血红蛋白的提取和分离shk

简 述 蛋 白 质 提 取 和 分 离 的 基 本 原 理 ， 并 了解 凝 胶 色 谱 法 、 电 泳 法 等 分 离 生 物 大 分 子的 基 本 原 理 。 凝 胶 色 谱法 电 泳 法 缓 冲 溶 液 它 们 在 血 红蛋 白 的 提 取 中 分 别 起 到 什 么 作 用 。 凝 胶 色 谱 法 分 离 蛋 白 质 的 原理 电 泳 法 分 离 样 品 的 原 理 缓 冲 溶 液的 组 成 和 作 用 机 理 凝 胶 色谱 法 的 原 理 和 方 法 样 品的 预 处 理 色 谱 柱 填 料 的 处 理 和 色 谱 柱的 装 填 。 2003年 4月 14日 宣 布 人 类 基 因 组 序 列 图 完 成这 标 志 着 进 入 了 后 基 因 组 和 蛋 白 质 组 时 代 。人 类 基 因 组 ： 指 DNA分 子 所 携 带 的 全 部遗 传 信 息 。蛋 白 质 组 ： 生 物 个 体 表 达 的 蛋 白 质 分 子 的总 和 。 主 要 是 对 蛋 白 质 功 能 的 研 究 。 思 考 1 分 离 生 物 大 分 子 的 基 本 思 路 是 什 么 ？选 用 一 定 的 物 理 或 化 学 的 方 法 分 离 具 有不 同 物 理 或 化 学 性 质 的 生 物 大 分 子 。思 考 2 蛋 白 质 的 分 离 和 提 取 的 原 理 是 什 么 ？根 据 蛋 白 质 各 种 特 性 的 差 异 ， 如 分 子 的 形状 和 大 小 、 所 带 电 荷 的 性 质 和 多 少 、 溶 解度 和 吸 附 的 性 质 和 对 其 他 分 子 的 亲 和 力 等等 ， 可 以 用 来 分 离 不 同 蛋 白 质 。 思 考 3 人 们 用 鸡 的 红 细 胞 提 取 DNA， 用 人 的 红 细 胞 提 取 血 红 蛋 白 的 原 因 是 什 么 ？鸡 的 红 细 胞 具 有 细 胞 核 ， 含 有 DNA， 便于 进 行 DNA的 提 取 ， 人 的 红 细 胞 无 细 胞核 ， 结 构 简 单 ， 血 红 蛋 白 含 量 丰 富 便 于提 取 血 红 蛋 白 。 提 取分 离方 法 凝 胶 色 谱 法 凝 胶 电 泳 法 一 、 基 础 知 识 凝 胶 色 谱 法 （ 分 配 色 谱 法 ） ： 1、 凝 胶 ：一 些 微 小 多 孔 的 球 体 （ 内 含 许 多 贯 穿 的通 道 ， 由 多 糖 类 化 合 物 构 成 如 葡 聚 糖 、琼 脂 糖 ， 具 多 孔 的 凝 胶 就 叫 分 子 筛 ） 2、 概 念 ： 根 据 被 分 离 的 蛋 白 质 相 对 分 子质 量 的 大 小 ， 利 用 具 有 网 状 结 构 的 凝 胶 的分 子 筛 作 用 ， 来 进 行 分 离 。 3、 原 理 ： 当 不 同 的 蛋 白 质 通 过 凝 胶 时 ，（ ） 的 蛋 白 质 容 易 进 入凝 胶 内 部 的 通 道 ， 路 程 （ ） ， 移 动 速度 （ ） ， 而（ ） 的 蛋 白 质 无 法进 入 凝 胶 内 部 的 通 道 ， 只 能 在 （ ）移 动 ， 路 程 （ ） ， 移 动 速 度（ ） ， 相 对 分 子 质 量 不 同 的 蛋 白 质 因此 得 以 分 离 。4、 具 体 过 程相 对 分 子 质 量 较 小 较 长较 慢 相 对 分 子 质 量 较 大凝 胶 外 部 较 短较 快 1、 概 念 ： 在 一 定 的 范 围 内 ， 能 对 抗 外 来 少量 强 酸 、 强 碱 或 稍 加 稀 释 不 引 起 溶 液 PH发生 明 显 变 化 的 作 用 叫 做 缓 冲 作 用 ， 具 有 缓冲 作 用 的 溶 液 叫 做 缓 冲 溶 液 。 缓 冲 溶 液 ： 2、 作 用 ： 能 够 抵 制 （ ） 对 溶 液 的（ ） 的 影 响 ， 维 持 PH基 本 不 变 。外 界 的 酸 或 碱PH 值 3、 缓 冲 溶 液 的 配 制通 常 由 （ ） 种 缓 冲 剂 溶 解 于 水 中 配 制而 成 。 调 节 缓 冲 剂 的 （ ） 就 可 以制 得 （ ） 使 用 的 缓 冲 液 。1 2 使 用 比 例在 不 同 PH范 围 内 思 考 ： 说 出 人 体 血 液 中 缓 冲 对 。 NaH 2PO4 / Na2H PO4H 2CO3 / NaH CO3 电 泳 ：1、 概 念 ： 指 带 电 粒 子 在 电 场 作 用 下 发 生 迁 移 的 过 程 。思 考 ： 在 整 个 实 验 过 程 中 使 用 的 缓 冲 液 是什 么 ？ 它 的 目 的 是 什 么 ？使 用 的 是 磷 酸 缓 冲 液 ， 目 的 是 利 用 缓 冲液 模 拟 细 胞 内 的 PH环 境 ， 保 证 血 红 蛋 白的 正 常 结 构 和 功 能 ， 便 于 观 察 （ 红 色 ）和 材 料 的 科 学 研 究 （ 活 性 ） 。 2、 原 理 ： 许 多 重 要 的 生 物 大 分 子 ， 如（ ） 等 都 具 有 ) 在 ( )下 ， 这 些 基 团 会 带 上（ ） 。 在 电 场 的 作 用 下 ， 这 些带 电 分 子 会 向 着 与 其 （ ） 移 动 。 电 泳 利 用 了 待 分 离 样 品 中 各 种 分 子（ ） 以 及 分 子 本 身（ ） 、 （ ） 的 不 同 使 带 电 分 子 产生 不 同 的 （ ） ， 从 而 实 现 样 品 中各 种 分 子 的 分 离 。多 肽 、 核 酸 可 解 离 的 基 团正 电 或 负 电 所 带 电 荷 相 反 的 电 极带 电 性 质 的 差 异大 小 形 状迁 移 速 度 一 定 的 PH （ 1） 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 ： 是 由 单 体 丙 烯 酰胺 和 交 联 剂 N,N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 在 引 发 剂(过 硫 酸 铵 和 催 化 剂 （ 四 甲 基 已 二 胺 ） 的作 用 下 聚 合 交 联 成 三 维 网 状 结 构 的 凝 胶 3.分 类 ：两 种 常 用 的 电 泳 方 法 :琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳 。蛋 白 质 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 的 迁 移 率 取 决于 它 所 带 静 电 荷 的 多 少 以 及 分 子 的 大 小 等因 素 。 为 了 消 除 静 电 荷 对 迁 移 率 的 影 响 可 以 在 凝 胶中 加 入 ( )。SDS能 使 蛋 白 质 发 生 完 全 变 性 。 由 几 条 肽 链 组 成的 蛋 白 质 复 合 体 在 SDS的 作 用 下 会 解 聚 成 单 条 肽链 ， 因 此 测 定 的 结 果 只 是 ( )。SDS能 与 各 种 蛋 白 质 形 成 蛋 白 质 SDS复 合 物 ，SDS所 带 负 电 荷 的 量 大 大 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有电 荷 量 。 因 而 掩 盖 了 不 同 种 蛋 白 质 间 的 电 荷 差别 ， 使 电 泳 迁 移 率 完 全 取 决 于 ( )。 （ 3） SDS-聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳 作 用 机 理 :单 条 肽 链 的 分 子 量分 子 的 大 小SDS注 意 ： 测 定 （ ） 通 常 用 十二 烷 基 磺 酸 钠 （ SDS） 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳蛋 白 质 相 对 分 子 质 量 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 对 分 离 大 分 子 具 有较 高 的 分 辨 率 ， 但 核 酸 比 蛋 白 质 分 子 大得 多 ， 只 能 采 用 较 大 孔 径 的 琼 脂 糖 凝 胶电 泳 。 核 酸 分 子 本 身 含 有 大 量 的 磷 酸 根 ，核 酸 带 负 电 荷 ， 在 电 场 中 向 正 极 移 动 。溴 化 乙 啶 荧 光 染 料 对 核 酸 染 色 在 紫 外 线的 照 射 下 ， 发 出 橙 红 色 荧 光 。 根 据 荧 光条 带 的 粗 细 和 分 布 的 位 置 ， 可 以 用 在 对PCR扩 增 效 果 的 鉴 定 上 。 说 明 ： 电 泳 检 测 PCR结 果 二 、 实 验 操 作 蛋 白 质 的 提 取 和 分 离 一 般 分 为 四 步 ： 1.样 品 处 理 ： 包 括 洗 涤 红 细 胞 ； 血 红蛋 白 稀 释 ； 离 心 等 操 作 收 集 到 血 红 蛋白 溶 液 。 2.粗 分 离 ： 透 析 除 去 分 子 较 小 的 杂 质 。 3.纯 化 ： 通 过 凝 胶 色 谱 法 将 分 子 量 较大 的 杂 质 蛋 白 质 除 去 。 4.纯 度 鉴 定 ： 通 过 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电泳 鉴 定 。 n F:生物技术实践视频高中生物选修1实验电影血红蛋白的提取和分离.flv 二 实 验 操 作1.样 品 处 理 和 粗 分 离血液 血 浆 水 分其 他 物 质 血 浆 蛋 白无 机 盐磷 脂葡 萄 糖 等血 细 胞 白 细 胞血 小 板红 细 胞（ 最 多 ） 血 红蛋 白（ ） 两 个 a 肽 链两 个 一 肽 链共 四 条 肽 链90 每 个 肽 链 环 绕 一 个 亚 铁 血 红 素 基 团 ，此 基 团 可 携 带 一 分 子 氧 或 一 分 子 二氧 化 碳 ， 血 红 蛋 白 因 含 有 血 红 素 而呈 红 色 。 目 的 ： 去 除 （ ） 方 法 ： （ ） 离 心 （ 速 度 越高 和 时 间 越 长 会 使 白 细 胞 和 淋 巴 细 胞 等 一同 沉 淀 达 不 到 分 离 的 效 果 ） ， 然 后 用 胶 头吸 管 吸 出 上 层 透 明 的 （ ） ， 将下 层 （ ） 的 红 细 胞 液 体 倒 入 （ ）每 个 肽 链 环 绕 （ ） ， 此基 团 可 携 带 （ ） 。血 红 蛋 白 因 含 有 （ ） 而 呈 红 色 。 本 课题 可 选 用 猪 、 牛 、 羊 或 其 他 哺 乳 动 物 的 血 液 来分 离 血 红 蛋 白 。 一 个 亚 铁 血 红 素 基 团一 分 子 氧 或 一 分 子 二 氧 化 碳血 红 素(1)红 细 胞 的 洗 涤 杂 质 蛋 白低 速 短 时 间 黄 色 血 浆暗 红 色 烧 杯 再 加 入 用 （ ） 的 （ ） 质 量 分 数 为 0.9 的 氯 化 钠 溶 液 洗 涤 ,缓慢 搅 拌 10min， （ ） 离 心 .五 倍 体 积 生 理 盐 水低 速 短 时 间如 此 重 复 洗 涤 （ ） 次 ， 直 至 上 清液 中 已 没 有 （ ） ， 表 明 洗 涤 干 净 。利 于 后 续 血 红 蛋 白 的 分 离 纯 化 ， 不 可 洗涤 次 数 过 少 。 三黄 色 洗 涤 过 程 图 解血 液100mL3g柠 檬 酸 钠 低 速 离 心2 min 红 细 胞血 浆吸 出 血 浆红细胞5倍 体 积 生 理 盐 水搅 拌 10min重 复 洗 涤 3次 ， 直 至 上 清 液 没 有 黄 色 (2)血 红 蛋 白 的 释 放 加 （ ） 到 （ ） 体 积 ， 再 加 40 体 积 的 （ ） （ 溶 解 细 胞 膜 ） ，置 于 （ ） 上 充 分 搅 拌 10min（ 加速 细 胞 破 裂 ） , 细 胞 破 裂 释 放 出 血 红 蛋 白 .(3)分 离 血 红 蛋 白 溶 液 将 搅 拌 好 的 混 合 液 转 移 到 离 心 管 内 ， 以2000r/min的 速 度 离 心 10 min ， 试 管 中 的溶 液 分 为 4层 : 原 血 液甲 苯磁 力 搅 拌 器蒸 馏 水 第 1层 （ 最 上 层 ） ： （ ） 甲 苯 层第 2层 （ 中 上 层 ） ：（ ）色 薄 层 固 体 ，（ ） 的 沉 淀 层 。第 3层 （ 中 下 层 ） ： （ ） 的 液 体 ，（ ） 的 水 溶 液 层 。 第 4层 （ 最 下 层 ） ：其 它 杂 质 （ ） 的 沉 淀 层无 色 透 明脂 溶 性 物 质 白血 红 蛋 白 红 色 透 明暗 红 色 用 过 滤 ， 除去 ， 于 分 液 漏 斗 中 静 置 片刻 后 ， 分 出 下 层 的 红 色透 明 液 体 。滤 纸脂 溶 性 沉 淀 层 分 离 血 红 蛋 白分 离 过 程红 细 胞混 合 液高 速 离 心10min 离 心 管 滤 纸过 滤脂 溶 性 沉 淀 物 烧 杯 取 ( )ml的 血 红 蛋 白 溶 液 装 入 （ ）中 ， 将 透 析 袋 放 入 盛 有 300ml的 物 质 的 量 浓度 为 20mmol/L的 （ ） 中 ，pH为 （ ） ， 透 析 12小 时 ， 目 的 是 （ ） 或 用 于 更 换 样 品 中 的 （ ） 。透 析 袋 一 般 用 硝 酸 纤 维 素 制 成 ， 又 称 玻 璃纸 。 除 去 样 品 中 分 子 量 较 小 的 杂 质 透 析 袋磷 酸 缓 冲 液7.0 缓 冲 液(4) 透 析 （ 粗 分 离 ）1 小 结 ： 样 品 处 理 和 粗 分 离n 1、 红 细 胞 的 洗 涤 ：n 目 的 是 去 除 杂 蛋 白 。 要 加 入 柠 檬 酸 钠 防 止 血 液 凝固 ； 离 心 将 血 液 分 层 ， 用 胶 头 吸 管 吸 出 黄 色 血 浆 ；用 生 理 盐 水 洗 涤 。n 2、 血 红 蛋 白 的 释 放 ：n 在 蒸 馏 水 和 甲 苯 作 用 下 ， 红 细 胞 破 裂 释 放n 3、 分 离 血 红 蛋 白 溶 液 ：n 离 心 分 层 ； 滤 纸 过 滤 去 除 脂 溶 性 沉 淀 层 ； 分 液 漏斗 分 出 红 色 透 明 液 体 。 n 4、 透 析 ：n 装 入 透 析 袋 并 置 于 磷 酸 缓 冲 液 中 （ PH为 7.0） 透 析 。去 除 小 分 子 杂 质 。 2.凝 胶 色 谱 操 作 -(1)凝 胶 色 谱 柱 的 制 作(2)凝 胶 色 谱 柱 的 装 填(3)样 品 的 加 入 和 洗 脱血 红 蛋 白 的 纯 化 注 意 事 项 ： 底 塞 中 插 入 的 玻 璃 管 的 上 部 不 得 超出 橡 皮 塞 的 凹 穴 底 面 ， 否 则 难 以 铺 实 尼 龙 网 ，还 会 导 致 液 体 残 留 ， 蛋 白 质 分 离 不 彻 底 。 材 料 ： 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 G-75； 20mmol/L磷酸 缓 冲 液装 填 :(2)凝 胶 色 谱 柱 的 装 填 ：步 骤 操 作 要 求立 刻 用 磷 酸 缓 冲 液 洗 涤 平 衡 12h洗 涤 平 衡 一 次 性 缓 慢 倒 入 ； 轻 轻 敲 打装 填 悬 浮 液 凝 胶 颗 粒 洗 脱 液 沸 水 浴 凝 胶 颗 粒 蒸 馏 水 充 分 溶 胀根 据 色 谱 柱 体 积 计 算 凝 胶 用 量色 谱 柱 垂 直 固 定 在 支 架 上配 制 悬 浮 液计 算 称 量 凝 胶固 定 色 谱 柱 (3)样 品 的 加 入 和 洗 脱 3.SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ 选 做 ）判 断 （ ） 的 蛋 白 质 是 否 达到 要 求 ， 需 要 进 行 蛋 白 质 的 鉴 定 。纯 化 知 识 总 结血红蛋白的提取和分离 蛋 白 质 分 子 的 差 异 性凝 胶 色 谱 法 原 理 分 离 过 程凝 胶 电 泳 法缓 冲 溶 液 组 成 作 用蛋 白 质 的提 取 分 离 样 品 处 理 粗 分 离纯 化纯 度 鉴 定 影 响 蛋 白 质 分 子 运 动 的 因 素 决 定运 动 方 向 形 成库 仑 力 形 成阻 力 决 定运 动 速 率电 荷 性质电 荷 量分 子 形状分 子 大小 观 察 你 处 理 的 血 液 样 品 离 心 后 是 否 分 层（ 见 教 科 书 图 5-18） ， 如 果 分 层 不 明 显 ，可 能 是 洗 涤 次 数 少 、 未 能 除 去 血 浆 蛋 白 的原 因 。 此 外 ， 离 心 速 度 过 高 和 时 间 过 长 ，会 使 白 细 胞 和 淋 巴 细 胞 一 同 沉 淀 ， 也 得 不到 纯 净 的 红 细 胞 ， 影 响 后 续 血 红 蛋 白 的 提取 纯 度 。三 实 验 结 果 分 析 与 评 价1、 是 否 完 成 对 血 液 样 品 的 处 理 由 于 凝 胶 是 一 种 半 透 明 的 介 质 ， 因 此 可 以 在 凝胶 柱 旁 放 一 支 与 凝 胶 柱 垂 直 的 日 光 灯 ， 检 查 凝胶 是 否 装 填 得 均 匀 。 此 外 ， 还 可 以 加 入 大 分 子的 有 色 物 质 ， 例 如 蓝 色 葡 聚 糖 2000或 红 色 葡聚 糖 ， 观 察 色 带 移 动 的 情 况 。 如 果 色 带 均 匀 、狭 窄 、 平 整 ， 说 明 凝 胶 色 谱 柱 的 性 能 良 好 。 如果 色 谱 柱 出 现 纹 路 或 是 气 泡 ， 轻 轻 敲 打 柱 体 以消 除 气 泡 ， 消 除 不 了 时 要 重 新 装 柱 。 2、 凝 胶 色 谱 柱 的 装 填 是 否 成 功 3、 血 红 蛋 白 的 分 离 是 否 成 功如 果 凝 胶 色 谱 柱 装 填 得 很 成 功 、 分 离 操 作 也正 确 的 话 ， 能 清 楚 地 看 到 血 红 蛋 白 的 红 色 区带 均 匀 、 狭 窄 、 平 整 ， 随 着 洗 脱 液 缓 慢 流 出； 如 果 红 色 区 带 歪 曲 、 散 乱 、 变 宽 ， 说 明 分离 的 效 果 不 好 ， 这 与 凝 胶 色 谱 柱 的 装 填 有 关。 1 提 取 DNA的 第 一 步 是 材 料 的 选 取 ， 其 目 的是 一 定 要 选 取 DNA含 量 较 高 的 生 物 材 料 ， 否 则会 由 于 实 验 过 程 中 或 多 或 少 的 损 失 而 造 成 检测 的 困 难 ； 第 二 步 是 DNA的 释 放 和 溶 解 ， 这 一步 是 实 验 成 功 与 否 的 关 键 ， 要 尽 可 能 使 细 胞内 的 DNA全 部 溶 解 ； 第 三 步 是 DNA的 纯 化 ， 即根 据 DNA的 溶 解 特 性 、 对 酶 及 高 温 的 耐 受 性 的不 同 等 特 性 ， 最 大 限 度 地 将 DNA与 杂 质 分 开 ；最 后 一 步 是 对 DNA进 行 鉴 定 ， 这 是 对 整 个 实 验的 结 果 的 检 测 。 (P57) 2 提 取 蛋 白 质 比 提 取 DNA的 难 度 大 。 这 是 因为 ， 与 DNA相 比 ， 蛋 白 质 对 温 度 、 盐 浓 度 、pH等 条 件 要 敏 感 得 多 ， 很 容 易 失 活 ； 并 且 蛋白 质 的 空 间 结 构 多 种 多 样 ， 理 化 性 质 各 不 相同 ， 使 得 蛋 白 质 的 提 取 没 有 一 种 统 一 的 方 法 ，只 能 根 据 特 定 蛋 白 质 的 特 性 摸 索 提 取 的 条 件 ，设 计 特 定 的 方 法 。 课 后 练 习 (P63)1.绘 图 可 参 考 教 科 书 中 图 5-9。 PCR反 应 中 的目 的 片 段 一 般 以 2n的 方 式 积 累 ， 其 中 n为 反 应循 环 次 数 。 一 个 DNA片 段 在 30次 循 环 后 反 应物 中 大 约 有 10亿 个 这 样 的 片 段 （ 2n=230=1 073 741 824)。2.PCR引 物 是 根 据 需 要 扩 增 的 目 标 DNA的 碱 基序 列 来 设 计 的 。 课 后 练 习 (P70)1 凝 胶 色 谱 法 也 称 为 分 配 色 谱 法 ， 它 是 根 据 分 子量 的 大 小 分 离 蛋 白 质 的 方 法 之 一 。 所 用 的 凝 胶 实际 上 是 一 些 微 小 的 多 孔 球 体 ， 这 些 小 球 体 大 多 数是 由 多 糖 类 化 合 物 构 成 ， 小 球 体 内 部 有 许 多 贯 穿的 通 道 ， 当 一 个 含 有 各 种 分 子 的 样 品 溶 液 缓 慢 流经 时 ， 各 分 子 在 色 谱 柱 内 进 行 两 种 不 同 的 运 动 ，即 垂 直 向 下 的 运 动 和 无 规 则 的 扩 散 运 动 。 相 对 分子 质 量 较 大 的 蛋 白 质 分 子 不 能 进 入 凝 胶 颗 粒 内 部， 只 能 分 布 在 颗 粒 之 间 ， 通 过 的 路 程 较 短 ， 移 动速 度 较 快 ； 相 对 分 子 质 量 较 小 的 蛋 白 质 分 子 比 较 容 易 进 入 凝 胶 内 的 通 道 ， 通 过 的 路 程 较 长， 移 动 速 度 较 慢 。 因 此 ， 样 品 中 相 对 分 子质 量 较 大 的 蛋 白 质 先 流 出 ， 相 对 分 子 质 量中 等 的 分 子 后 流 出 ， 相 对 分 子 质 量 最 小 的分 子 最 后 流 出 ， 这 种 现 象 又 叫 分 子 筛 现 象。 此 外 ， 凝 胶 本 身 具 有 三 维 网 状 结 构 ， 相对 分 子 质 量 大 的 分 子 通 过 这 种 网 状 结 构 上的 空 隙 时 阻 力 大 ， 而 相 对 分 子 质 量 小 的 分子 通 过 时 阻 力 小 ， 因 此 不 同 分 子 量 的 蛋 白质 分 子 可 以 获 得 分 离 。 2 在 一 定 范 围 内 ， 能 对 抗 外 来 少 量 强 酸 、 强碱 或 稍 加 稀 释 不 引 起 溶 液 pH发 生 明 显 变 化 的作 用 叫 做 缓 冲 作 用 ， 具 有 缓 冲 作 用 的 溶 液 叫做 缓 冲 溶 液 。 缓 冲 溶 液 通 常 是 由 一 或 两 种 化合 物 （ 缓 冲 剂 ） 溶 解 于 水 中 制 得 ， 调 节 缓 冲剂 的 配 比 就 可 制 得 不 同 pH范 围 的 缓 冲 液 。缓 冲 溶 液 的 作 用 是 维 持 反 应 体 系 的 pH不 变 。在 生 物 体 内 进 行 的 各 种 生 物 化 学 过 程 都 是 在精 确 的 pH下 进 行 的 ， 受 到 氢 离 子 浓 度 的 严 格调 控 。 为 了 在 实 验 室 条 件 下 准 确 地 模 拟 生 物体 内 的 天 然 环 境 ， 就 必 须 保 持 体 外 生 物 化 学反 应 过 程 有 与 体 内 过 程 完 全 相 同 的 pH。 3 电 泳 是 指 带 电 粒 子 在 电 场 的 作 用 下 发 生迁 移 的 过 程 。 许 多 重 要 的 生 物 分 子 ， 如 氨 基酸 、 多 肽 、 蛋 白 质 、 核 苷 酸 、 核 酸 等 都 具 有可 解 离 基 团 ， 它 们 在 某 个 特 定 的 pH下 会 带 上正 电 或 负 电 ； 在 电 场 的 作 用 下 ， 这 些 带 电 分子 会 向 着 与 其 所 带 电 荷 相 反 的 电 极 方 向 移 动。 电 泳 技 术 就 是 在 电 场 的 作 用 下 ， 利 用 待 分离 样 品 中 各 种 分 子 带 电 性 质 以 及 分 子 本 身 大小 、 形 状 等 性 质 的 差 异 ， 使 带 电 分 子 产 生 不同 的 迁 移 速 度 ， 从 而 达 到 对 样 品 进 行 分 离 、鉴 定 或 提 纯 的 目 的 。 4 血 红 蛋 白 提 取 和 分 离 的 程 序 可 分 为 四 大步 ， 包 括 ： 样 品 处 理 、 粗 分 离 、 纯 化 和 纯 度鉴 定 。 首 先 通 过 洗 涤 红 细 胞 、 血 红 蛋 白 的 释放 、 离 心 等 操 作 收 集 到 血 红 蛋 白 溶 液 ， 即 样品 的 处 理 ； 再 经 过 透 析 去 除 分 子 量 较 小 的 杂质 ， 即 样 品 的 粗 分 离 ； 然 后 通 过 凝 胶 色 谱 法将 相 对 分 子 质 量 大 的 杂 质 蛋 白 除 去 ， 即 样 品的 纯 化 ； 最 后 经 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 进 行 纯度 鉴 定 。 5 血 红 蛋 白 是 有 色 蛋 白 ， 因 此 在 凝 胶 色 谱分 离 时 可 以 通 过 观 察 颜 色 来 判 断 什 么 时 候应 该 收 集 洗 脱 液 。 这 使 血 红 蛋 白 的 分 离 过程 非 常 直 观 ， 大 大 简 化 了 实 验 操 作 。 讨 论 ： 如 何 测 定 蛋 白 质 的 分 子 量 ？使 用 SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 测 定 蛋 白质 的 分 子 量 时 ， 可 选 用 一 组 已 知 分 子 量 的标 准 蛋 白 同 时 进 行 电 泳 ， 根 据 已 知 分 子 量的 标 准 蛋 白 的 电 泳 区 带 位 置 ， 用 电 泳 迁 移率 和 分 子 量 的 对 数 作 标 准 曲 线 ， 可 以 测 定未 知 蛋 白 质 的 分 子 量 。 市 场 上 有 高 分 子 量 、次 高 分 子 量 及 低 分 子 量 的 标 准 蛋 白 试 剂 出售 练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质 2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较 3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长 D 防止血液凝固 5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-脂类物质-血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀 7.相 对 分 子 质 量 不 同 的 蛋 白 质 在 凝 胶 中的 进 行 过 程 可 表 示 为 图 中 哪 一 个 B 8.凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为16 cm，有关说法中，正确的是 (多选)A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果B凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大 n 9.在 装 填 凝 胶 柱 时 ， 不 能 有 气 泡 存 在 的 原 因是n A、 气 泡 会 搅 乱 洗 脱 液 中 蛋 白 质 的 洗 脱 次 序 ， 降 低 分 离 效 果n B、 气 泡 阻 碍 蛋 白 质 的 运 动n C、 气 泡 与 蛋 白 质 发 生 化 学 反 应n D、 气 泡 在 装 填 凝 胶 的 时 候 ， 使 凝 胶 不 紧 密A n 10.样 品 的 加 入 和 洗 脱 的 操 作 不 正 确 的 是 n A 加 样 前 ， 打 开 色 谱 柱 下 端 的 流 出 口 ， 使 柱 内凝 胶 面 上 的 缓 冲 液 缓 慢 下 降 到 凝 胶 面 的 下 面n B 加 样 后 ， 打 开 下 端 出 口 ， 使 样 品 渗 入 凝 胶 床 内n C 等 样 品 完 全 进 入 凝 胶 层 后 ， 关 闭 下 端 出 口n D 用 吸 管 小 心 的 将 1ml透 析 后 的 样 品 加 到 色 谱 柱的 顶 端 ， 不 要 破 坏 凝 胶 面A n 11.下 列 是 有 关 血 红 蛋 白 提 取 和 分 离 的 相 关操 作 ， 其 中 正 确 的 是 （ ）n A 可 采 集 猪 血 作 为 实 验 材 料 B 用 蒸 馏 水 重 复 洗 涤 红 细 胞n C 血 红 蛋 白 释 放 后 应 低 速 短 时 间 离 心 D 洗 脱 液 接 近 色 谱 柱 底 端 时 开 始 收 集 流 出液 A