固相萃取高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷的含量

usHIzHEN MEDIcINE AND MATERIA MEDIcA REsEARcH 2007vo L.18No.1 时珍国医国药2007年第18卷第l期固相萃取一高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷的含量杨克迪，李宏，龙云飞，郑智慧,万顺刚(广西大学化学化工学院，广西南宁530004摘要:目的采用固相萃取.高效液相色谱方法分析黄芪中黄芪甲苷的含量。方法 采用c。固相萃取小柱纯化黄芪提取物中的黄芪甲苷，反相高效液相色谱一紫外 检测方法测定黄芪中黄芪甲苷含量。色谱柱为zorbax sB-C。柱(彬.6mmx150mm,5汕m,以乙腊.水(32:68为流动相，流速1.O mL/min，柱温30C,检测 波长200nm。结果黄芪甲苷进样量在1.408-7.04灿g范围内与峰面积呈良好线性 关系,r=0.9999。平均回收率为101.5%。结论该方法操作简便，重现性好，可作为黄芪 药材或其它含黄芪制剂中黄芪甲苷含量的分析方法。关键词:固相萃取;高效液相色谱;黄芪甲苷中图分类号:R284.2文献标识码:A文章编号:1008旬805(200701抑04lmlDetemi 勰 tion of AstragalosideWin Radix As 加酗髓 by SPE HPLCYANG Kedi,LI Hong,LONG Yun.fbi,ZHENG Zhihui,WAN Shungang(JscAooZ矿吼em趣哪。凡d醍em渤Z西柳聘Peri噌,G“ 口 ,移i踟泐邙妙,Nq肌 i 昭 530004，劬 i 凡口 Abstract:Ob.iective To establish SPE.HPLC method for the dete 彻 ination of as f 嘴 aloside IV in Radix As m 鼬执 Methods The astragaloside IV in sample was purified with Cl R solid phase column and its content was determined wi 出 HPLC.UV metho(1.Theastragaloside IV was sep 啪白 ted 0n a zorba【SB-C18column(p4.6mm x 150mm,5 斗 mwith acetonitrile一water(32:68,v/v as mobile phase,and the detective wavelen#尊 h was Yet at 200nm.1tesults The linear range was 1.408 一-7.04g(r=O.9999. 11he avemgerecovery of astmgaloside IV was 101,5%.Conclusi 彻 The method is simpleo accurate and can be used forthe quaJ. ity contr01of Radix As nZgn 屁 and its pICparation.1【ey wOrds:SoIid.phase extraction:HPLC:Astragaloside IV黄芪为常用中草药,具有较高的药用价值，其主要成分黄芪甲苷具有镇痛、镇静 和降血压等药理活性“o J。2005年版中国药典规定采用HPLcELSE方法测 定黄芪甲苷含量p,鉴于紫外检测器的普及性,目前相当部分实验室仍采用HPLc UV法分析黄芪及相关制剂中黄芪甲苷含量M“1。由于黄芪甲苷的特征吸收波长 在200nm左右,样品中杂质对黄芪甲苷定量分析干扰较大。目前一般采用D101大 孔吸附树脂处理样品，样品中仍含有较多的杂质，黄芪甲苷与其它杂质难以达到基线 分离，影响分析准确度，另一方面也不利于色谱柱的保护。本文采用固相萃取方法纯 化样品中黄苠甲苷，可明显去除样品中杂质，并以此测定了黄芪药材中黄芪甲苷含 量。1仪器与材料1.1仪器A西1enll 100高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（美国Agilent公 司;c。8固相萃取柱（美国Bestown公司;Labomta 4000旋转蒸发器（德国Heidolph公 司;BSl24S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司;KQ.500DB超声波清洗 机（昆山超声仪器厂。1.2药材与试剂黄芪购于南宁市一心药业公司，经鉴定均为药典正品;黄芪甲苷 对照品购于中国药品与生物制品检定所（批号0781.200311;乙腊为色谱纯，其它试剂 为分析纯,双蒸水自制。2方法2.1对照品溶液的配制精密称取17.6mg黄芪甲苷对照品置于25ml容量瓶中，用 甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用。2.2黄芪甲苷供试品溶液的制备取黄芪药材，粉碎。精密称取4g粉末，用20ml 甲醇于索氏提取器中浸泡过夜，加甲醇至60 ml,于水浴中80C下回流提取4h。提取 液挥干甲醇,残渣用正丁醇饱和的水10ml超声溶解，溶液用水饱和的正丁醇萃取4收稿日期：2006蜘-25;修订日期:200611-20基金项目:广西教育厅资助项目项目批准号:桂教科研（200420.作者简介:杨克 迪（1966 一，男（汉族，广西兴安人，现任广西大学化学化工学院副教授，博士学位，主要 从事天然产物有效成分分离与应用研究.次,40mL/次。合并正丁醇液，用1%Na0H溶 液洗涤3次,40mL/次,然后用正丁醇饱和水洗至中性,回收正丁醇,残渣用5ml水溶解, 备用。c。固相萃取柱依次用5rnl甲醇和5ml水预处理，取黄芪甲苷水溶液过固相 萃取柱，先用3ml双蒸水洗涤,然后用20%甲醇溶液5ml洗涤，弃去洗涤液。用60% 甲醇20ml洗脱，收集洗脱液。洗脱液挥干溶剂,用甲醇定容至5ml作为供试品溶 液。2.3色谱条件zorbax sBc18色谱柱（4.6mmx150mm,5斗m,流动相为乙腊一水 （32:68, 口,流速1.0mL/min,柱温为30C,检测波长200nm。样品谱图见图l,对照品 谱图见图2。2.4样品含量测定2.4.1线性范圉考察用微量进样器分别取2,4,6,8,10 一黄芪甲苷对照品溶液进 样。以黄芪甲苛对照品峰面积为纵坐标y,黄芪甲苷对照品进样量为横坐标戈，进行 线性回归,得回归方程：y=72.2885 戈4.9025（n=5,r=0.9999,线性范围为 1.408 7.04pg。2.4.2黄芪甲苷含量测定分别测定了批号为20050316, 2005l 125两批黄苠药材 中黄芪甲苷的含量。结果见表l。mi n图l黄芪甲苷供试晶液褶色谱图-41 -万方数据蠹轴磊琵菲霭喜萎囊囊年第j辣诺麟j谚IL癸【1茎旺A瞳矗丛:量:悼一心博 坫型蓥膏莨茎i袖肾订誉;席斥萎警e社铂鐾Vaa茎，了 i-t坚博?i蕊剐番蚕掣谨潮谱国墨陛鋈翼朝堑香錾熏篷翼一熬i霎羹擘?11 1 ；一藿誉篓篓耄妻jls ?ii；重羹；.Iij 的囊；i：11 i?f1；蠢 f ?l l?5f K?| j;iiTi ;:;! ;j;l i;囊翌产1 喜,!要。ij ;,i1 囊;l =.; -i!；卜一到嚣蠢一薹霎i2曼妻i攀煮萎i甑耋冀i 1。i 一等藿鎏囊藿il Pl璧曲蓉嚣瘟l臻嚏?i !-堇一 ij囊震蓉冀鋈耄 ；i !一妻翥一妻霉萋-. 七 仝ii耋爹至i i垂囊一 l 一薹委薹iip漭雩闻曼一 i 一薹薹?蓥专“；篁；蚕，至摹妻。髦薹i?孝耋薹.雩妻至?耋矗蠹.薹孝妻i茎薹耋！茎耄薹;茎薹薹i妻童薹?蠢l毫!垂垂雾？；孝=霉羹嚣if耋主.萋萋圣.蓦墓蠹鐾。手耋茎!薹季墓。耋爱j?专主;囊、毒叁争:;a彗，薹墓薹;摹童要i王l妻。耋茎二爹囊差.人耄委.章季董。茎孝主。耋蚕1?主蚕耋=三i喜.i耄童，蠹囊零!i型喜j塞墓jj妻蓦薹j薹妻霎!薯童万方数据固相萃取-高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷的含量作者:杨克迪，李宏，龙云飞，郑智慧，万顺刚，YANG Ke-di, LI Hong, LONGYun-fei , ZHENG Zhi-hui，WAN Shun-gang作者单位:广西大学化学化工学院，广西，南宁,530004刊名：时珍国医国药英文刊名:LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH年，卷(期:2007，18(1引用次数：2次参考文献(8条1. 张银娣.王幼林.沈建平黄芪皂苷甲镇痛、镇静作用1984(042. 张银娣.王幼林.沈键平黄芪皂苷甲的抗炎和降压作用1984(053. 国家药典委员会中华人民共和国药典(一部20054. 贺福元.刘平安.邓凯文反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中补阳还五汤中 黄芪甲苷的含量及药动学研究期刊论文-中国药学杂志2005(215. 伍毅.郑国燊HPLC测定复聪香液中黄芪甲苷的含量期刊论文-中国中药 杂志 2005(126. 张莲珠.汲立伟.吕雪峰HPLC测定克尼胶囊中黄芪甲苷的含量期刊论文- 中成药2005(087. 戴军平.刘秀霞.吴沉HPLC法测定黄芪口服液中黄芪甲苷的含量期刊论 文-西北药学杂志1998（048. 郭洪祝.刘晓峰.于侹高效液相色谱法测定胰复康胶囊中黄芪甲苷含量期 刊论文-中国中药杂志2000（10相似文献（10条1. 期刊论文任晋.黄翠玲.赵国栋.蒋可固相萃取-高效液相色谱-质谱联机在 线分析水中痕量除草剂-分析化学2001,29（8建立了饮用水中痕量除草剂的SPE-LC-MS联机测试方法，该方法仅用45 min 就可完成水样中7种除草剂（阿特拉津,西草净，西码净,杀草净，敌稗，乙草胺，甲磺隆 的分析，检测限低于欧共体所要求的饮用水标准（单种农药浓度小于0.1 pg/L.比起液 液萃取，离线SPE等其他前处理方法，在线SPE的结果的重现性和精密度方面大大 优于前者,环境水样分析时间大大减少（所需时间为液液萃取的1/60，离线SPE的 1/20，而且更安全性和可靠.我们已在华北某地的地表水和地下水中检测出阿特拉津 （1.9 pg/L 和乙草胺（1.64 pg/L.2. 期刊论文许泓.林安清.古珑.唐丹舟.何佳.XU Hong. LIN An-qing. GU Long. TANG Dan-zhou. HE Jia自动固相萃取/高效液相色谱-质谱/质谱检测动物源 性食品中残留二苯乙烯类激素的方法研究-分析测试学报2007,26（1应用自动固相 萃取仪（ASPE/高效液相色谱-质谱/质谱仪（HPLC-MS/MS同时分析动物源性食品中 残留二苯乙烯类激素-己烯雌酚（DES、己烷雌酚（HEX、双烯雌酚（DEN .样品净化 采用装配硅胶固相萃取柱的ASPE，液相色谱分离用C8柱,大气压化学模式电离，多 反应离子监测方式检测,DES-d8同位素标记物做内标定量.方法对DES、DEN的检 出限为0.05 ng.g-1在0.510 ng.g-1范围内回收率为84%108%;对HEX的检出限 为0.025 ng-g-1,在0.255 ng-g-1范围内回收率为59%87%.3. 学位论文王文娟固相萃取高效液相色谱紫外检测法测定血清中结合型胆汁 酸的方法研究与临床应用2009目的:1. 建立一种同时测定血清中9种结合型胆汁酸的固相萃取高效液相色谱紫外检测法（SPE-HPLC-UV。2.用SPE-HPLC-UV法测定正常孕妇、轻度和重度妊娠肝内胆汁淤积症（ICP患 者母血和脐血中各结合胆汁酸的浓度，建立ICP的特征胆汁酸谱用于ICP的诊断和 分度，初步探讨ICP患者母体-胎儿的胆汁酸平衡变化。方法：1. 用Chromabond C18 ec固相萃取柱萃取血清样品。2. 色谱条件:色谱柱:Waters Nova C18色谱柱（3.9x150 mm,5pm;柱温:25C;流 速:0.8 ml/min;流动相A:60pmol/L磷酸盐缓冲液（pH3.3,流动相B为纯甲醇 （A:B=34:66,v/v;检测波长197 nm;进样量201,检测时间20 min。3. 用SPE_HPLC-UV法测定16例正常孕妇、11例轻度和14例重度ICP患者母 血及脐血结合型胆汁酸。结果：1.9种结合型胆汁酸在20分钟内分离完全，各胆汁酸在浓度为5500pmo1/L范 围内线性良好,r为0.99930.9998,具有良好的相关性;最低检测限为 1.253.13pmo1/L;该方法日内变异系数在1.47%5.95%之间，日间变异系数在 1.61%7.92%之间,平均回收率在83.11%101.34%之间。2.母血:与正常孕妇组的相 比:轻度ICP组TCA、TCDCA、TDCA增高有统计学差异;重度ICP组TCA、 GCA、GLCA、TCDCA和TDCA增高且有统计学差异。与轻度ICP组相比:重度 ICP组TCA、GCA、GLCA、TDCA增高有统计学差异。脐血:与正常孕妇组相比:重度ICP组TCA、GCA和TDCA增高且有统计学差 异。与轻度ICP组相比:重度ICP组TCA、GCA、TDCA增高有统计学差异。轻度 ICP组的胆汁酸谱与正常孕妇组相比无统计学差异。结论：1. 本研究建立的血清胆汁酸的SPE-HPLC-UV分析法能实现母血与脐血中结合 型胆汁酸的测定，该方法准确、灵敏、快速、特异，适用于实验室研究和临床常规检 测。2. 本研究建立了轻度和重度ICP患者母血与脐血中的特征胆汁酸谱，该胆汁酸 谱有助于ICP的诊断和分度。3. 本研究发现正常孕妇、轻度和重度ICP母血与脐血中胆汁酸水平成正相关， 但正常孕妇脐血中总胆汁酸及TCA、GCA含量高于母血，而ICP患者母血中总胆 汁酸及TCA含量却高于脐血。这些现象可能是由于胎盘对胆汁酸的转运机制发生 改变使母体-胎儿的胆汁酸平衡发生了变化。4. 期刊论文王传现.郭德华.李波.王敏.方晓明.仲帅固相萃取富集净化-高 效液相色谱串联质谱法测定饮用水中全氟化合物-卫生研究2007,36（6目的建立固相萃取浓缩与高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS测定饮用水 中全氟辛酸（PFOA、全氟辛烷磺酸（PFOS、全氟癸酸（PFDA等全氟化合物的方法. 方法样品经C18固相萃取浓缩净化，应用负离子电喷雾电离，检测方式为多级反应离 子监测（MRM模式，高效液相色谱串联质谱法（HPLCMS/MS进行测定.结果PFOA、 PFOS、PFDA在501000 pg/ml线性范围内，线性相关系数均0.99.在8、20.0pg/g 添加水平的回收率为65%111%，相对标准偏差为3.6%14.6%（n=6，定量检出限为 8pg/g.结论该法适用于饮用水中PFOA、PFOS、PFDA等全氟化合物的测定，具有快 速、定量准确、检测灵敏等优点.5. 期刊论文王水.唐琳.郭亦然.颜钫.陈放.WANG Shui. TANG Lin. GUO Yi-ran. YAN Fang. CHEN Fang 固相萃取和高效液相色谱相结合快速测定苦瓜甙A的含量-色谱2001，19（2建立了一个快速、简单、准确的固相萃取和高效液相色谱相结合的测定苦瓜甙 A含量的方法。样品经石墨碳固相萃取管（3 mL/250 mg纯化后以高效液相色谱检 测。色谱柱为C18,流动相为V（乙腊：V（甲醇：V（50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液 =25 : 20 : 60,流速为0.8 mL/min，检测波长为208 nm。标准曲线自10 mg/L至0 1*!000 mg/L呈线形关系（r2=0.999*!2。该方法具有很好的重现性，日内或日间的相 对标准偏差和相对平均误差均小于10%。样品回收率大于90%。6. 期刊论文邰义萍.莫测辉.李彦文.包艳萍.张艳.姚圆.罗晓栋.TAI Yi- Ping. MO Ce-Hui. LI Yan-Wen. BAO Yan-Ping . ZHANG Yan. YAO Yuan. LUO Xiao- Dong 固相萃取-高效液相色谱-荧光检测土壤中哇诺酮类抗生素-分析化学2009,37（12建立了固相萃取-高效液相色谱-荧光（HPLC-FLD检测土壤中4种哇诺酮类抗生 素的分析方法.样品采用50% Mg（NO_3_2-10% NH_3 - H_2O（96 : 4,V/V超声提取， 过HLB柱富集净化，再用乙腊-0.067 mol/L H_3PO_4溶液洗脱.采用高效液相色谱- 荧光检测器,以乙腊-0.067 mol/L H_3PO_4（用三乙胺调节至pH 2.5为流动相,于激发 波长280 nm、发射波长450 nm处进行检测.土壤样品中4种哇诺酮类抗生素的加标 回收率在60.4%99.3%之间，检出限为0.581.0 g/对蔬菜基地土壤样品分析结果 表明，本方法能够满足实际样品的分析要求,4种哇诺酮类抗生素均被检出，土壤中抗 生素污染问题值得关注.7. 期刊论文黄红林.刘实.张桃芝固相萃取-高效液相色谱测定番茄中的赤霉 素GA3残留-分析科学学报2005,21（1建立了固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC 法分析番茄中赤霉素GA3残留量的方法.研究了不同填料的固相萃取小柱对番茄中 赤霉素的萃取回收率以及各自的纯化结果.该方法线性范围为0.211.05x102mg/L, 检出限为0.011mg/kg，在优化条件下，以C18小柱萃取样品的效果最好,加标回收率为88.45%95.90%,其 RSD 为 1.15%6.56%.8. 期刊论文林奇龄.欧仕益.欧云付活性炭固相萃取-高效液相色谱联用分析食品中的丙烯酰胺-食品工业科技2005,（6实验建立了活性炭固相萃取-高效液相色谱联用分析食品中丙烯酰胺的方法，考 察了方法的精密度、准确度和灵敏度,并用该方法获得了薯条的高效液相色谱图.结 果表明，该方法的变异系数为3.439%,平均回收率为91.1%,灵敏度为0.05曜/mL.9. 期刊论文李先国.阎国芳.周晓.虢新运.王岩.刘金燕固相萃取-高效液相 色谱-荧光检测法测定海水中的多环芳烃-中国海洋大学学报（自然科学版2009,39（5建立了用固相萃取-高效液相色谱-荧光检测法测定海水中多环芳烃的方法，优化 了色谱条件和萃取条件.除苊不能用荧光检测器检出外，其余15种多环芳烃的空白 加标回收率在64.5%（苯并g,h,i,茚并1,2,3-cd芘88.7%（苯并a蒽之间，相对标准偏 差（n=5为4.9%（荧蒽，苯并b荧蒽11.1%（苯并g,h,i,茚并1,2,3-cd芘,方法的检出限 在0.72（蒽14.10 ng/L（荧蒽之间，基本上达到了痕量分析的要求.利用该方法测得青 岛湾表层海水中多环芳烃的浓度在0.125（苯并k荧蒽25.996 ng/L（萘之间,但苯并 a芘未检出.10. 期刊论文林荆.林奕帆.林立峰.赵建晖.吴文凡猪肉中四环素类抗生素残 留的固相萃取-高效液相色谱荧光测定法-分析试验室2008,27（z2采用固相萃取技术富集、分离猪肉中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素4种 四环素类抗生素,采用反相高效液相色谱荧光法测定.对固相萃取柱、流动相、检测 器等条件进行了优化选择,4种物质的检出限为0.030.05pg/mL在0.020.20 mg/kg 添加水平,4种抗生素的加标回收率为60%91%之间,相对标准偏差（RSD,n=5为 2.1%5.1%.引证文献(2条1. 陈荣.黄梦娴HPLC法测定归芪补血口服液中黄芪甲苷的含量期刊论文- 中国药师2009(12. 贾刚.陈新.崔健高效液相色谱法测定肾宁颗粒中黄芪甲苷的含量期刊论 文-吉林中医药2007(9本文链接:下载时间:2010年6月11日