. Ample cell collection is very critical for success. Whats in Lysis Buffer? Tris buffer to maintain pH of solution so that DNA is stable SDS to dissolve membranes of cell, allowing DNA to be released into solution SDS also denatures proteins, making them more susceptible to protease cleavageLysis buffer O S OO O- SDSCH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3- Why add Protease? Protease destroys nuclear proteins that bind DNA, and cytoplasmic enzymes that breakdown and destroy DNA (nucleases) Protease treatment increases the yield of DNA Adding salt (5M NaCl) Na+ binds to phosphate groups of DNA, neutralizing the electric charge of DNA NaCl allows DNA molecules aggregate instead of repelling each other, making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is added Adding ice cold alcohol DNA cannot dissolve in alcohol The addition of cold alcohol makes the DNA clump together and precipitate out of solution Precipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strands Microscopic oxygen bubbles “aggregate” or “fuse” together, simultaneously with the DNA precipitation The larger, visible air bubbles act to “lift” the DNA out of solution, from the aqueous into the organic phaseDNA Precipitation H igh MW G enomic DNA IsolationTypical Procedure1 Cell Lysis 0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)2 Phenol Extraction gentle rocking several hours3 Ethanol Precipitation4 RNAse followed by proteinase K5 Repeat phenol extrac-tion and EtOH ppt Phenol Extraction mix sample with equal volume of sat. phenol soln retain aqueous phase optional chloroform/isoamyl alcohol extraction(s) aqueous phase (nucleic acids) phenol phase (proteins) H igh MW G enomic DNA IsolationTypical Procedure1 Cell Lysis 0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)2 Phenol Extraction gentle rocking several hours3 Ethanol Precipitation4 RNAse followed by proteinase K5 Repeat Phenol Extrac-tion and EtOH ppt EtOH Precipitation 2-2.5 volumes EtOH, -20o high salt, pH 5-5.5 centrifuge or spool out Isolation of RNASpecial Considerations RNAse inhibitors! extraction in guanidine salts phenol extractions at pH 5-6 (pH 8 for DNA) treatment with RNase-free DNase selective precipitation of high MW forms (rRNA, mRNA) with LiCl oligo-dT column 2、 核 酸 的 沉 降 特 性 通 常 很 难 分 离 出 完 整 DNA分 子 ， 但 可 得 到 分 子 量 不 太大 的 环 状 DNA， 这 类 制 剂 包 括 ： 共 价 闭 环 DNA： 常 呈 超 螺 旋 型 开 环 DNA： 双 链 环 状 DNA的 一 条 链 断 裂 ， 分 子 呈 松 弛态 线 型 DNA： 环 状 DNA的 双 链 断 开 在 超 速 离 心 机 造 成 的 离 心 力 场 中 ， 溶 液 中 的 核 酸 下 沉的 速 率 会 大 大 加 快 ， 这 是 核 酸 的 沉 降 特 性 ， 该 技 术 可研 究 ： 核 酸 在 溶 液 中 的 构 象 测 定 核 酸 的 沉 降 系 数 和 相 对 分 子 量 氯 化 铯 密 度 梯 度 沉 降 平 衡 超 离 心 法 核 酸 密 度 测 定 测 定 DNA中 G-C之 含 量 溶 液 中 核 酸 构 象 的 研 究 用 于 核 酸 的 制 备 Density G radient Centrifugation rate zonal/sucrose (size fractionation) electrophoresis more common isopycnic/CsCl (density) DNA 1.7 g/cm3 protein 1.3 g/cm3 RNA DNA ssDNA dsDNA GC content 20 40 60 80% GC base pairs1.681.701.721.74density (g/cm3 ) CsCl G radients Applications large scale preparations high purity satellite DNA RNA cushionsCsCl G radients 三 、 核 酸 的 凝 胶 电 泳 凝 胶 电 泳 兼 有 分 子 筛 和 电 泳 的 双 重 效 果不 纯 核 酸 样 品 ： 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 出 区 带 溴 化 乙 锭 染 色 紫 外 灯 下 粗 略 估 计 含 量 电 泳 迁 移 率 取 决 于 ： 核 酸 分 子 大 小 胶 浓 度 DNA的 构 象 电 流 碱 基 组 成 温 度 凝 胶 电 泳 的 样 品 可 进 行 回 收 聚 丙 烯 酰 胺 作 为 支 持 物 孔 径 小 于 丙 烯 酰 胺 可 分 析 小 于 1000bp的 DNA片 断聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 4、 核 酸 的 核 苷 酸 序 列 测 定 DNA一级结构的测定 Sanger发明的末端终止法 M. Maxam和W. Gilbert 发明的化学断裂法焦磷酸测序 。 前两种方法一般都会用放射性32P对DNA进行标记，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的核酸片段进行分离，分离以后还需要使用放射自显影的技术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同位素对DNA进行标记。焦磷酸测序是新一代DNA序列分析技术，该项技术无需电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。 末端终止法末端终止法也叫双脱氧法。要想理解此方法的原理，需要对DNA复制的过程有所了解。DNA是一种双螺旋分子，其复制是在DNA聚合酶催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新DNA链的过程。复制需要引物和四种dNTPs，总是从5-端向3-端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA，但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3-端自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断地形成新的3,5-磷酸二酯键，使DNA链得到延伸，直到一个新的DNA分子完全被合成。 末端终止法?进行四组平行反应?每一组反应混合物含有dATP, dGTP, dCTP和dTTP，有一种被32P标记?每一组反应含有一种少量的ddATP或ddGTP或ddCTP或ddTTP。?在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸。?有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止。?每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。?对每一组反应混合物走凝胶电泳。?片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。?从凝胶的底部向上读出序列。 ?将读出的序列转化成互补链的序列。 化学断裂法其基本原理是用特殊的化学试剂，处理待测的具有末端放射性同位素（32P）标记的单链DNA或者只有一条链的末端被放射性同位素标记的双链DNA片段，造成特定碱基的修饰、脱落和戊糖-磷酸骨架被特异性切割，从而产生一组长度不同的DNA链降解产物，经聚丙烯凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 化学断裂法进行四组平行的反应： G特异性剪切 在碱性条件下，先用硫酸二甲酯（ DMS ）处理，然后再使用哌啶处理。嘌呤碱基特异性剪切DNA先进行酸处理，然后再加DMS。嘧啶碱基特异性剪切先用肼处理，然后用哌啶处理。 C特异性剪切在高盐浓度下，先用肼处理，然后用哌啶处理。即进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G、AG、CT和C各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出DNA序列。 焦磷酸测序焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链的3-端并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。 DNA自动分析仪的组成 RNA一级结构的测定目前用来测定RNA一级结构的方法主要有：（1）先使用逆转录酶将待测RNA逆转录成cDNA，然后再使用Sanger的末端终止法进行测定；（2）用化学或/和酶学方法对放射性同位素标记的RNA进行部分消化后，再进行聚丙烯酰胺电泳分析；（3）质谱法 DNA Sequencing Analysis Sanger dideoxynucleotide chain termination analysis Procedure for the Sanger dideoxy chain termination technique DNA to be sequenced is cloned into a vector, adjacent to a primer site Four reactions are set up - each containing one of four ddNTPs DNA is synthesized in the presence of the ddNTPs, giving rise to sets of DNA products representing all of the possible size fragments for the unknown sequence The fragments are resolved by gel electrophoresis and the sequenceis read up from the bottom of the gel by identifying the lane givingthe next larger size fragment DNA to be sequenced is cloned into the EcoRI site immediately adjacent to the primer binding siteEcoRI Sal I gene for ampicillinresistance gene for tetracycline resistancePst Iori primer binding sitepBR322 53 | 3 For sequencing the DNA is denatured into single strands the primer is hybridized to the template strand DNA is synthesized using DNA polymerase structure of a dNTP structure of a ddNTP (dideoxynucleotide)O BASE (A, T, G, C)HOOPOPOP CO O OO- O- O-O- OHO O O O BASE (A, T, G, C)OPOPOP CO- O- O-O- OH 53 |ddATPDNAdNTPs ddTTPDNAdNTPs ddGTPDNAdNTPs ddCTPDNAdNTPsA T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C T AT A G T AT A G T A C AT A G T A C A G T AT A G T A C A G T A G T T C AT A G T A C A G T A G T T C A G A All possible products of the reactioncontaining ddATP Each fragment is terminated by a ddA 53 | A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C A T G C TAGTACAGTAGTTCAGATCGTG Longer fragmentsShorter fragments Sequenceof thestrandthat wassynthesized 5、 聚 合 酶 链 式 反 应 PCR（ Polymerase Chain Reaction） 即 聚 合酶 链 式 反 应 ， 是 指 在 DNA聚 合 酶 催 化 下 ， 以 母链 DNA为 模 板 ， 以 特 定 引 物 为 延 伸 起 点 ， 通 过变 性 、 退 火 、 延 伸 等 步 骤 ， 体 外 复 制 出 与 母链 模 板 DNA互 补 的 子 链 DNA的 过 程 。 是 一 项 DNA体 外 合 成 放 大 技 术 ， 能 快 速 特 异 地 在 体 外 扩增 任 何 目 的 DNA。 可 用 于 基 因 分 离 克 隆 ， 序 列分 析 ， 基 因 表 达 调 控 ， 基 因 多 态 性 研 究 等 许多 方 面 。 PCR技 术 的 基 本 原 理 PCR反 应 成 分 ： 1.模 板 DNA； 2.引 物 ； 3.四 种 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 ； 4.DNA聚 合 酶 ； 5.反 应 缓 冲 液 、 Mg2+等 。 PCR反 应 基 本 步 骤 ： 1.变 性 ： 高 温 使 双 链 DNA解 离 形 成 单 链 （ 94 ， 30s） 。 2.退 火 ： 低 温 下 ， 引 物 与 模 板 DNA互 补 区 结 合 （ 55 ，30s） 。 3.延 伸 ： 中 温 延 伸 。 DNA聚 合 酶 催 化 以 引 物 为 起 始 点 的DNA链 延 伸 反 应 （ 70 72 ， 30 60s） 5GGATCTAGCGTATGCTTGAAA33CCTAGATCGCATACGAACTTT5 模 板 DNA3 GAACTTT 5引 物 15GGATCTA 3引 物 2图 1 PCR引 物 与 模 板 结 合 示 意 图 1.变 性 (denaturation)： 通 过 加 热 使 模 板 DNA的 双 链 之 间 的 氢 键 断 裂 ， 双 链 分 开 而 成 单 链 的过 程 。2.退 火 (annealling)： 当 温 度 降 低 时 ， 引 物与 模 板 DNA中 互 补 区 域 结 合 成 杂 交 分 子 。3.延 伸 (extension)： 在 DNA聚 合 酶 、 dNTPs、 Mg2+存 在 下 ， DNA聚 合 酶 催 化 引 物 按 5 3 方向 延 伸 ， 合 成 出 与 模 板 DNA链 互 补 的 DNA子 链 。 以 上 述 三 个 步 骤 为 一 个 循 环 ， 每 一 循 环 的产 物 均 可 作 为 下 一 个 循 环 的 模 板 ， 经 过 n次 循环 后 ， 目 的 DNA以 2n的 形 式 增 加 。 模 板 DNA55 退 火70 延 伸25 30 次 循 环 目 的 片 段扩 增 2 n倍 94 变 性PCR原 理 示 意 图 PCR反 应 产 物 积 累 规 律 示 意 图平台期产物量 时 间 6、 DNA的 化 学 合 成 寡 核 苷 酸 的 化 学 合 成 起 步 于 20世 纪 四 十 年 代 末 1955年 ， 剑 桥 大 学 的 Todd实 验 室 成 功 合 成 了 具 有 磷 酸 二 酯键 结 构 的 TpT,并 获 得 1957年 诺 贝 尔 奖 1965年 ， Khorana等 利 用 化 学 方 法 大 量 合 成 脱 氧 核 苷 的 单 一聚 合 物 或 二 种 、 三 种 脱 氧 核 苷 的 重 复 序 列 ， 人 工 合 成 的 六 十四 种 核 糖 三 糖 苷 ， 研 究 蛋 白 质 的 生 物 合 成 过 程 ， 从 而 确 定 了氨 基 酸 的 三 联 密 码 子 ， 因 此 而 获 得 1968年 诺 贝 尔 奖 六 十 至 七 十 年 代 ， 寡 核 苷 酸 的 化 学 合 成 方 法 不 断 完 善 ， 逐 渐形 成 了 今 天 被 广 泛 应 用 的 固 相 亚 磷 酸 三 酯 法 并 实 现 了 合 成 的自 动 化 固 相 合 成 寡 核 苷 酸 Routine process Microprocessor-controlled instrument Synthesis on a solid support First base(3) attached to solid support Synthesis direction is 35 DNA的 合 成 有 磷 酸 三 酯 法 、 亚 磷 酰 胺 法 、 氢 磷 酸法 等 ， 现 在 常 用 的 是 固 相 亚 磷 酰 胺 法 合 成 时 所 用 单 体 不 是 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 ， 而 是 核 苷酸 的 亚 磷 酰 胺 衍 生 物 二 甲 氧 基 三 苯 甲 基 （ DMT） 经 过 化 学 修 饰 的 核 苷 酸 3 位 P上 二 异 丙 胺 基 ， 缩 合 所 用 的 功 能 基 3 位 P上 腈 乙 基 ， 保 护 基 ， 合 成 完 毕 后 脱 去 。 5 -DMT， 保 护 基 ， 缩 合 前 脱 去 。 A和 C的 杂 环 氨 基 上 的 苯 甲 酸 保 护 基 ， 合 成 完 毕后 脱 去 。 G上 嘌 呤 环 氨 基 上 的 异 丙 酰 保 护 基 ， 合 成 完 毕后 脱 去 。 固 相 支 持 物 最 常 用 的 固 相 载 体 为 可 控 微 孔 玻 璃 珠 （ CPG，controlled pore glass） ， CPG的 孔 径 根 据 所 合成 的 寡 核 苷 酸 的 长 度 而 定 ， 一 般 合 成 链 长 小 于60nt时 ， 选 择 孔 径 500埃 ， 链 长 大 于 60nt时 ，使 用 1000埃 CPG， 使 用 CPG的 缩 合 效 率 高 达98%-99.9%， 可 以 满 足 合 成 长 达 175nt的 寡 核苷 酸 的 条 件 。 CPG通 过 连 接 化 合 物 与 初 始 核 苷酸 的 羟 基 共 价 结 合 ， 核 苷 酸 的 5 羟 基 用 二 甲氧 基 三 苯 甲 基 （ DMT） 保 护 。 合 成 过 程 中 的 第一 个 寡 核 苷 酸 合 成 的 具 体 步 骤 去 封 闭 ,用 三 氯 乙 酸 去 除 CPG所 连 核 苷 上 的 DMT,以 暴 露 5 羟 基 ，供 下 一 步 缩 合 。 活 化 ,在 缩 合 之 前 ， 单 体 与 四 唑 混 合 并 进 入 合 成 柱 ， 此 时 四 唑 提供 一 个 质 子 给 3 磷 酸 上 二 异 丙 胺 基 的 N原 子 ， 质 子 化 的 二 异 丙胺 是 一 个 良 好 的 游 离 基 团 ， 与 四 唑 形 成 亚 磷 酰 胺 四 唑 这 种 活 性 中间 体 。 连 接 ， 亚 磷 酰 胺 四 唑 与 CPG所 连 的 核 苷 酸 碰 撞 时 ， 与 其 5 羟 基发 生 亲 核 反 应 ， 发 生 缩 合 并 脱 掉 四 唑 ， 合 成 的 寡 核 苷 酸 链 延 长 一个 。 盖 帽 ,为 了 防 止 未 反 应 的 与 CPG相 连 的 5 羟 基 在 随 后 的 循 环 中 被延 长 ， 需 要 在 连 接 反 应 充 分 进 行 之 后 使 之 封 闭 ， 常 用 乙 酰 化 来 封闭 此 羟 基 。 临 用 前 混 合 乙 酸 酐 和 N-甲 基 咪 唑 等 形 成 一 活 性 很 强 的乙 酰 化 试 剂 ， 与 少 量 为 参 与 连 接 反 应 的 5 羟 基 缩 合 成 酯 键 。 氧 化 ， 连 接 反 应 后 新 加 上 的 核 苷 酸 通 过 亚 磷 酯 键 （ 磷 为 三 价 ） 与CPG上 相 连 的 寡 核 苷 酸 链 连 接 ， 此 亚 磷 酯 键 不 稳 定 ， 易 被 酸 、 碱 水 解 ， 因 此 需 将 此 处 三 价 磷 氧 化 为 五 价 的 磷 。 常 用 的 氧 化 剂 为 碘的 四 氢 呋 喃 溶 液 。 Detritylation Activation and Coupling Capping Oxidation 合 成 后 处 理 切 割 ： 将 合 成 好 的 寡 核 苷 酸 链 从 支 持 物 上 化 学 切 割 下来 。 常 用 新 鲜 的 浓 氨 水 来 裂 解 CPG上 连 接 化 合 物 与 初始 核 苷 间 的 酯 键 。 断 裂 下 来 的 寡 核 苷 酸 带 有 自 由 的 3羟 基 。 脱 保 护 基 ： 须 在 此 步 前 选 好 后 续 的 纯 化 方 法 。 一 般 用新 鲜 的 浓 氨 水 处 理 较 长 时 间 以 脱 掉 腈 乙 基 、 苯 甲 酰 基 、异 丙 基 ， 用 三 氟 乙 酸 脱 5 -DMT. 纯 化 ： 根 据 所 合 成 寡 核 苷 酸 的 组 成 和 应 用 来 选 定 纯 化的 方 法 。 常 用 的 纯 化 方 法 有 ： C18柱 、 OPC柱 、 PAGE和 HPLC。 定 量 。 根 据 寡 核 苷 酸 在 260nm处 的 紫 外 吸 收 来 定 量 。