微生物的进化系统发育和分类鉴定

第 十 章 微 生 物 的 进 化 、 系 统 发育 和 分 类 鉴 定 进 化 (evolution)： 生 物 与 其 生 存 环 境 相 互 作 用 过 程 中 ，其 遗 传 系 统 随 时 间 发 生 一 系 列 不 可 逆 的 改 变 ， 在 大 多数 情 况 下 ， 导 致 生 物 表 型 改 变 和 对 生 存 环 境 的 相 对 适 应 。今 天 仍 生 存 在 地 球 上 的 生 物 种 类 ，彼 此 之 间 都 有 或 远 或 近 的 历 史 渊 源 。最 原 始 的 生 命漫 长 的 进 化 历 程千 姿 百 态 的 生 物 种 类 系 统 发 育 (phylogeny)： 各 类 生 物 进 化 的 历 史 。 分 类 (classification)： 根 据 生 物 特 性 的 相 似 程 度 将 其 分 群 归 类 。地 球 上 的 物 种 估 计 大 约 有 150万 ， 其 中 微 生 物 超 过 10万 种 ，而 且 其 数 目 还 在 不 断 增 加 。 生 物 分 类 的 二 种 基 本 原 则 ：a） 根 据 表 型 (phenetic)特 征 的 相 似 程 度 分 群 归 类 ， 这 种 表 型 分 类 重 在 应 用 ， 不 涉 及 生 物 进 化 或 不 以 反 映 生 物 亲 缘 关 系 为 目 标 ；b） 按 照 生 物 系 统 发 育 相 关 性 水 平 来 分 群 归 类 ， 其 目 标 是 探 寻 各 种 生 物 之 间 的 进 化 关 系 ， 建 立 反 映 生 物 系 统 发 育 的 分 类 系 统 。从 进 化 论 诞 生 以 来 ， 已 经 成 生 物 学 家 普 遍 接 受 的 分 类 原 则生 物 系 统 学 (systematics) 第 一 节 进 化 的 测 量 指 征70年 代 以 前 ， 生 物 类 群 间 的 亲 缘 关 系 判 断 的 主 要 根 据 ：形 态 结 构 、 生 理 生 化 、 行 为 习 性 ， 等 等少 量 的 化 石 资 料表 型 特 征 ：一 、 进 化 指 征 的 选 择 原 核 生 物 的 特 点 ：形 体 微 小 、 结 构 简 单 、缺 少 有 性 繁 殖 过 程 ，化 石 资 料 凤 毛 麟 角 b） 形 态 特 征 在 不 同 类 群 中 进 化 速 度 差 异 很 大 ， 仅 根 据 形 态 推 断 进 化 关 系 往 往 不 准 确 ；根 据 形 态 学 特 征 推 断 微 生 物 之 间 的 亲 缘 关 系 的 缺 点 ：a） 由 于 微 生 物 可 利 用 的 形 态 特 征 少 ， 很 难 把 所 有 生 物 放 在 同 一 水 平 上 进 行 比 较 ；虽 然 根 据 少 量 表 型 特 征 来 推 测 各 类 微 生 物 的 亲 缘关 系 而 提 出 的 许 多 分 类 系 统 ， 都 随 着 时 间 的 推 移而 不 断 地 被 否 定 了 。 六 、 七 十 年 代 ：分 析 和 比 较 生 物 大 分 子 的 结 构 特 征 ， 特 别 是蛋 白 质 、 RNA和 DNA这 些 反 映 生 物 基 因 组 特 征的 分 子 序 列 ， 作 为 判 断 各 类 微 生 物 乃 至 所 有生 物 进 化 关 系 的 主 要 指 征 。 分 子 计 时 器 (molecular chronometers)进 化 钟 (evolutionary clock) 蛋 白 质 、 RNA和 DNA序 列 进 化 变 化 的 显 著 特 点 是 进 化速 率 相 对 恒 定 ， 也 就 是 说 ， 分 子 序 列 进 化 的 改 变 量(氨 基 酸 或 核 苷 酸 替 换 数 或 替 换 百 分 率 )与分 子 进 化 的 时 间 成 正 比 。1. 生 物 大 分 子 作 为 进 化 标 尺 依 据a） 在 两 群 生 物 中 ， 如 果 同 一 种 分 子 的 序 列 差 异 很 大 时 ，-进 化 距 离 远 ， 进 化 过 程 中 很 早 就 分 支 了 。b） 如 果 两 群 生 物 同 一 来 源 的 大 分 子 的 序 列 基 本 相 同 ，-处 在 同 一 进 化 水 平 上 。 2. 作 为 进 化 标 尺 的 生 物 大 分 子 的 选 择 原 则1） 在 所 需 研 究 的 种 群 范 围 内 ， 它 必 须 是 普 遍 存 在 的 。2） 在 所 有 物 种 中 该 分 子 的 功 能 是 相 同 的 。3） 为 了 鉴 定 大 分 子 序 列 的 同 源 位 置 或 同 源 区 ， 要 求 所 选 择 的 分 子 序 列 必 须 能 严 格 线 性 排 列 ， 以 便 进 行 进 一 步 的 分 析 比 较 。4） 分 子 上 序 列 的 改 变 （ 突 变 ） 频 率 应 与 进 化 的 测 量 尺 度 相 适 应 。大 量 的 资 料 表 明 ： 功 能 重 要 的 大 分 子 、 或 者 大 分 子 中 功 能 重 要的 区 域 ， 比 功 能 不 重 要 的 分 子 或 分 子 区 域 进 化 变 化 速 度 低 。 二 、 RNA作 为 进 化 的 指 征16S rRNA被 普 遍 公 认 为 是 一 把 好 的 谱 系 分 析 的 “ 分 子 尺 ” ：1） rRNA具 有 重 要 且 恒 定 的 生 理 功 能 ；2） 在 16SrRNA分 子 中 ， 既 含 有 高 度 保 守 的 序 列 区 域 ， 又 有 中 度 保 守 和 高 度 变 化 的 序 列 区 域 ， 因 而 它 适 用 于 进 化 距 离 不 同 的 各 类 生 物 亲 缘 关 系 的 研 究 ；3） 16SrRNA分 子 量 大 小 适 中 ， 便 于 序 列 分 析 ；4） rRNA在 细 胞 中 含 量 大 (约 占 细 胞 中 RNA的 90%)， 也 易 于 提 取 ；5） 16SrRNA普 遍 存 在 于 真 核 生 物 和 原 核 生 物 中 (真 核 生 物 中 其 同 源 分 子 是 18SrRNA)。 因 此 它 可 以 作 为 测 量 各 类 生 物 进 化 的 工 具 。 利 用 16SrRNA建 立 分 子 进 化 树 的 美 国 科 学 家 Carl Woese 三 、 rRNA和 系 统 发 育 树1. rRNA的 顺 序 和 进 化培 养 微 生 物 提 取 并 纯 化 rRNArRNA序 列 测 定 分 析 比 较微 生 物 之 间 的 系 统 发 育 关 系 2. 特 征 序 列 或 序 列 印 记 （ signature sequence）通 过 对 r RNA全 序 列 资 料 的 分 析 比 较 （ 特 别 是 采 用计 算 机 ） 发 现 的 在 不 同 种 群 水 平 上 的 特 异 特 征 性 寡核 苷 酸 序 列 ， 或 在 某 些 特 定 的 序 列 位 点 上 出 现 的 单碱 基 印 记 。特 征 序 列 有 助 于 迅 速 确 定 某 种 微 生 物 的分 类 归 属 ， 或 建 立 新 的 分 类 单 位 。 3. 系 统 发 育 树 (phylogenetic tree)通 过 比 较 生 物 大 分 子 序 列 差 异 的 数 值 构 建 的 系 统 树 称 为分 子 系 统 树 ， 其 特 点 是 用 一 种 树 状 分 枝 的 图 型 来 概 括 各种 (类 )生 物 之 间 的 亲 缘 关 系 。分 枝 的 末 端 和 分 枝 的 连 结 点 称 为 结 (node)，代 表 生 物 类 群 ， 分 枝 末 端 的 结 代 表 仍 生 存 的 种 类 。 系统 树 可 能 有 时 间 比 例 ， 或 者 用 两 个 结 之 间 的 分 枝 长 度变 化 来 表 示 分 子 序 列 的 差 异 数 值 。 16 S r RNA系 统 发 育 树 1） 生 命 的 第 三 种 形 式 古 生 菌动 物 界 和 植 物 界 原 核 生 物 和 真 核 生 物 （ 20世 纪 60年 代 ）古 细 菌 (archaebacteria)真 细 菌 (Eubacteria)真 核 生 物 (Eukaryotes)（ 1977， Carl Woese）Bacteria(细 菌 )Archaea(古 生 菌 )Eukarya(真 核 生 物 )（ 1990， Carl Woese）原 核 生 物界 （ K ingdom）域 （ domain） 3） 三 （ 界 )域 生 物 的 主 要 特 征三 界 理 论 虽 然 是 根 据 16SrRNA序 列 的 比 较 提 出 的 ，但 其 他 特 征 的 比 较 研 究 结 果 也 在 一 定 程 度 上 支 持了 三 界 生 物 的 划 分 。 第 二 节 细 菌 分 类分 类 是 认 识 客 观 事 物 的 一 种 基 本 方 法 。 我 们 要 认 识 、研 究 和 利 用 各 种 微 生 物 资 源 也 必 须 对 它 们 进 行 分 类 。分 类 (classification)： 根 据 一 定 的 原 则 (表 型 特 征 相 似 性 或 系 统 发 育相 关 性 )对 微 生 物 进 行 分 群 归 类 ， 根 据 相 似 性 或 相 关 性 水 平 排 列 成系 统 ， 并 对 各 个 分 类 群 的 特 征 进 行 描 述 ， 以 便 查 考 和 对 未 被 分 类 的微 生 物 进 行 鉴 定 ；(根 据 现 有 数 据 建 立 系 统 的 过 程 )分 类 学 涉 及 三 个 相 互 依 存 又 有 区 别 的 组 成 部 分 ：鉴 定分 类 、 命 名 、 命 名 (nomenclature)： 是 根 据 命 名 法 规 ， 给 每 一 个 分 类 群 一 个 专 有的 名 称 ； (分 类 系 统 建 立 过 程 中 的 步 骤 之 一 )鉴 定 (identification或 determination)： 借 助 于 现 有 的 微 生 物 分 类系 统 ， 通 过 特 征 测 定 ， 确 定 未 知 的 、 或 新 发 现 的 、 或 未 明 确 分 类地 位 的 微 生 物 所 应 归 属 分 类 群 的 过 程 。(根 据 现 有 系 统 确 定 未 知 微 生 物 分 类 归 属 的 过 程 )主 要 以 细 菌 为 例 介 绍 微 生 物 分 类 、 命 名 和 鉴 定 的 有 关 知 识 一 、 分 类 单 元 及 其 等 级界 门 纲 目 科 属 种 常 用 的 细 菌 分 类 学 术 语 ：1） 培 养 物 (culture)： 一 定 时 间 一 定 空 间 内 微 生 物 的 细 胞 群 或 生 长 物 。 如 微 生 物 的 斜 面 培 养 物 、 摇 瓶 培 养 物 等 。2） 菌 株 (strain)： 从 自 然 界 中 分 离 得 到 的 任 何 一 种 微 生 物 的 纯 培 养 物 都 可 以 称 为 微 生 物 的 一 个 菌 株 ； 用 实 验 方 法 (如 通 过 诱 变 ) 所 获 得 的 某 一 菌 株 的 变 异 型 ， 也 可 以 称 为 一 个 新 的 菌 株 ， 以 便 与 原 来 的 菌 株 相 区 别 。菌 株 是 微 生 物 分 类 和 研 究 工 作 中 最 基 础 的 操 作 实 体（ 参 见 P321） 3） 型 (form或 type)： 常 指 亚 种 以 下 的 细 分 。 当 同 种 或 同 亚 种 不 同 菌株 之 间 的 性 状 差 异 ， 不 足 以 分 为 新 的 亚 种 时 ， 可 以 细 分 为 不 同 的 型 。例 如 抗 原 特 征 的 差 异 分 为 不 同 的 血 清 型 ； 对 噬 菌 体 裂 解 反 应 的不 同 分 为 不 同 的 噬 菌 型 等4） 种 （ species） ： 物 种 ， 生 物 分 类 中 基 本 的 分 类 单 元 和 分 类 等 级 。高 等 生 物 中 ， “ 生 殖 隔 离 ” 被 看 作 是 区 分 物 种 的 标 准微 生 物 的 种 ： 具 有 高 度 特 征 相 似 性 的 菌 株 群 ， 这 个 菌 株 群 与 其 他 类 群 的 菌 株 有 很 明 显 的 区 别 。（ 参 见 P321） 二 、 微 生 物 的 命 名双 名 法 ， 由 二 个 拉 丁 字 或 希 腊 字 或 拉 丁 化 了 的 其 它 文 字 组 成 ，一 般 用 斜 体 表 示 （ 参 见 P 323）属 名 在 前 ， 一 般 用 拉 丁 字 名 词 表 示 ， 字 首 字 母 大 写种 名 在 后 ， 常 用 拉 丁 文 形 容 词 表 示 ， 全 部 小 写若 所 分 离 的 菌 株 只 鉴 定 到 属 ， 而 未 鉴 定 到 种 ， 可 用 sp来 表 示 ，例 如 Bacillus sp 伯 杰 氏 手 册 伯 杰 氏 鉴 定 细 菌 学 手 册 (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology)美 国 宾 夕 法 尼 亚 大 学 的 细 菌 学 教 授 伯 杰 (D.Bergey)(1860-1937)1957年 第 七 版 后 ， 由 于 越 来 越 广 泛 地 吸 收 了 国 际 上 细 菌分 类 学 家 参 加 编 写 (如 1974年 第 八 版 ， 撰 稿 人 多 达 130多 位， 涉 及 15个 国 家 ； 现 行 版 本 撰 稿 人 多 达 300多 人 ， 涉 及 近20个 国 家 )， 所 以 它 的 近 代 版 本 反 映 了 出 版 年 代 细 菌 分 类 学的 最 新 成 果 ， 因 而 逐 渐 确 立 了 在 国 际 上 对 细 菌 进 行 全 面 分类 的 权 威 地 位 。 伯 杰 氏 系 统 细 菌 学 手 册 (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)伯 杰 氏 手 册 是 目 前 进 行 细 菌 分 类 、 鉴 定 的 最 重 要依 据 ， 其 特 点 是 描 述 非 常 详 细 ， 包 括 对 细 菌 各 个 属种 的 特 征 及 进 行 鉴 定 所 需 做 的 实 验 的 具 体 方 法 。（ 20世 纪 80年 代 末 期 ） 第 三 节 微 生 物 分 类 鉴 定 的 特 征 和 技 术血 清 学 试 验 、 噬 菌 体 分 型 、 生 态 特 性 、 氨 基酸 顺 序 和 蛋 白 质 分 析 、 对 细 胞 壁 等 细 胞 成 分的 分 析 比 较 、 通 过 原 核 生 物 的 转 化 、 转 导 、接 合 来 判 断 原 核 生 物 的 亲 缘 关 系 等 等 。参 见 P 330-334 核 酸 的 碱 基 组 成 和 分 子 杂 交特 点 ：与 形 态 及 生 理 生 化 特 性 的 比 较 不 同 ， 对 DNA的 碱 基组 成 的 比 较 和 进 行 核 酸 分 子 杂 交 是 直 接 比 较 不 同 微生 物 之 间 基 因 组 的 差 异 ， 因 此 结 果 更 加 可 信 。（ 参 见 P 332） 1. DNA的 碱 基 组 成 (G +Cmol%)DNA碱 基 因 组 成 是 各 种 生 物 一 个 稳 定 的 特 征 ， 即 使 个 别基 因 突 变 ， 碱 基 组 成 也 不 会 发 生 明 显 变 化 。分 类 学 上 ， 用 G +C占 全 部 碱 基 的 分 子 百 分 数 (G +Cmol%)来 表 示 各 类 生 物 的 DNA碱 基 因 组 成 特 征 。（ 参 见 P 332） 1） 每 个 生 物 种 都 有 特 定 的 GC%范 围 ， 因 此 后 者 可 以 作 为 分 类 鉴 定 的 指 标 。 细 菌 的 GC%范 围 为 25-75%， 变 化 范 围 最 大 ， 因 此 更 适 合 于 细 菌 的 分 类 鉴 定 。 2） GC%测 定 主 要 用 于 对 表 型 特 征 难 区 分 的 细 菌 作 出 鉴 定 ， 并 可 检 验 表 型 特 征 分 类 的 合 理 性 ， 从 分 子 水 平 上 判 断 物 种 的 亲 缘 关 系 。3） 使 用 原 则 ：G+C含 量 的 比 较 主 要 用 于 分 类 鉴 定 中 的 否 定每 一 种 生 物 都 有 一 定 的 碱 基 组 成 ， 亲 缘 关 系 近 的 生 物 ，它 们 应 该 具 有 相 似 的 G+C含 量 ， 若 不 同 生 物 之 间 G+C含量 差 别 大 表 明 它 们 关 系 远 。但 具 有 相 似 G +C含 量 的 生 物 并 不 一 定 表 明 它 们之 间 具 有 近 的 亲 缘 关 系 。 同 一 个 种 内 的 不 同 菌 株 G+C含 量 差 别 应 在 4 5%以 下 ；同 属 不 同 种 的 差 别 应 低 于 10 15%；G+C含 量 已 经 作 为 建 立 新 的 微 生 物 分 类 单 元 的 一 项基 本 特 征 ， 它 对 于 种 、 属 甚 至 科 的 分 类 鉴 定 有 重 要 意 义 。若 二 个 在 形 态 及 生 理 生 化 特 性 方 面 及 其 相 似 的菌 株 ， 如 果 其 G +C含 量 的 差 别 大 于 5%， 则 肯 定不 是 同 一 个 种 ， 大 于 15%则 肯 定 不 是 同 一 个 属 。 在 疑 难 菌 株 鉴 定 、 新 种 命 名 、 建 立 一 个 新 的分 类 单 位 时 ， G+C含 量 是 一 项 重 要 的 ， 必 不可 少 的 鉴 定 指 标 。其 分 类 学 意 义 主 要 是 作 为 建 立 新 分 类单 元 的 一 项 基 本 特 征 和 把 那 些 G+C含量 差 别 大 的 种 类 排 除 出 某 一 分 类 单 元 。G+C含 量 的 比 较 主 要 用 于 分 类 鉴 定 中 的 否 定 2. 核 酸 的 分 子 杂 交不 同 生 物 DNA碱 基 排 列 顺 序 的 异 同 直 接 反 映 生 物 之 间亲 缘 关 系 的 远 近 ， 碱 基 排 列 顺 序 差 异 越 小 ， 它 们 之 间的 亲 缘 关 系 就 越 近 ， 反 之 亦 然 。t 直 接 分 析 比 较 DNA的 碱 基 排 列 顺 序t 核 酸 分 子 杂 交 (hybridization)间 接 比 较 不 同 微 生 物 DNA碱 基 排 列 顺 序 的 相 似 性 （ 参 见 P 333） 核 酸 分 子 杂 交 ：a） DNA-DNA杂 交 ；（ 亲 缘 关 系 相 对 近 的 微 生 物 之 间 的 亲 缘 关 系 比 较 ）b） DNA-rRNA杂 交 ；（ 亲 缘 关 系 相 对 远 的 微 生 物 之 间 的 亲 缘 关 系 比 较 ）c） 核 酸 探 针 ；（ 利 用 特 异 性 的 探 针 ， 用 于 细 菌 等 的 快 速 鉴 定 ）（ 参 见 P 333-334） 第 四 节 微 生 物 的 快 速 鉴 定 和 自 动 化分 析1. 微 量 多 项 试 验 鉴 定 系 统 （ 1） API 20 系 统 ： 法 国 Bio-梅 里 埃 公 司 生 产 ， 有 20 种 不 同 的 生 化 反 应 ， 可 鉴 定 700 多 种 细 菌 ， 分不 同 系 列 ， 如 20A厌 氧 菌 ， 20E肠 道 菌 （ 2） Enterotube 系 统 ： 罗 氏 公 司 生 产 ， 有 15 种 生化 反 应 ， 专 门 鉴 定 肠 道 菌（ 3） Biolog 系 统 ： 美 国 安 普 公 司 生 产 ， 可 自 动 化 鉴定 ， 可 鉴 定 1140 种 细 菌 本 章 小 结进 化 、 菌 株 、 模 式 菌 株 、 培 养 物 、 种 （ 微 生物 ） 、蛋 白 质 和 核 酸 被 用 作 微 生 物 进 化 谱 系 分 析 的原 因 ；16S rRNA被 认 为 是 谱 系 分 析 的 “ 分 子 尺 ” 的原 因 ；