目的基因的克隆与基因文库的构建

生 物 工 程 专 业 核 心 课 程基 因 工 程华 东 理 工 大 学 张 惠 展 基 因 工 程523416789 基 因 工 程 的 基 本 概 念基 因 工 程 的 基 本 原 理基 因 工 程 所 需 的 基 本 条 件基 因 工 程 的 操 作 过 程目 的 基 因 的 克 隆 与 基 因 文 库 的 构 建大 肠 杆 菌 基 因 工 程酵 母 基 因 工 程哺 乳 动 物 基 因 工 程高 等 植 物 基 因 工 程 5 目 的 基 因 的 克 隆 与 基 因 文 库 的 构 建C PCR法B cDNA法A 鸟 枪 法D 化 学 合 成 法E 基 因 文 库 的 构 建 5 目 的 基 因 的 克 隆 与 基 因 文 库 的 构 建 基 因 工 程 或 DNA重 组 技 术 三 大 用 途 的 前 提 条 件 是 从 生 物 体 基 因 组中 分 离 克 隆 目 的 基 因 ， 目 的 基 因 获 得 之 后 ， 或 确 定 其 表 达 调 控 机 制 和生 物 学 功 能 ， 或 建 立 高 效 表 达 系 统 ， 构 建 具 有 经 济 价 值 的 基 因 工 程 菌（ 细 胞 ） ， 或 将 目 的 基 因 在 体 外 进 行 必 要 的 结 构 功 能 修 饰 ， 然 后 输 回细 胞 内 改 良 生 物 体 的 遗 传 性 状 ， 包 括 人 体 基 因 治 疗 。 一 般 来 说 ， 目 的 基 因 的 克 隆 战 略 分 为 两 大 类 ： 一 类 是 构 建 感 兴 趣的 生 物 个 体 的 基 因 文 库 ， 即 将 某 生 物 体 的 全 基 因 组 分 段 克 隆 ， 然 后 建立 合 适 的 筛 选 模 型 从 基 因 组 文 库 中 挑 出 含 有 目 的 基 因 的 重 组 克 隆 ； 另一 类 是 利 用 PCR扩 增 技 术 甚 至 化 学 合 成 法 体 外 直 接 合 成 目 的 基 因 ， 然 后 将 之 克 隆 表 达 。 A 鸟 枪 法5 目 的 基 因 的 克 隆 与 基 因 文 库 的 构 建鸟 枪 法 克 隆 目 的 基 因 的 基 本 战 略鸟 枪 法 操 作 的 改 进鸟 枪 法 克 隆 目 的 基 因 的 局 限 性 鸟 枪 法 克 隆 目 的 基 因 的 基 本 战 略 随 机 克 隆 供 体 细 胞 的 全 基 因 组 DNA片 段 ， 然 后 通 过 快 速 有 效 的 筛 选 程 序 从众 多 克 隆 中 分 离 出 含 有 目 的 基 因 的 目 的重 组 子 ， 进 而 获 得 目 的 基 因 。 鸟 枪 法 适用 于 原 核 细 菌 目 的 基 因 的 克 隆 分 离 鸟 枪 法 克 隆 目 的 基 因 的 基 本 战 略染 色 体 DNA的 切 断 超 声 波 处 理 ： 片 段 长 度 均 一 ， 大 小 可 控 ， 平 头 末 端 全 酶 切 ： 片 段 长 度 不 均 一 ， 粘 性 末 端 便 于 连 接 ， 但 有 可 能 使 目 的 基 因 断 开 ， 大 小 不 可 控 部 分 酶 切 ： 片 段 长 度 可 控 ， 含 有 粘 性 末 端 ， 目 的 基 因 完 整 与 载 体 连 接 如 果 转 化 子 采 用 菌 落 原 位 杂 交 法 或 限 制 性 酶 切 图 谱 法 筛 选 ， 则 选 择 多 拷 贝 克 隆 载体 ； 如 果 转 化 子 采 用 基 因 产 物 功 能 检 测 法 筛 选 ， 则 选 择 表 达 型 载 体如 果 转 化 子 采 用 菌 落 原 位 杂 交 法 或 限 制 性 酶 切 图 谱 法 筛 选 ， 则 选 择 大 肠 杆 菌 作 为转 化 受 体 细 胞 受 体 细 胞 ； 如 果 转 化 子 采 用 基 因 产 物 功 能 检 测 法 筛 选 ， 则 选 择 能 使 目 的 基 因 表 达的 受 体 细 胞筛 选 含 有 目 的 基 因 的 目 的 重 组 子 菌 落 原 位 杂 交 法 、 基 因 产 物 功 能 检 测 法 （ 筛 选 模 型 的 建 立 ） 鸟 枪 法 操 作 的 改 进使 用 这 一 改 进 方 法 的 前 提 条 件 是 ： 目 的 基 因 的 酶 切 图 谱 已 知 。如 果 已 知 目 的 基 因 两 端 的 酶 切 口 ， 可 用 该 酶 处 理 染 色 体 DNA，然 后 与 载 体 拼 接 ， 这 样 可 以 保 证 目 的 基 因 的 完 整 性 ， 从 而 提 高重 组 子 中 目 的 重 组 子 的 出 现 频 率 使 用 特 征 性 限 制 性 内 切 酶 切 开 染 色 体 DNA 鸟 枪 法 操 作 的 改 进例 如 ， 已 知 某 目 的 基 因 位 于 1.8 kb的 SalI片 段 中 ， 将 染 色 体 DNA用 SalI切 开 ， 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 ， 用 刀 片 切 下 相 当 于1.6 - 2.0 kb大 小 区 域 内 的 凝 胶 块 ， 从 此凝 胶 块 中 回 收 DNA片 段 ， 然 后 与 载 体 进行 拼 接在 连 接 前 将 DNA片 段 进 行 分 级 分 离 2.0 kb1.6 kb 1.8 kb 鸟 枪 法 操 作 的 改 进冻 融 法滤 纸 法吸 附 法低 融 点 凝 胶 法溶 解 法凝 胶 DNA片 段 回 收 技 术 鸟 枪 法 克 隆 目 的 基 因 的 局 限 性工 作 量 较 大 ， 需 要 了 解 目 的 基 因 的 背 景 知 识不 能 获 得 的 最 小 长 度 的 目 的 基 因不 能 除 去 真 核 生 物 目 的 基 因 的 内 含 子 结 构 B cDNA法5 目 的 基 因 的 克 隆 与 基 因 文 库 的 构 建cDNA法 克 隆 目 的 基 因 的 基 本 战 略cDNA法 分 离 目 的 基 因 的 基 本 程 序cDNA法 法 克 隆 目 的 基 因 的 局 限 性 cDNA法 克 隆 目 的 基 因 的 基 本 战 略mDNAcDNA第 一 链 的 合 成 5 ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35 ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55 ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第 一 链引 物 退 火逆 转 录 酶 dNTPs cDNA第 二 链 的 合 成 煮 沸NaOH自 身 引 导 法 ： 获 得 的 双 链 cDNA 5 端 会 有 几 对 碱 基 缺失 AAAAAAAAAAAAAA5 ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3 Klenow dNTPsS1 cDNA第 二 链 的 合 成 DNApol dNTPsRNaesH置 换 合 成 法 ： 获 得 的 双 链 cDNA 5 端 也 会 有 几 对 碱 基 缺失 5 ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAA p 55 S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33 T4-DNA ligase cDNA第 二 链 的 合 成 dCTPTdT引 导 合 成 法 ： 获 得 的 双 链 cDNA 能 保 留 完 整 的 5 端 序 列5 ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5 ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 5 3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退 火Klenow dNTPs cDNA法 克 隆 目 的 基 因 的 基 本 战 略双 链 cDNA的 克 隆 双 链 平 头 的 cDNA通 常 可 以 使 用 下 列 三 种 方 法 克 隆 入 载 体 中 ： 平 头 末 端 直 接 与 载 体 连 接 ， 但 插 入 的 片 段 无 法 回 收 平 头 两 端 分 别 接 同 聚 物 尾 ， 最 好 是 AT同 聚 物 尾 ， 这 样 重 组分 子 可 通 过 加 热 局 部 变 性 和 S1核 酸 酶 处 理 回 收 插 入 片 段加 装 人 工 接 头 引 入 酶 切 口 ， 以 便 插 入 片 段 回 收 cDNA法 分 离 目 的 基 因 的 基 本 程 序完 备 分 离 程 序 提 取 细 胞 总 mRNA， 合 成 总 cDNA， 将 之 全 部 克 隆 ， 然 后借 助 于 合 适 的 筛 选 手 段 找 到 目 的 重 组 子 筛 选 时 ， 若 使 用 的 是 多 拷 贝 载 体 ， 则 采 用 菌 落 原 位 杂 交 法筛 选 ； 若 使 用 的 是 表 达 型 载 体 ， 则 采 用 菌 落 免 疫 杂 交 法 筛 选 完 备 分 离 程 序 适 用 于 mRNA分 子 数 少 的 目 的 基 因 的 克 隆 ，如 人 胰 岛 素 基 因 、 干 扰 素 基 因 、 凝 血 因 子 VIII基 因 等 cDNA法 分 离 目 的 基 因 的 基 本 程 序特 异 分 离 程 序 提 取 细 胞 总 mRNA， 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 ， 回 收 目 标mRNA， 由 此 合 成 双 链 cDNA， 然 后 进 行 克 隆 特 异 分 离 程 序 较 适 用 于 mRNA丰 度 极 高 的 目 的 基 因 克 隆如 血 红 蛋 白 基 因 等 cDNA法 分 离 目 的 基 因 的 基 本 程 序差 异 分 离 程 序 利 用 两 组 细 胞 mRNA种 类 的 差 异 ， 分 离 克 隆 差 异 mRNA所 对应 的 cDNA， 因 而 这 种 程 序 较 适 用 于 分 离 克 隆 新 基 因 例 如 ： 正 常 的 大 鼠 FR3T3成 纤 维 细 胞 中 ， 有 些 新 基 因 是 不 能自 发 表 达 的 ， 需 在 多 瘤 病 毒 感 染 之 后 方 可 转 录 。 任 务 是 要 分 离 克隆 这 些 新 基 因 ， 进 而 研 究 其 生 物 学 功 能 差 异 分 离 程 序 多 瘤 病 毒 感 染 的 FR3T3细 胞正 常 的 FR3T3细 胞总 mRNA 总 mRNA cDNA双 链 cDNA 单 链 cDNA 提 取 mRNA合 成 cDNA合 成 第 二 链克 隆提 取 mRNA共 价 交 联 上 柱原 位 杂 交病 毒 诱 导 表 达 的 基 因cDNA克 隆 cDNA法 克 隆 目 的 基 因 的 局 限 性并 非 所 有 的 mRNA分 子 都 具 有 polyA结 构 细 菌 或 原 核 生 物 的 mRNA半 衰 期 很 短mRNA在 细 胞 中 含 量 少 ， 对 酶 和 碱 极 为 敏 感 ，分 离 纯 化 困 难仅 限 于 克 隆 蛋 白 质 编 码 基 因 C PCR法5 目 的 基 因 的 克 隆 与 基 因 文 库 的 构 建 PCR（ Polymerase Chain Reaction） 法 ， 又 称 为 聚 合 酶链 反 应 或 PCR扩 增 技 术 ， 是 一 种 高 效 快 速 的 体 外 DNA聚 合 程 序 使 用 PCR法 克 隆 目 的 基 因 的 前 提 条 件 是 ： 已 知 待 扩 增 目 的基 因 或 DNA片 段 两 侧 的 序 列 ， 根 据 该 序 列 化 学 合 成 聚 合 反 应 必 需 的 双 引 物 PCR法 定 向 扩 增 目 的 基 因 的 基 本 原 理 5 5目 的 基 因 5变 性 加 热5 5引 物退 火5 5底 物聚 合5 55 5 加 热变 性5 55 55 555 5 555 5 555 55 55 5 5 55 5 退 火 引 物 底 物聚 合 加 热变 性 引 物退 火 底 物聚 合12 3 由 Taq DNA聚 合 酶 扩 增 的 PCR产 物 中 ， 其 3 末 端 总 是 会 带有 一 个 非 模 板 依 赖 型 的 突 出 碱 基 ， 而 且 这 个 碱 基 几 乎 总 是 A， 因为 Taq DNA聚 合 酶 对 dATP具 有 优 先 聚 合 活 性 。 由 于 该 突 出 碱 基的 存 在 ， 克 隆 时 即 可 以 采 取 TdT末 端 加 同 聚 尾 的 方 法 与 载 体 拼 接， 也 可 以 使 用 专 门 的 T载 体 克 隆 PCR克 隆 目 的 基 因 的 基 本 程 序5 5AAT T5 5 PCR扩 增 产 物T 载 体T7 lacZ MCS ori Ap r D 化 学 合 成 法5 目 的 基 因 的 克 隆 与 基 因 文 库 的 构 建化 学 合 成 法 的 基 本 战 略化 学 合 成 的 单 元 操 作DNA化 学 合 成 的 用 途 化 学 合 成 法 的 基 本 战 略全 基 因 合 成化 学 合 成 目 的 基 因 的 前 提 条 件 是 基 因 的 DNA序 列 已 知 ， 有 三 种 战 略 ：小 片 段 粘 接 法 ： 混 合 退 火根 据 目 的 基 因 全 序 列 ， 分 别 合 成 12-15碱 基 长 的 单 链 DNA小 片 段T4-DNA连 接 酶 连 接 克 隆 入 合 适 的 载 体 化 学 合 成 法 的 基 本 战 略全 基 因 合 成补 钉 延 长 法 ： 混 合 退 火根 据 目 的 基 因 两 条 互 补 链 全 序 列 ， 分 别 合 成 12-15碱 基 长 的 单 链DNA小 片 段 以 及 20-30碱 基 长 的 单 链 DNA中 片 段T4-DNA连 接 酶 连 接 克 隆 入 合 适 的 载 体 Klenow酶 聚 合 化 学 合 成 法 的 基 本 战 略全 基 因 合 成大 片 段 酶 促 法 ： 混 合 退 火根 据 目 的 基 因 的 全 序 列 ， 分 别 合 成 40-50碱 基 长 的 单 链 DNA片 段T4-DNA连 接 酶 连 接 克 隆 入 合 适 的 载 体 Klenow酶 聚 合 化 学 合 成 法 的 基 本 战 略全 基 因 合 成 上 述 三 种 方 法 各 有 利 弊 ： 化 学 合 成 DNA的 单 片 段 愈 短 ， 收 率 就愈 高 ， 但 由 于 化 学 合 成 的 份 额 较 大 ， 成 本 较 高 ； 在 大 片 段 酶 促 法 合成 目 的 基 因 时 ， 虽 然 化 学 合 成 的 份 额 相 对 较 小 ， 成 本 较 低 ， 但 大 片段 化 学 合 成 的 收 率 极 低 ， 例 如 ， 每 聚 合 一 个 单 体 的 产 物 收 率 为 95%则 合 成 50个 碱 基 长 的 DNA单 链 大 片 段 的 总 收 率 只 有 7.7% 化 学 合 成 法 的 基 本 战 略探 针 等 寡 聚 核 苷 酸 合 成 在 某 些 情 况 下 ， 往 往 只 知 道 目 的 基 因 编 码 产 物 的 部 分 氨 基 酸序 列 ， 而 基 因 序 列 未 知 ， 此 时 需 要 从 已 知 的 氨 基 酸 序 列 推 测 为 其编 码 的 DNA序 列 ， 然 后 合 成 探 针 ， 筛 选 由 鸟 枪 法 或 cDNA法 得 到的 重 组 子 ， 最 终 获 得 含 有 目 的 基 因 的 目 的 重 组 子 由 于 大 多 数 氨 基 酸 拥 有 简 并 密 码 子 ， 故 在 探 针 序 列 的 设 计 时必 须 考 虑 下 列 问 题 ：生 物 体 对 简 并 密 码 子 的 偏 爱 性 ， 合 成 系 列 探 针探 针 应 具 有 足 够 的 长 度 ， 通 常 在 17-20个 核 苷 酸 之 间 探 针 内 部 不 应 出 现 可 能 的 互 补 区 域 化 学 合 成 法 的 基 本 战 略探 针 等 寡 聚 核 苷 酸 合 成某 段 连 续 的 氨 基 酸 序 列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile所 有 可 能 的 DNA序 列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC设 计 的 简 并 探 针 序 列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGA A G 此 外 还 可 以 参 考 各 种 生 物 体 的 EST数 据 库 进 行 倾 向 性 简 并 序 列 设 计expressed sequence tag 化 学 合 成 的 单 元 操 作 化 学 合 成 DNA的 实 质 是 按 照 序 列 要 求 将 脱 氧 核 苷 酸 单 体 一 个个 接 上 去 ， 每 接 一 个 单 体 就 是 一 个 循 环 反 应 ， 包 括 ： 基 团 保 护 、分 离 、 缩 合 、 分 离 、 去 保 护 五 大 操 作 单 元 。 从 反 应 机 理 上 来 讲 ， DNA化 学 合 成 有 磷 酸 二 酯 法 、 磷 酸 三 酯法 、 亚 磷 酸 液 三 酯 法 ； 具 体 操 作 过 程 又 有 液 相 合 成 和 固 相 合 成 两种 形 式 。 前 者 操 作 繁 琐 ， 基 本 上 已 淘 汰 ； 后 者 反 应 中 间 物 的 分 离程 序 简 便 ， DNA合 成 仪 就 是 根 据 固 相 亚 磷 酸 液 三 酯 法 原 理 设 计 的 化 学 合 成 的 单 元 操 作 O HGH H H HO CH2ODMT POMe N CHMe MeCHMeMe O HGH H HHOCH2ODMT POMe N CHMeMeCHMeMe HDMT： 二 甲 氧 基 三 苯 甲 基 激 活缩 合氧 化脱 取 代 基 玻 璃 珠连 接 臂 DNA化 学 合 成 的 用 途合 成 天 然 基 因修 饰 改 造 基 因 设 计 新 型 基 因 制 备 探 针 、 引 物 、 接 头 如 生 长 激 素 释 放 抑 制 素 基 因 、 脑 啡 肽 基 因 、 胰 岛 素 基 因 、 干 扰 素如 组 织 型 纤 溶 酶 原 激 活 剂 基 因 、 尿 激 酶 原 基 因 等 基 因 等 E 基 因 文 库 的 构 建5 目 的 基 因 的 克 隆 与 基 因 文 库 的 构 建基 因 文 库 的 基 本 概 念基 因 文 库 的 构 建 程 序基 因 组 文 库 重 组 克 隆 的 排 序 基 因 文 库 的 基 本 概 念基 因 库 与 基 因 文 库基 因 库 （ gene pool） 特 定 生 物 体 全 基 因 组 的 集 合 （ 天 然 存 在 ） 基 因 文 库 （ gene library or gene bank） 从 特 定 生 物 个 体 中 分 离 的 全 部 基 因 ， 这 些 基 因 以 克 隆 的 形 式基 因 组 文 库 （ 含 有 全 部 基 因 ） 存 在 （ 人 工 构 建 ） 。 根 据 构 建 方 法 的 不 同 ， 基 因 文 库 分 为 ： cDNA文 库 （ 含 有 全 部 蛋 白 质 编 码 的 结 构 基 因 ） 基 因 文 库 的 基 本 概 念基 因 文 库 构 建 的 基 本 战 略用 鸟 枪 法 构 建 基 因 组 文 库 ， 材 料 来 自 染 色 体 DNA用 cDNA法 构 建 cDNA文 库 ， 材 料 来 自 mRNA在 高 度 分 化 的 生 物 体 中 ， 不 同 组 织 和 细 胞 在 不 同 时 段 的 mRNA种 类 不 同 （ 即 基 因 的 表 达 谱 不 同 ） ， 因 此 同 种 生 物 体 的 cDNA文 库一 般 还 有 组 织 细 胞 的 界 定 ， 如 肝 组 织 cDNA文 库 或 胚 胎 组 织 cDNA文 库 等 。 很 显 然 ， cDNA文 库 的 信 息 量 远 小 于 基 因 组 文 库 基 因 文 库 的 基 本 概 念基 因 文 库 的 完 备 性基 因 文 库 的 完 备 性 是 指 ： 在 构 建 的 基 因 文 库 中 任 一 基 因 存 在 的 概率 ， 它 与 基 因 文 库 最 低 所 含 克 隆 数 N之 间 的 关 系 可 用 下 式 表 示 ：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其 中 ： P = 任 一 基 因 被 克 隆 （ 或 存 在 于 基 因 文 库 中 ） 的 概 率 f = 克 隆 片 段 的 平 均 大 小 / 生 物 基 因 组 的 大 小 例 如 ， 人 的 单 倍 体 DNA总 长 为 2.9 x 10 9 bp， 基 因 文 库 中 克 隆 片 段的 平 均 大 小 为 15 kb， 则 构 建 一 个 完 备 性 为 0.9的 基 因 文 库 至 少 需 要45万 个 克 隆 ； 而 当 完 备 性 提 高 到 0.9999时 ， 基 因 文 库 至 少 需 要 180万 个 克 隆 基 因 文 库 的 基 本 概 念基 因 文 库 的 质 量 标 准除 了 尽 可 能 高 的 完 备 性 外 ， 一 个 理 想 的 基 因 文 库 应 具 备 下 列 条 件 ：重 组 克 隆 的 总 数 不 宜 过 大 以 减 轻 筛 选 工 作 的 压 力载 体 的 装 载 量 最 好 大 于 基 因 的 长 度 避 免 基 因 被 分 隔 克 隆克 隆 与 克 隆 之 间 必 须 存 在 足 够 长 度 的 重 叠 区 域 以 利 克 隆 排 序克 隆 片 段 易 于 从 载 体 分 子 上 完 整 卸 下重 组 克 隆 能 稳 定 保 存 、 扩 增 、 筛 选 基 因 文 库 的 构 建 程 序基 因 组 DNA的 制 备 为 了 最 大 限 度 地 保 证 基 因 在 克 隆 过 程 中 的 完 整 性 ， 用 于 基 因 组文 库 构 建 的 DNA在 分 离 纯 化 操 作 中 应 尽 量 避 免 过 度 的 断 裂 。 制 备 的DNA分 子 量 越 大 ， 经 切 割 处 理 后 样 品 中 含 有 不 规 则 末 端 的 DNA片 段的 比 率 就 越 低 ， 重 组 率 和 完 备 性 也 就 越 高 A AA A用 常 规 方 法 制 备 的 染 色 体DNA的 长 度 一 般 在 100 kb左 右如 果 先 将 细 胞 固 定 在 低 融 点 凝胶 中 ， 然 后 置 入 含 有 SDS、 蛋 白 酶 K、 RNase的 缓 冲 液 中 浸 泡 ， 可 获 得 1000 kb大 小 的 DNA片 段 基 因 文 库 的 构 建 程 序基 因 组 DNA的 切 割 用 于 基 因 组 文 库 构 建 的 DNA片 段 的 切 割 一 般 采 用 超 声 波 处 理 和限 制 性 内 切 酶 部 分 酶 切 两 种 方 法 ， 其 目 的 是 ： 第 一 ， 保 证 DNA片 段 之 间 存 在 部 分 重 叠 区 第 二 ， 保 证 DNA片 段 大 小 均 一超 声 波 处 理 后 的 DNA片 段 呈 平 头 末 端 ， 需 加 装 人 工 接 头 部 分 酶 切 法 一 般 选 用 四 对 碱 基 识 别 序 列 的 限 制 性 内 切 酶 ， 如 ：Sau3AI或 MboI等 ， 这 样 DNA酶 解 片 段 的 大 小 可 控 连 接 前 ， 上 述 处 理 的 DNA片 段 必 须 根 据 载 体 的 装 载 量 进 行 分 级 分 离 ， 以 杜 绝 不 相 干 的 DNA片 段 随 机 连 为 一 体 ！ 基 因 文 库 的 构 建 程 序载 体 和 受 体 的 选 择 出 于 压 缩 重 组 克 隆 的 数 量 ， 用 于 基 因 组 文 库 构 建 的 载 体 通 常 选 装 载 量 较 大 的l-DNA或 考 斯 质 粒 ； 对 于 大 型 基 因 组 （ 如 动 植 物 和 人 类 ） 需 使 用 YAC或 BAC载 体l-DNA 由 于 绝 大 多 数 真 核 生 物 的 mRNA小 于 10 kb， 因 此 用 于 cDNA文 库 构 建 的 载 体通 常 选 质 粒 上 述 几 种 载 体 的 最 大 装 载 量 如 下 ：质 粒考 斯 质 粒 15 kb25 kb45 kb BAC 300 kbYAC 400 kb 用 于 基 因 文 库 构 建 的 受 体 则 根 据 载 体 使 用 大 肠 杆 菌 或 酵 母 菌 基 因 文 库 的 构 建 程 序从 基 因 文 库 中 筛 选 目 的 基 因 大 型 基 因 组 文 库 一 般 由 数 十 万 甚 至 上 百 万 个 重 组 克 隆 组 成 。 除了 一 些 具 有 特 殊 功 能 的 蛋 白 质 编 码 基 因 （ 如 抗 药 性 基 因 、 结 合 蛋 白编 码 基 因 等 ） 可 以 采 用 特 殊 的 正 选 择 筛 选 程 序 （ 如 抗 药 性 筛 选 法 、酵 母 双 杂 交 技 术 等 ） 直 接 筛 选 外 ， 一 般 的 基 因 组 文 库 筛 选 均 需 多 轮操 作 步 骤 基 因 文 库 的 构 建 程 序从 基 因 文 库 中 筛 选 目 的 基 因密 集 铺 板 （ 1-10万 ）杂交 挖取 铺板 铺板目 的 重 组 克 隆 基 因 文 库 的 构 建 程 序基 因 文 库 构 建 的 技 术 性 问 题在 基 因 组 文 库 的 构 建 过 程 中 ， 最 应 引 起 重 视 的 问 题 是 ：严 禁 外 源 DNA片 段 之 间 的 连 接 ！ ！ ！为 了 避 免 上 述 情 况 的 发 生 ， 可 采 取 下 列 措 施 的 组 合 ： 将 待 连 接 的 DNA片 段 根 据 载 体 的 装 载 量 分 级 分 离用 碱 性 磷 酸 单 酯 酶 除 去 DNA片 段 的 末 端 磷 酸 基 团 用 TdT酶 在 DNA片 段 的 末 端 上 增 补 同 聚 尾 末 端 基 因 组 文 库 重 组 克 隆 的 排 序 大 型 基 因 文 库 （ 包 括 人 的 基 因 文 库 ） 的 构 建 在 技 术 上 并 不十 分 困 难 ， 如 果 一 个 YAC基 因 文 库 的 插 入 片 段 总 和 为 整 个 基 因组 的 十 倍 以 上 时 ， 一 般 就 能 从 基 因 文 库 中 调 出 任 何 一 段 DNA序列 。 然 而 基 因 文 库 的 克 隆 都 是 随 机 序 列 ， 必 须 将 所 有 的 克 隆 排列 成 一 个 像 天 然 染 色 体 DNA上 所 表 现 出 的 信 息 顺 序 。 这 项 工 作的 工 作 量 可 能 远 大 于 基 因 组 文 库 的 构 建 ， 属 于 基 因 文 库 的 后 期制 作 基 因 组 文 库 重 组 克 隆 的 排 序 将 单 一 的 YAC克 隆 插 入 DNA片 段 用 限 制 性 内 切 酶 分 布 均 匀地 水 解 成 若 干 片 段 ， 末 端 标 记 同 位 素 然 后 再 用 Sau3AI或 MboI将 末 端 标 记 的 DNA片 段 降 解 成 碎片 ， 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ， 每 10个 YAC克 隆 走 在 同 一 块 板 上 ，形 成 10个 克 隆 的 特 征 性 DNA指 纹 图 谱 电 脑 分 析 指 纹 图 谱 ， 如 发 现 任 何 两 个 克 隆 DNA的 指 纹 图 谱有 部 分 相 同 的 ， 则 其 两 个 YAC片 段 就 有 互 相 重 叠 的 可 能 性 ， 于是 这 两 个 YAC克 隆 的 DNA片 段 克 隆 在 染 色 体 上 是 排 列 一 起 的 酶 切 片 段 末 端 标 记 法 酶 切 片 段 末 端 标 记 法H H H HS S SS S S S SS S S SSS S S S S S 单 一 克 隆 指 纹 图 谱十 克 隆 指 纹 图 谱 载 体 DNA克 隆 DNA 基 因 组 文 库 重 组 克 隆 的 排 序 将 若 干 YAC克 隆 固 定 在 薄 膜 上 ， 并 复 制 二 十 份 薄 膜 ； 合 成20种 不 同 序 列 的 短 探 针 ， 其 序 列 是 随 机 的 用 20种 探 针 随 机 定 位 杂 交 （ 一 对 一 ） 20份 YAC克 隆 薄 膜 如 果 某 两 个 克 隆 同 时 对 同 一 种 探 针 呈 现 杂 交 阳 性 反 应 ， 则这 两 个 克 隆 有 可 能 是 相 互 重 叠 的 。 若 将 杂 交 阳 性 结 果 记 为 “ 1”， 而 阴 性 结 果 记 为 “ 0” ， 可 清 晰 地 列 成 一 张 表 ， 最 终 排 出 上 述YAC克 隆 的 排 列 顺 序 随 机 探 针 联 合 杂 交 法 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1011 12 13 14 15 16 17 18 19 20A B CD E FG 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 DABCEFG 11 11 1 1 11 11 11 1 11 11 1 11 111 11 1 1 11 1 01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18DABCEFG 11 111 111 1 1 11 1 11111 11 11 11 1 11 11 1F C A D G E B 基 因 组 文 库 重 组 克 隆 的 排 序 从 基 因 文 库 中 任 取 一 个 克 隆 作 为 染 色 体 走 读 的 起 点 ， 将 之两 端 序 列 分 别 亚 克 隆 ， 亚 克 隆 片 段 在 0.5 - 2.0 kb范 围 内 分 别 以 上 述 亚 克 隆 DNA片 段 为 探 针 ， 杂 交 同 一 基 因 文 库 ，杂 交 阳 性 克 隆 中 的 插 入 DNA片 段 必 定 与 起 点 克 隆 所 含 的 DNA片段 连 锁 在 一 起 然 后 再 以 阳 性 克 隆 片 段 的 两 端 序 列 为 探 针 ， 进 行 第 二 步 走读 ， 直 至 线 型 染 色 体 DNA的 端 点 染 色 体 走 读 法 （ chromosome walking） 染 色 体 走 读 法 （ chromosome walking） 走 读 的 起 点 克 隆 片 段亚 克 隆 旁 测 序 列 探 针 标 记第 一 轮 杂 交阳 性 克 隆 阳 性 克 隆第 二 轮 杂 交 第 二 轮 杂 交 染 色 体 走 读 法 （ chromosome walking）走 读 的 起 点 克 隆 片 段