共聚焦操作流程(总7页)

共聚焦操作流程(总7页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company Onel-CAL -本页仅作为文档封面，使用请直接删除二、实验环境观察仪器是否有外表明显损坏，如需开启空调，一般控制在25 度。拉上窗帘，避免标本荧光淬灭及杂光干扰。三、四、开机查看实验记录，确认是否马上能开机（注意：汞灯必须在关机 20 分钟以后 才能再开启，一般为 30分钟）。确认后可执行以下操作：（务必先开电源，后 开钥匙！）。1、2、打开PSU （主电源）3、4、 打开激光器（只开启需使用的激光器）1）2） 、 氩 离 子 多 线 激 光 器 （ 458/488/515 ， 应 用 染 料 ： GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP 等）。3）4）MCPSU半导体综合激光器（LD405应用染料：DAPI/Hoechst/BFP等；LD635应 用染料：CY5/ Alexa647 等）。5）6） LD559 激光器（注意：电源打开后不要马上开钥匙，等待 TEMP 指示灯不闪烁 后，再开钥匙，红色指示灯不闪烁后，可正常使用）。6、打开显微镜电源 IX2-UCB 7、8、打开荧光汞灯（注意：开启后，“15 分钟内勿关”）9、User ID: Administrator10、打开电脑主机、显示器，登陆windows xp系统卜卅，比III-i心 ，双击1-1User ID: Administrator，打开FV10-ASW应用软件mH 0680。五、六、取图1、2、DIC （微分干涉差）明场立体图（1）、插入起偏镜、检偏镜（DIC滑块）。(2)、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮打开卤素灯快门,使用TD滑块（软件 TD lamp 项）控制卤素灯的光强，倒置显微镜下观察标本，进行标本 聚焦。1）、使用手控面板选择合适倍率的物镜下观察（注意若用60X油镜时，检偏镜部位要推上弯杆），并检查各物镜对应的DIC元件。2）、可在检偏镜部位用旋钮进行对比度的调节。 （需要时可使用，一般勿调）(3)、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮 *1,关闭卤素灯快门。打开 DIC 通道，执行取图操作。1) 、调节扫描速度至最快(2.0us/pixel)，size为512by，点击席叭询，进行快速预扫，寻找焦平面IEXZcffliri步骤：适当调节HV、gain及offset参数- - (般为能看到图像即2) 、选择AutoHV,放慢扫描速度(扫描速度越慢，扫描时间越长，图像信噪比好，但耗时，易淬灭，一般为10-12.5 us/pixel), size为640by,点越多降噪越好，但扫描时间也越长，一般在HV较高时使用)O4） 、点击“进行取图，并保存。（注意：原始图像一定要保存 为 oib 格式）Filrei Mode5）、去掉,将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel，size为512by），为下一个标本做好准 备。2、荧光图（1）、拉出检偏镜（DIC滑块），打开汞灯机械快门（shutter）。（2） 、FV10-ASW软件中点击汞灯观察按钮，打开汞灯快门，倒置显 微镜下观察标本，进行标本聚焦（找视野）。使用手控面板，根据标本荧光探针选择合适的荧光虑色片及选择合适 的物镜下观察，WU紫外激发/蓝色荧光（eg : DAPI），WB蓝色激发/绿色荧光（eg ： FITC、EGFP）, WG 绿色激发/红色荧光（eg:Texas Red, Rhodamine， DsRed）（般要求标本在所用的各种荧光探针匹配的荧光虑色片下均能观察 到所需视野，eg : DAPI + FITC+ Texas Red多色荧光探针，需在WU,WB,WG下 均能观察到所需视野，DAPI 般荧光较强，FITC或Texas Red下易找些）。（注意：更换不同倍数物镜时应适当降低物镜再更换，以免损坏物镜；若用 60x油镜时，要插入检偏镜并推上弯杆。）（3）、FV10-ASW软件中点击汞光观察按钮 ，关闭汞灯快门。执行取图 操作。1）、点击 ，添加荧光染料。（最多为二色，多于二色需分别扫 描）若标本使用的荧光染料不是染料库里的染料，可选激发光及发射光谱较接 近的染料代替，这时可适当调整2）、调节扫描速度至最快（2.0us/pixel）, size为512by,点击席叭诃，进行快速预扫，寻找焦平面2531 0V賈 也步骤：适当调节HV、gain及offset参数 - （般为能看到各通道uy寻找焦平面，如需放大光学倍数，可适当调节图像即可），快速调节P Sequel rtial3）、选上 Li” m （双染以上一定要选上，可避免激发光串色），选择AutoHV （AutoHV功能为自动匹配扫描速度与HV值，不选易造成 图像出现强度过饱和状态），放慢扫描速度（一般为10-12.5 us/pixel）, size为640by,点击xvK-ruMi进行再预扫，调节HV、gain及offset参数至图象清晰尖锐即可。点击停止预扫描Fiber Mode4）、若背景噪音仍过多也可选上Zimm来降低随机噪音干扰（次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，一般在HV较高时使用）。5）、点击5也进行取图，保存及相关图像处理。（注意：原始图像- 定要保存为oib格式）Fiber Mode6） 、去掉，将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度 至最快，即最左端，2.0us/pixel，size为512by），为下一个标本做好取图准 备。四、刻录数据图像保存后，退出 FV10-ASW 软件，刻录数据（注意：必须用新的光盘，严禁 使用U盘、移到硬盘等）。五、关机务必先关钥匙后关电源！2、关闭荧光汞灯（注意：开启后，“15 分钟内勿关”）3、4、 关闭激光器1）、关闭LD559激光器2）、关闭 MCPSU 半导体综合激光器3）、氩离子多线激光器（注意：先关钥匙，千万别马上关闭电源，要等风 扇停止转动后再关闭电源）3、使用擦镜纸沾擦显微镜物镜（注意：一般物镜清洗液为乙醇，擦镜纸为普通擦镜纸；油镜清洗液为30%乙醇70%乙醚，擦镜纸为Olympus公司的擦镜纸。），并把物镜降低到最低点。4、关闭 shutter5、关闭显微镜电源 IX2-UCB6、等待仪器冷却后（尤其光源部分：汞灯、卤素灯、激光），盖上防尘罩注意：激光散热风扇较热，不宜盖住）